Name: biotinylated cell-penetrating peptides to study intracellular protein-protein interactions
Uploaded: 2017-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
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우리가 그들의 자신의 풀 다운 프로토콜에 대 한 CPPs 및 제 아리 발로의 디자인에 대 한 M. 모 랄 레 스와 제이 브라 보 감사합니다. 우리는 토니 델 레이의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad, 스페인;에 의해 지원 되었다 페더 BFU2015-70040-R, 군부 de Castilla y León, 스페인; 페더 SA026U16와 Fundación 라몬 Areces입니다. M. Jaraíz-로드리게스와 A. 곤살레스-산체스는 군부 de Castilla y León에서에서 친목과 유럽 사회 기금 받는 사람.

모든 실험 절차 살라 망 카 대학에서 실행 되었다.
1입니다. 셀
<ol>
	<li>절차를 시작 하기 전에 2 일 실험의 하루 confluent 되도록 필요한 밀도에 세포 격판덮개. 플라스 크 또는 접시에 셀 접시 그러나, 단백질 추출 접시에서 쉬울 것입니다. 그것은 준비 하 78 c m2 의 4 접시 또는 2 플라스 크 실험, 당 조건 당 150 c m2 의 확실 하 게 일관 된 결과 편리 합니다.</li>
	<li>이 연구에서는 150 cm2, 2 %1 %N2, B27 20 ng/mL EGF와 b-FGF 폴라 드 외.22에 설명 된 대로 보충 RHB A 줄기 세포 매체에 경작의 4 플라스 크에 인간의 G166 GSCs 플레이트. 프로세스 합류에 도달 했다입니다. 예를 들어, 5 x 106 G166 셀 150 c m2 플라스 크에 도금 했다 때 그들은 도금 후에 2 일을 처리 했다.</li>
</ol>
2. Biotinylated CPPs
<ol>
	<li>8200 x g 30에 동결 건조 된 biotinylated CPPs (BCPPs)를 포함 하는 튜브를 회전을 뚜껑에 남은 가루 중 일부를 피하기 위해 s. 컨트롤 BCPP 상호 작용 발견 대상 시퀀스의 특정 확인을 포함 합니다. 이 연구에서는 컨트롤 BCPP 문신-비오 틴 (문신-B) 이었고 치료 BCPP 문신 Cx43266-283. 다른 컨트롤 biotin 문신 스크램블 또는 돌연변이 융합된 조각 본드 같은 사용 될 수 있습니다.</li>
	<li>재고 솔루션 제조 업체;로 표시에 해당 문화 매체에서 BCPPs를 분해 예를 들어, 2 mg/mL의 재고 솔루션을 얻기 위해 BCPP GSCs를 치료 하는 BCPP의 1mg을 포함 한 유리병에 GSC 문화 매체의 0.5 mL을 추가 합니다. 소용돌이 펩 티 드 잘 녹는 다는 것을 확인 하 고.</li>
</ol>
3입니다. 튜브
참고: 섹션 7에 필요 조건 당 적어도 12 1.5 mL 튜브 준비.
<ol>
	<li>조건 당 처음 3 튜브를 표시 합니다. 그들은 단계 6.4에서에서 얻은 세포 lysates의 총 볼륨을 있을 것 이다.</li>
	<li>조건 당 3 관에서 A를 표시 합니다. 이러한 튜브 lysing 및 세포 lysates 회전 단계 7.2 후 얻은 첫 번째 supernatants 있을 것 이다.</li>
	<li>조건 당 3 튜브에 B를 표시 합니다. 이러한 튜브는 첫 번째 supernatants의 작은 약 수가 있을 것 이다. 이러한 lysates 단계 7.3에서에서 서쪽 오 점 샘플 될 것입니다.</li>
	<li>표시 조건 당 3 관에서 C. 이러한 튜브는 NeutrAvidin, 단계 7.7와 풀 다운 후 얻은 supernatants 있을 것 이다. 참고: 이것이 중요 한 경우에 서쪽 오 점 보였다 단백질, 단백질 내려 오게 하지 했다 또는 절차의 어떤 단계에서 분실 된 의미에 대 한 신호. 만약이 상황이 라면, 풀 단백질 다운 프로세스를 반복 합니다.</li>
</ol>
4. 세포 치료는 BCPPs
<ol>
	<li>문화 매체 발음</li>
	<li>신선한 매체 품 어 부 화 시간에 따라 매체의 가장 작은 가능한 볼륨에 BCPPs 하는 데 필요한의 해당 볼륨을 교체 합니다. 그것은 매우 중요 한 그 어떤 경우에, 매체 커버 완전히 접시/플라스 크의 표면 전체를 셀 밖으로, 예를 들어, 6 mL 30 분 부 화에 대 한 150 c m2 당 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>효과가 입증 된 농도 도달 하는 세포 배양에 BCPP의 재고 솔루션의 볼륨을 추가 합니다. 이 연구 50 µ M 문신-Cx43266-283-B는 GSC 확산을 줄이기 위해 입증 되었다.
	<ol>
		<li>따라서, 문신-Cx43266-2832 mg/mL의 92.8 µ L를 추가-B (MW = 3723.34 g/mol) 50 µ M 문신-Cx43266-283의 최종 농도를 문화 매체의 mL 당. 추가 볼륨 컨트롤 펩 티 드에 대 한 다른 경우 동일한 최종 볼륨까지 배양 완료. 예를 들어, 49.1 µ L 문신 B (MW = 1914.31 g/mol) 43.7 µ L GSC 매체 플러스 50 µ M의 최종 농도를 문화 매체의 mL 당 추가 된 문신.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BCPP와 세포내 파트너 간의 상호 작용 일어난다 되도록 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 세포를 놓습니다. 상호 작용 오래 걸리면, 더 긴 시간 품 어 하거나 실험 한 시간 코스의 구성 하는 경우에 시간을 조정 합니다. 또한, 관심의 상호 작용 승진 수 있다 또는 자극 다른 세포내 신호 통로 의해 방해.</li>
</ol>
5. 버퍼 및 솔루션.
<ol>
	<li>PBS pH 7.4: 136 m m NaCl; 준비 2.7 m m KCl; 7.8 m m 나2HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2포4.</li>
	<li>단백질 세포의 용 해 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, 1% 사용, IGEPAL, 사전에 다음 추가: 1/100 (v/v) 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 1mm 나트륨 불 소, 1 m m Phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF) 및 0.1 m m 나트륨 orthovanadate.</li>
	<li>Laemmli 버퍼 준비: (4 배: 0.18 M Tris HCl pH 6.8; 글리세롤 5 M; 3.7 %SDS (p/v), 0.6 M β-mercaptoethanol 또는 9 mM DTT; 0.04% (v/v) bromophenol 블루 (BB)).</li>
</ol>
6. 단백질 추출
참고: 앞에서 설명한20,23으로 단백질 추출 수행 되었다. 이 모든 섹션 4 ° c.에 절차의 수행
<ol>
	<li>문화 매체를 완전히 발음.</li>
	<li>워시 3 x 10 mL의 얼음 처럼 차가운 인산 염으로 세포 분리를 피하기 위해 매우 신중 하 게 염 분 (PBS) 150 c m2 당을 버퍼링 합니다.</li>
	<li>세포 lysate를, 세포의 용 해 버퍼 150 c m2 당 3 mL를 추가 하 고 철저 하 게 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 표면을 긁어. 약 45도 접시/플라스 크를 기울이기 쉽게 자신의 해당 튜브에 세포 lysates 수집 하.</li>
	<li>3 1.5 mL 튜브에 세포 lysate 관 당 1 mL를 붓는 다. 이러한 튜브 상태와 복제 단계 3.1에에서 표시 된 대로 표시 됩니다.</li>
</ol>
7. 풀-다운
<ol>
	<li>1.5 mL 튜브 4 ° c.에서 10 분 11000 x g 에서 원심</li>
	<li>새로운 튜브 (A)는 supernatants 전송.</li>
	<li>다른 튜브 (B), 즉 50 µ L 튜브 당 조건 당이 상쾌한의 약 수 가져가 라. 4 x Laemmli 버퍼 (lysate의 50 µ L에 대 한 16.6 µ L)를 추가 하 고-20 ° c.에 동결 이러한 lysates 평소 서쪽 오 점 샘플을 될 것입니다.</li>
	<li>부드러운 진동에 의해 잘 NeutrAvidin Agarose 균질. 그들의 직경을 증가 하 고 구슬의 pipetting 향상 피 펫 팁의 끝을 잘라.</li></ol>셀 (A) 튜브에 lysate의 mL 당 NeutrAvidin Agarose의 50 µ L를 추가 합니다.
	<li>NeutrAvidin BCPPs 그들의 세포내 파트너에 바인딩된 상호 작용할 수 있도록 매우 부드러운 떨고와 하룻밤 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>3000 x g 단백질 NeutrAvidin의 복합 수집 하 4 ° C에서 1 분 동안에 원심.</li>
	<li>조심 스럽게는 supernatants 제거 하 고 깨끗 한 관 (C)에 그들을 전송. 풀 다운은 성공 하는 경우에 그들을 사용 하는 그들을 유지.</li>
	<li>세척 단계: 펠 릿 (튜브 A)를 신선한 세포의 용 해 버퍼를 추가, 반전에 의해 resuspend 및 반복 단계 7.6) 및 7.7) 5 번 이상에 대 한. 이러한 모든 supernatants 삭제 될 수 있습니다.</li>
	<li>supernatants 제거 하 고 원하는 마지막 볼륨 (confluent 셀 150 c m2 플라스 크에서 얻은 펠 릿에 대 한 1.5 mL 튜브에 40 µ L) 2 x Laemmli 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>단백질 및 원심 분리기 30 사이의 상호 작용을 해리를 5 분 동안 100 ° C에 elute 8,200 x g 작은 NeutrAvidin 구슬에서 s.</li>
	<li>새로운 관 (D)에 모 세관 팁 천연된 단백질을 포함 하는 supernatants 가져가 라. 구슬 필요한 차입 단계를 반복 하는 경우에 보관할 수 있습니다. 참고: supernatants (D 관) 준비가 지금 서쪽 오 점에 로드할 수 또는-20 ° c.에 동결</li>

8. 서쪽 오 점
참고: 앞에서 설명한24로 수행 되었다 서 부 럽.
<ol>
	<li>Midi-셀 전기 시스템에서 두번째-트리 스 (4-12%) midigels에 차선 당 각 샘플의 동일한 볼륨을 로드 합니다.</li>
	<li>Transblot 단백질 니트로 일반 스택으로 건조 더 럽 히 시스템을 사용 하 여.</li>
	<li>10% 막 얼룩 Ponceau 10 분.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분 막 씻으십시오.</li>
	<li>부드러운 튜브 또는 작은 상자에 떨고와 1 시간에 대 한 TTBS에서 7% 우유와 함께 막 차단 합니다. 사용 하는 볼륨 멤브레인을 커버 하기에 충분 하 고는 그들은 건조 하지 마십시오, 즉 전체 midi 막 당 40 mL 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분을 씻어.</li>
	<li>부드러운 진동으로 관심사의 단백질에 대 한 1 차적인 항 체와 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분을 씻어.</li>
	<li>특 파 원 과산화 효소 활용 된 이차 항 체 TTBS에 1 시간에 대 한 실내 온도에서 막 품 어.</li>
	<li>TTBS의 5 mL와 함께 3 x 5 분을 씻어.</li>
	<li>화학 시스템 chemiluminescent 기판으로 개발.</li>
</ol>
9. 문제 해결
<ol>
	<li>개발 후 서쪽 모든 단백질을 위한 신호를 보여준 샘플의 오 점는 Ponceau 확인. 레인을 따라 수많은 밴드 로드 및 참고: Ponceau에 막 정의 되지 않은 표시 한다. 밴드 매우 눈에 띄는 경우, 로드 하는 단백질의 양이 충분 하지 않을 수 있습니다 또는 올바르게 사라 하는 전이 할 수 있습니다. 서쪽 오 점 반복 되는 것이 좋습니다.</li>
	<li>모든 레인에 Ponceau 막에 전혀 아무 얼룩 경우, (C) 튜브에서 7.4 단계에서 전체 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>서쪽 오 점 개발 후 단백질 신호는 매우 약한 경우는 Ponceau 보였다 단백질, 긴 시간에 대 한 1 차 항 체로 막을 다시 품 어. 신호가 여전히 다소 약한 경우에, 다시 실 온에서 품 어.</li>
</ol>
10. 기타 기술 사용 하는이 기사에서
<ol>
	<li>BCPPs의 Immunocytochemistry
	<ol>
		<li>20 분 동안 4 %paraformaldehyde (0.2 mL c m2당)에 있는 셀을 수정 합니다.</li>
		<li>PBS (0.2 mL c m2당)를 가진 3 x 5 분을 씻어.</li>
		<li>하룻밤 4 ° c.에 대 한 관심의 단백질에 대 한 제조 업체의 지정 된 농도에서 항 체 용액에 희석 해당 항 체 (c m2당 0.15 mL 이상) 적용</li>
		<li>fluorophore 활용 된 이차 항 체 (c m2당 0.15 mL) 실 온에서 2 h와 함께 품 어.</li>
		<li>관심사의 단백질에 대하여 다른 항 체와 단계 10.1.2-10.1.4를 반복 합니다. 다른 기본 항 체 또는 이차 항 체에 대 한 동일한 파장 fluorophores 같은 종족을 사용 하지 않기 위하여 주의 해야 합니다.</li>
		<li>Antifade 시 약 (c m2당 0.005 mL)을 사용 하 여 셀을 탑재 합니다.</li>
		<li>디지털 카메라에 연결 된 형광 현미경에 분석.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT 분석 결과
	<ol>
		<li>24-잘 접시에서 37 ° C에서 세포 문화.</li>
		<li>셀 MTT 0.5 mg/mL를 포함 하는 c m2 당 문화 매체의 0.15 mL와 75 분 동안 어둠 속에 품 어.</li>
		<li>매체를 발음 하 고 디 메 틸 sulfoxide (c m2당 0.25 mL) 가벼운 동요와 함께 어둠 속에서 10 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>570의 파장에서 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 많은 방법이 있다. 이 연구에서 제시 하는 방법 biotinylated 미끼와 상호 작용의 설립을 허용 하도록 세포 lysates incubated 널리 biotin avidin 풀 다운 시스템을 기반으로 합니다. 이 연구에서 제시 하는 수정이이 기술은 세포 관통 시퀀스의 조합을 포함 합니다. 우리는 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 알을 품 수 세포 관통 미끼 디자인을 제안 하 고 따라서 발견 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 하는 그 반영 됩니다.
여기 우리 풀 다운 태그와 인간 GSCs에 세포 상호 작용을 찾을 대상으로 아미노산 266-283 사이 구성 하는 Cx43의 지역으로 세포 관통 시퀀스, biotin 문신 사용 합니다. Cx43와 c-Src 간의 상호 작용에 대 한 구조적으로 잘 알려진11,12입니다. 이것은 중요 한 상호 작용 그것은 c-Src glioma 셀24,13의 종양 활동을 억제 하기 때문에. 사실, 포함 하는이 지역 (문신-Cx43266-283) CPPs glioma 셀19,,2021에 Cx43의 antioncogenic 속성 모방. 쥐 glioma C6 셀에는 문신-Cx43266-283 c Src 억제 메커니즘 생 억제제 CSK와 PTEN20c-Src의 채용을 포함 한다. 그것은 GSCs 그들은 기존의 치료에 저항 하 고 그러므로27이 악성 뇌 종양 재발에 대 한 책임 부분 모집단을 구성 하기 때문에 매우 흥미로운 glioma 치료에서 대상으로는 언급 한다. 또한, 그들은 하드 transfect 세포 그리고 그러므로 세포 상호 작용의 연구 더 어려워집니다. CPPs는 신속 하 고 효율적으로 내 면 GSCs19 세포내 상호 작용의 학문을 위한 그들의 사용을 선호. 이에 연구, 우리 Cx43266-283 시퀀스의 c-Src의 내 생 억제제 CSK 및 인간 GSCs에 PTEN 함께 상호 작용을 확인 CPPs biotin에 융합을 사용 하 여.
이 메서드는 매우 강력한 생리 활성 화합물의 세포내 기계 장치를 공부 하. 그러나, biotinylated 세포 관통 미끼의 생물학적 효과 비-biotinylated 하나 얻은 다른는 것인지 매우 중요 하다. 이 단계는 생리 활성 화합물의 효과 함께 발견 하는 상호 작용을 연결 해야 합니다. 더하여, 프로 테아 제에 의해 그것의 가능한 저하 뿐만 아니라 그것의 가능한 독성 화합물의 안정성 해야 될 신중 하 게 테스트 및 실험을 계획 하기 전에 고려. 예에서 제시 G166 인간 GSCs에 문신-Cx43266-283 의 안티 증식 효과 이전 문서화20되었습니다. 이 연구에서 우리가 확인 문신 Cx43266-283의 안티 증식 효과-B 이며 문신-Cx43의266-283 매우 유사. 또한, 세포 형태학의 분석을 α-tubulin 밝혀 및 문신 Cx43266-283치료 G166 GSCs F 걸 배포 매우 비슷합니다.-B 또는 문신 Cx43266-283. 이러한 결과 문신-Cx43266-283 의 c-말단에 biotin의 포함 인간 GSCs에이 화합물의 효과 수정 하지 않은 나타냅니다. 그러나, biotin bioactive 분자의 효과 수정 것 이다 단백질 정화에 대 한 다른 태그 시험 될 수 있다, 플래그 octapeptide (DYKDDDDK)28, 인간의 인플루엔자 조류 파생 태그 하 (YPYDVPDYA) 또는 티 등 S-전이 효소 (GST)29 마찬가지로, 문신의 셀 인구 대상 하지 않는, 다른 penetratin, MPG (검토,30참조)에 대 한 같은 관통 시퀀스 셀 또는 셀 특정 시퀀스 사용된31일 수 있다.
구체적으로 대상 시퀀스와 상호 작용 하는 연구 단백질 이외에, 모두 컨트롤 및 대상 시퀀스와 상호 작용 하는 단백질 및 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 그들 상호 작용 하지 않는 단백질의 존재 해야 합니다. 해결. 이런이 의미에서 우리가 컨트롤에 기갑 부 대-1를 발견 하 고 같이 그것은 되었습니다 이전26는 caveolae 국제화의 메커니즘에 관여 제안 처리 상황. 또한, 팍, c-Src와 상호 작용 하지만 하지 Cx43 c 단자와 상호 작용 하도록 되어, 결 석 했다 제어 및 치료 상황에. 이러한 결과 문신-Cx43266-283-B, c-Src, CSK와 PTEN 사이 상호 작용의 특이성을 강화합니다. 이 프로토콜으로 얻은 결과 확인 하려면 상호 작용 단백질의 분포를 시각화 하 고 그들의 공동 지역화 연구 confocal 현미경 검사 법을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리는 그 문신 Cx43266-283-B와 c-Src 전시 풀 다운 실험으로 얻은 결과 확인 하는 공동 지역화의 몇 가지 포인트와 유사한 세포내 분포를 발견. 사실, 문신-Cx43266-283-B는 화물,이 연구 Cx43266-283, 지시 분자 세포내 파트너를 제안 하는 원형질 막 가까이 배포 됩니다.
제안된 된 방법의 한계 중 하나는 미끼 제대로 접어 하는 데 실패할 수 있습니다 사용 하는 분자와 예상된 효과 것입니다 찾을 수 없습니다입니다. 이 상황에서 발견 하는 상호 작용 수 없습니다 효과에 연결. 그러나,이 방법 때문에 그들은 일반적으로 본질적으로 무질서 지역32 에 의해 실행, 따라서 필요 없습니다 주문 접는 특히 신호 전달 경로에 관련 된 상호 작용에 대 한 흥미로운 수 있습니다. 또한, 제안된 된 방법의 장점 중 하나는 상호 작용의 시간 과정 지켜질 수 있다,이 특히 과도 상호 작용에 대 한 관련입니다. 또한, 상호 작용에 각 잔류물의 관련성은 쉽게 공부 될 수 있다. 실제로, 그것은 떠들고 또는 트레오닌 조미료의 phosphomimetic 대체 하 여 단백질 단백질 상호 작용, 예를 들어,에 posttranslational 수정의 관련성을 연구 수 있습니다. 마찬가지로, 떠들고 또는 알라닌에는 트레오닌, 페닐알라닌을 위한 티로신의 대체 비 phosphorylatable 떠들고, 트레오닌 또는 티로신. 의 효과 테스트를 수합니다인 티로신을 모방 하는 가장 정확한 방법은 p Tyr33Tyr의 대체입니다.
마지막으로,이 프로토콜의 범위는 단백질 단백질 상호 작용 보다 훨씬이 시스템 RNA 시퀀스, 나노 입자, 바이러스 또는 biotin을 융합 하 고 공부 하는 CPP로 불리고 수 있는 다른 분자 같은 다른 생리 활성 화물에 적용 될 수 있기 때문에 세포내 메커니즘에 대 한 그들의 행동의.

단백질 단백질 상호 작용 다양 한 세포질 과정을 위해 필수적입니다. 완벽 하 게 이해 하려면 이러한 프로세스, 환경 내에서 복잡 한 세포내 단백질 상호 작용을 식별 하기 위한 방법이 제시해 주셔야 합니다. 단백질의 상호 작용 협동자를 식별 하기 위해 가장 많이 사용 된 방법 중 하나는 단백질 또는 그 단백질으로 선호도 풀 다운 실험 뒤에 바인딩 단백질의 검출에에서 미끼의 일부의 모방 펩 티 드를 사용 하는. Avidin 비타민 b 복합체 시스템은 높은 선호도, 특이성 및 avidin 비타민 b 복합체1,2간의 안정적인 상호 작용 때문에 자주 사용 됩니다. 일반적으로, 비오 틴 (단백질 또는 펩 티 드) 미끼에 바인딩되어 covalently 및 상호 작용의 설립을 허용 하는 세포 lysates 가진 외피의 기간 후 세포내 파트너에 바인딩된 biotinylated 미끼 avidin 또는 avidin 내려 오게 됩니다. 파생 상품 활용 지원 구슬. 다음, 미끼-단백질 상호 작용은 서쪽 오 점 순이 전기 이동 법을 변성 시키기 의해 세척, 차입, 및 분석 후 검색 됩니다. 이 기술은의 문제 중 하나는 관심사의 단백질 및 세포내 파트너 간의 상호 작용 세포 컨텍스트 외부 자리 하고있다입니다. 이 때문에 그들은 특정 세포내 위치에서 그들은 과도 하 고 그들은 일반적으로 풍부 하지 단백질에 의해 실행 신호 변환 통로에 관련 된 상호 작용에 대 한 특히 중요 하다. 따라서, 세포 lysates 내에서 이러한 상호 작용 수 수 마스크 다른 더 풍부한 단백질 또는 단백질 일반적으로 가까이 하지 않습니다.
세포 관통 펩 티 드 (CPPs) 짧은 펩 티 드 (≤40 아미노산), 거의 모든 셀3에 다양 한 분자를 수송 할 수 있다 양이온 아미노산에 의해 주로 구성 되어 있습니다. 단백질, 플라스 미드 DNA, siRNA, 바이러스, 이미징 에이전트, 다양 한 나노 입자 같은 화물 CPPs을 효율적으로 내 면된4,5활용 되어 있다. 이 수송 능력 때문에 그들은 또한로 알려져 있습니다 단백질 변환 도메인 (PTDs), 막 translocating 시퀀스 (MTSs), 그리고 트로이 펩 티 드. CPPs, 중 문신6 중 하나 되었습니다 가장 널리 HIV transactivator 단백질에서 문신 펩타이드 7,,89공부. 문신은 6 아르기닌과 2 리 진 잔류물을 포함 하 고 결과적으로 높은 양이온은 nonapeptide 이다.입니다. 대체 연구 문신의 순수한 양 전은 진 핵 세포와 그 이후의 국제화10의 플라즈마 멤브레인과 정전기 상호 작용에 필요한 증명 하고있다. 마찬가지로 다른 CPPs에 긍정적으로 위탁 문신 강하게 결속 정전 다양 한 부정 청구 종 세포 외 표면에 세포 막 지질 머리 그룹, proteoglycans3 , glycoproteins 등의 , 10. 생리 화물 문신에 의해 수송 될 그들의 세포내 파트너에 도달 cytosol에서 즉시 무료.
여기 선물이 biotin 세포내 상호 작용을 공부 하는 문신 CPP를 결합 하는 방법. 목표 대상 biomolecule 문신 biotin을 융합 하 여 세포 관통 미끼를 디자인 하는. 이 제안서의 주요 장점은 미끼와 파트너 간의 상호 작용 세포의 컨텍스트 내에서 자리를 차지할 것 이다입니다. 이 방법의 효능 표시 하려면 우리가 사용 미끼 proto-oncogene c-Src11,,1213침 작용할 것으로 보고 되었습니다 Cx43 단백질의 작은 순서. Cx43는 완전 한 막 단백질 이다 이다14널리 표현 하 고 고급 gliomas 아래로 통제 되는 중앙 신 경계15,16,17의 가장 일반적인 악성 종양 ,18. 그것은 되었습니다 이전 c-Src (266-283에에서 아미노산 인간 Cx43;와 상호 작용 하는 Cx43 지역 표시 Pubmed: P17302) 문신 (문신-Cx43266-283)을 융합 c Srcin glioma 세포의 종양 활동을 억제 및 glioma 줄기 세포 (GSCs)19,,2021. 세포내 미끼 디자인, Cx43266-283 는 되었습니다 융합 C-말단에 biotin을 N-말단 (문신-Cx43266-283)에서 문신 (문신-Cx43266-283-B). 이 전략은 성공적으로 사용 되었습니다 쥐 glioma C6 셀 라인에에서 c-Src, c 터미널 Src 키 (CSK)와 인산 가수분해 효소 및 Cx4320의이 지역의 세포내 파트너로 체 (PTEN) tensin 식별 하. 여기, 우리는 매우 관련 된 glioma 치료 하지만 훨씬 더 비 줄기 glioma 셀 보다 transfect에 인간 GSCs에 그 효능을 테스트 하는이 메서드를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>G166 GSC line</td><td>BioRep</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RHB-A stem cell medium</td><td>Takara</td><td>Y40001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>10 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>B-27 Serum free Supplement (50X)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>2%</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>1%</td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Human b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4: In deionized water, 136 mM NaCl ; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2HPO4&amp;middot;2H2O ; 1.7 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10 cryopreservation medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>TAT</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>TAT-B</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>TAT-Cx43&lt;sub&gt;266-283&lt;/sub&gt;</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>TAT-Cx43&lt;sub&gt;266-283&lt;/sub&gt;-B</td><td>GenScript</td><td>-</td><td>Custom made</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A1275737</td><td>1/20</td></tr><tr><td>Monoclonal &amp;alpha;-tubulin mouse antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1/500</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>1.25 mg/ml</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; NeutrAvidin&amp;trade; Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Protein lysis buffer: 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 2 mM EDTA , 2 mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Set III. EDTA-Free</td><td>Calbiochem, Bionova</td><td>539134</td><td>1/100 (v/v)</td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>PanReac AppliChem</td><td>141675</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>Laemmli buffer: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glycerol; 3.7 % (w/v) SDS; 0.6 M &amp;beta;-mercaptoethanol or 9 mM DTT ; 0.04% (v/v) bromophenol blue (BB) .</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Xcell 4 SureLock Midi-Cell Electrophoresis System</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex Bis-Tris Midi-Gels 4-12%</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>WG1402box</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td>1X</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer 20x</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>NP0006</td><td>1X</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 NC Regular Stacks (nitrocellulose membranes)</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System - Gel transfer device</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>10% Ponceau S Solution (0.1% Ponceau (w/v) in 5% acetic acid (v/v)) in water</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>FAK polyclonal rabbit antibody</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>AHO0502</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Src polyclonal rabbit antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Csk polyclonal rabbit antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>4980</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PTEN polyclonal mouse antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>9552</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Caveolin-1 polyclonal rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2910</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP antibody</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2005</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG-HRP antibody</td><td>Quimigen, Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2030</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>Src polyclonal rabbit antibody</td><td>Cell Signalling (WERFEN)</td><td>2108S</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Antibody solution: PBS, 10% FBS, 0.1 M lysine, 0.02% sodium azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td><td>Invitrogen, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Cy2-conjugated streptavidin</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-220-089</td><td>1/500</td></tr><tr><td>MicroChemi Luminescence system</td><td>DNA Bio-Imaging Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor&amp;reg; 488 &amp;amp; Propidium Iodide (PI)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>V13241</td><td>1/500</td></tr><tr><td>SlowFade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies, ThermoFisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide for UV-spectroscopy, &gt;=99.8% (GC)</td><td>Honeywell</td><td>41641-1L</td><td></td></tr><tr><td>Appliskan 2001</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biotinylated cell-penetrating peptides to study intracellular protein-protein interactions

여기 우리는 널리 biotin avidin 풀 다운 시스템을 기반으로 하는 세포내 단백질-단백질 상호 작용 연구 프로토콜을 제시. 제시 하는 수정이이 기술은 세포 관통 시퀀스의 조합을 포함 합니다. 우리는 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 알을 품 수 세포 관통 미끼 디자인을 제안 하 고 따라서 상호 작용 발견 됩니다 반영 세포내 컨텍스트 내에서 발생 하는. Connexin43 (Cx43), 갭 정션 채널 및 hemichannels를 형성 하는 단백질은 고급 gliomas에서 아래로 통제. 구성 아미노산 266-283 Cx43 지역 c-Src glioma 세포에서의 종양 활동의 억제에 대 한 책임 이다. 여기 우리 풀 다운 태그와 아미노산 266-283 transfect 하드 인간의 glioma 줄기 세포에서 세포 상호 작용을 찾을 대상으로 사이 구성 하는 Cx43의 지역으로 세포 관통 시퀀스, biotin 문신 사용 합니다. 제안된 된 방법의 한계 중 하나는 분자 사용 미끼는 제대로 하 고, 결과적으로 접어 하는 데 실패할 수 있습니다, 발견 하는 상호 작용 수 없습니다 효과와 관련입니다. 그러나 그들은 일반적으로 본질적으로 무질서 지역에 의해 실시 하 고, 따라서, 그들은 정렬 된 접는 필요 하지 않습니다 때문에,이 방법은 특히 신호 전달 경로에 관련 된 상호 작용에 대 한 흥미로운 수 있습니다. 또한, 제안된 된 방법의 장점 중 하나입니다 상호 작용에 각 잔류물의 관련성 쉽게 공부 될 수 있다. 이것은 모듈식 시스템; 따라서, 다른 세포 관통 시퀀스, 다른 태그와 다른 세포내 표적을 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜의 범위는 단백질 단백질 상호 작용 보다 훨씬 RNA 시퀀스, 나노 입자, 바이러스 또는 세포 관통 시퀀스 불리고 수 있는 어떤 분자 같은 다른 생리 활성 화물에이 시스템을 적용할 수 있습니다 때문에 고 활동의 그들의 세포내 기계 장치를 공부 하기 풀 다운 태그에 융합.

BCPPs를 사용 하 여 세포 상호 작용을 공부를 하기 전에 BCPP vs BCPP으로 얻은 결과 확인 하는 CPP의 효과 비교 하 여 중요 하다. 따라서, 공부 하 고 대상 시퀀스의 활동을 수정 하는 비오 틴의 포함 여부, 우리가 먼저 분석 문신 Cx43266-283의 효과-B 문신 Cx43266-283 G166 GSCs 형태에 비해. 이렇게 하려면, 우리는 F-말라와 α-tubulin 치료의 24 시간 후 cytoskeletal 단백질의 일부 면역 형광 분석을 수행. 그림 1 보여줍니다 G166 GSCs 50 µ M 문신-Cx43266-283 또는 문신 Cx43266-283있을 때-B 인수 문신 (문신 B) 컨트롤에 표시 된 길쭉한 및 확장 된 셀룰러 연장에 비해 더 둥근된 모양. 사실, 그림 1b 걸 필 라 멘 트 셀 문신 Cx43266-283 또는 문신 Cx43266-283로 치료 했다 때 말라 네트워크로 조립 대부분은 보여줍니다-그들은 더 많은 걸 번들 컨트롤 셀에 형성 하는 동안 B (문신 치료 또는 TAT-B)25. 대조적으로, α-tubulin 배포 다른 조건 사이 다 하지 않습니다. 이 결과 biotin의 존재 G166 GSCs의 형태에 대상 시퀀스의 효과 수정 하지 않았다 보여주었다. 이전 연구20,21, 우리는 문신-Cx43266-283 G166 GSCs 확산 감소 다는 것을 보였다. 이 연구에서 우리는 조사 여부 문신 Cx43266-283-B 문신 Cx43266-283로 성장에 동일한 효과 발휘 한다. 이렇게 하려면, 우리가 치료의 72 h 후 MTT 분석 결과 의해 G166 GSCs 확산 분석. MTT 분석 결과 세포 신진 대사 활동을 평가 하기 위한 색도계 분석 결과가 이다. MTT는 존재 가능한 셀의 수를 반영 하는 미토 콘 드리 아에 NAD (P) H oxidoreductase 효소에 의해 물질 대사로 변화. 그림 2 는 G166 GSCs 세포 생존 능력에 있는 감소 아니다는 것을 크게 다른 때 셀 50 µ M 문신-Cx43266-283 또는 50 µ M 문신-Cx43266-283로 치료 했다. 사실, 둘 다 크게 컨트롤, 문신 또는 문신 B에 비해 G166 GSCs 확산 감소
일단 우리가 우리의 대상 시퀀스 G166 GSCs (문신-Cx43266-283)에서 효과 C-말단에 biotin의 포함에 의해 수정 되지 않았음을 확인 (문신-Cx43266-283-B), 우리이 시퀀스의 세포내 파트너 조사 프로토콜에 따라이 연구 (그림 3)에서 설명 합니다. Caveolae 문신 국제화26의 메커니즘에 참여 하고있다, 때문에 우리 분석 caveolin-1 (기갑 부 대-1) 풀-다운에서의 존재를 했다. 서쪽 오 점 분석 (그림 4) 보였다 그 문신 B와 문신 Cx43266-283-B 기갑 부 대-1 상호 작용. 그러나, 문신-Cx43266-283의 능력-B c-Src, PTEN, CSK 모집 문신 b 발견 보다 강하다 초점 접착 키 니 아 제 (팍) Cx43 상호 작용을 표시 하지 c Src의 기판입니다. 실제로, 팍 문신 B 또는 문신 Cx43266-283와 어떤 중요 한 상호 작용을 보여 주지 않았다.
문신-Cx43266-283사이의 상호 작용을 확인 하려면-B와 c-Src, G166 GSCs incubated 했다와 50 µ M 문신-Cx43266-283-B 30 분 및 그들의 지역화에 대 한 선행 되었다 형광 streptavidin과 confocal 현미경 검사 법 (그림 5 ). 우리의 결과 세포내 분포를 보여 문신 Cx43266-283의-B (phosphatidylserine 얼룩이 표시) 원형질 막 가까이 c-Src의 일치. 공동 지역화 분석 사이 문신 Cx43266-283공동 지역화 (흰색)의 몇 가지 포인트를 공개 하는 사실, B-와 c-Src 병합 이미지에. 따라서, confocal 현미경 검사 법 학문 BCPP 풀 다운 프로토콜 설명 하는이 연구에서 얻은 결과 확인 합니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig1.jpg"> 
그림 1: GSC 형태학에 BCPP 및 CPP의 효과. G166 GSCs 낮은 밀도에서 도금 했다 (2 x 104 의 세포 / cm2) 그들은 50 µ M 제어 CPP (문신) incubated 했다 24 h 후 BCPP (문신-B), CPP (문신-Cx43266-283) 치료 또는 치료 BCPP 제어 (문신-Cx43266-283-B) . a) F-말라 (빨강), α-tubulin (녹색)와 병합 + DAPI G166 GSCs 형태를 표시 하는 동일한 필드의 immunostaining. 바 = 50 µ m. b) F 걸 immunostaining F-말라 G166 GSCs 50 µ M와 24 h에 대 한 부 화 후에 다른 분포를 보여 주는 CPP (문신)를 제어 하거나 50 µ M 치료 CPP (문신-Cx43266-283) 비해 BCPP (문신-B) 또는 BCPP (문신-Cx43 제어 266-283-B). 바 = 10 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig2.jpg"> 
그림 2: GSC 생존에 BCPP 및 CPP의 효과. G166 GSCs 5500 셀/cm2 24 multiwell 격판덮개 도금 되었고 50 µ M 컨트롤 펩 티 드, CPP (TAT) 또는 BCPP (문신-B), 또는 50 µ M 치료 펩 티 드, CPP (문신-Cx43266-283) 또는 BCPP incubated (문신-Cx43266-283-B). 세포 생존 능력 72 h 후 MTT 분석 결과 사용 하 여 분석 했다. 결과 MTT absorbances로 표현 되며 3 실험 평균 ± s.e.m. (+ + p˂0.01 vs 통제. * * p˂0.01, * * * p˂0.001 대 문신 또는 문신 B; 일방통행 ANOVA 테스트 withTukey는 후). CPPs 대 BCPPs.의 효과 사이의 중요 한 차이 없는 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig3.jpg"> 
그림 3: 프로토콜 다이어그램입니다. Eluted BCPPs 및 그들의 상호 작용 단백질 obtained.1 때까지 BCPPs의 섹션은 부 화에서 "프로토콜"에서 설명한 대로 절차의 단계적으로 그래픽 묘사) 문화에 대 한 원하는 농도에서 BCPPs 셀을 품 어는 필요한 시간입니다. 2) 동안 보육는 BCPPs 내 면 하 고 그들은 그들의 세포내 파트너와 상호 작용 합니다. 3) 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 얼음에 세 번 셀 세척. 4) 단백질을 추출 하는 세포를 lyse. 5) 튜브에 세포 lysates 전송.6) 4 ° c.에서 10 분 11000 x g 에서 회전 7) 전송 새로운 튜브 (A)와 일반 부로 처리 하려고 lysates의 작은 약 수를 계속 supernatants 얼룩에 샘플 튜브 (B). 8) resuspend NeutrAvidin Agarose 구슬 고 컷된 피 펫 팁을 사용 하는 각 관에 50 µ L를 추가 합니다. 9) NeutrAvidin agarose 구슬 BCPPs 및 그들의 파트너와 상호 작용할 수 있도록 4 ° C에서 12 h 동안 부드럽게 흔들어 함께 품 어. 10)는 biotinylated와 구슬 펠 렛을 3000 x g 에서 1 분 동안 회전 미끼 그리고 그들의 상호 작용 단백질 그들에 바인딩된. 11) 새로운 관 (C)에 supernatants 전송 및 풀-다운 반복 해야 하는 경우에 사용 하는 그들을 유지. 12) 세척 5 회 신선한 세포의 용 해 버퍼와 펠 릿, 반전, 3000 x g 에서 1 분 동안 회전 급강하에 의해 resuspend 하 고는 상쾌한 삭제. 13) 모든 상쾌한 신중 하 게 제거 합니다. 14) 추가 원하는 양의 Laemmli 버퍼 x 4 하 고 5 분 15 100 ° C에서 단백질을 elute) 8200 x g 30에 스핀 s 작은 구슬. 16) 상쾌한 새로운 관 (D)에 모 세관 팁에 eluted 단백질 전송. 17) 서쪽 오 점 분석을 위한 젤에 로드 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig4.jpg"> 
그림 4: 연구-풀 다운에 의해 G166 GSCs B 서쪽 오 점 뒤에 문신-Cx43266-283의 세포 상호 작용의. G166 GSCs 50 µ M 문신 B 또는 문신 Cx43266-283와 알을 품을 했다. 후 30 분 셀 lysed 했다 및 문신 B 또는 문신 Cx43266-283-B 그들의 세포내 파트너에 연결 된 NeutrAvidin 구슬 내려 오게 했다. Eluted 단백질 로드 되었고 팍, c-Src, CSK, 레벨을 공부 하는 서쪽 오 점 분석 PTEN 및 기갑 부 대-1. 기갑 부 대-1 두 문신 B와 상호 작용 하 고 문신 Cx43266-283-B, c-Src, PTEN, CSK 여기서 우선적으로 문신 Cx43266-283-B와 팍 문신 B 또는 문신 Cx43266-283와 어떤 상호 작용을 보여 주지 않았다-B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig4large.jpg" target="_blank">하시기 바랍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56457/56457fig5.jpg"> 
그림 5: 문신-Cx43266-283-B 세포 상호 작용의 G166 GSCs에 confocal 현미경 검사 법에 의해 확인. G166 GSCs 50 µ M 문신-Cx43266-283와 알을 품을 했다. 30 분 후 셀 고정 되었고 문신 Cx43266-283지역화를 처리-면역 형광 (빨간색)와 phosphatidylserine annexin V (파란색)와 c-Src Cy2 Streptavidin (녹색), B. 문신-Cx43266-283사이 공동 지역화 (흰색)의 몇 가지 포인트를 참고-B와 c-Src 병합 이미지에 원형질 막 가까이. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56457/56457fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

이것은 세포내 단백질 단백질 상호 작용 세포 관통 시퀀스 결합의 참신과 함께 biotin avidin 풀 다운 시스템에 기초를 공부 하는 프로토콜 이다. 주요 장점은 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 대상 시퀀스를 incubated 하 고 따라서 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 합니다.

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K 조회수.  Universidad de Salamanca. 이것은 세포내 단백질 단백질 상호 작용 세포 관통 시퀀스 결합의 참신과 함께 biotin avidin 풀 다운 시스템에 기초를 공부 하는 프로토콜 이다. 주요 장점은 세포 lysates 대신 살아있는 세포와 대상 시퀀스를 incubated 하 고 따라서 상호 작용 세포 컨텍스트 내에서 발생 합니다.

비디오: Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

연구

생화학

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

생물학

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper tumor cells, leading to tumor recurrence. To conquer the limited penetration of biological barriers, cell-penetrating peptides (CPPs) have been discovered with excellent membrane translocation ability and have emerged as useful molecular transporters for delivering various cargoes into cells. However, conventional linear CPPs generally show compromised proteolytic stability, which limits their permeability across biological barriers. Thus, the development of novel molecular transporters that can penetrate biological barriers and exhibit enhanced proteolytic stability is highly desired to promote drug delivery efficiency in biomedical applications. We have previously synthesized a panel of short cyclic CPPs with aromatic crosslinks, which exhibited superior permeability in cancer cells and tissues compared to their linear counterparts. Here, a concise protocol is described for the synthesis of the fluorescently labeled cyclic polyarginine R8 peptide and its linear counterpart, as well as key steps for investigating their cell permeability.

This protocol describes the synthesis of cyclic cell-penetrating peptides with aromatic cross-links and the evaluation of their permeability across biological barriers.

생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

화학

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest in developing these peptides, especially cell-specific ones, as novel vectors for delivering diagnostic and therapeutic materials. Our past work involving phage display identified a novel, nonnaturally occurring, 12 amino acid-long peptide that we named cardiac targeting peptide (CTP) due to its ability to transduce normal heart tissue in vivo with peak uptake seen in as little as 15 min after an intravenous injection. We have undertaken detailed biodistribution studies by injecting CTP labeled with fluorophore cyanine5.5, allowing it to circulate for various periods of time, and euthanizing, fixing, and sectioning multiple organs followed by fluorescent microscopy imaging. In this publication, we describe these processes as well as ex vivo imaging of harvested organs using an in vivo imaging system in detail. We provide detailed methodologies and practices for undertaking transduction as well as biodistribution studies using CTP as an example.

We describe protocols for assessing the degree of transduction by cell-penetrating peptides utilizing ex vivo imaging systems followed by paraffin embedding, sectioning, and confocal fluorescent microscopy using cardiac targeting peptide as an example. In our protocol, a single animal can be used to acquire both types of imaging assessment of the same organs, thereby cutting the number of animals needed for studies by half.

심장 표적 펩타이드의 트랜스포션 효율성의 생체 내 이미징

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

단백질 상호 작용의 Live Cell Single-Molecule Imaging-Based 정량화

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

저자 스포트라이트: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

요약

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생물학적 장벽의 침투 강화를 위한 순환 세포 침투 펩타이드의 구성

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

심장 표적 펩타이드의 트랜스포션 효율성의 생체 내 이미징

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정