Name: method for labeling transcripts in individual escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments
Uploaded: 2017-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments at JoVE.com

Bu eser bir İsrail Bilim Vakfı Hibe 514415 (js) ve bir BSF-NSF (MCB) hibe 2016707 (js) tarafından desteklenmiştir. Destek Siegfried ve Irma Ullman ne bağlı elektrikli sandalyeye (js) da kabul edilmektedir.

1. sonda tasarım
Not: Bu protokol piyasada bulunan Oligonükleotid probları zaten fluorophores ile öğesini kullanır. Sondalar belirli dizileri bir hedef için tamamlayıcı bir dizi oluşur mRNA, floresan molekülünü Birleşik her sonda. Alternatif olarak, başka bir yerde5,16açıklandığı gibi probları için floresan işaretleri eklemek mümkündür.
<ol>
	<li>Tasarım smFISH sondalar Arjun Raj (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); tarafından geliştirilen Probe Tasarımcısı16 algoritması kullanılarak Bu el yazması kullanılan smFISH sondalar dizisi malzemeleri tabloda listelenir. Not: Minimum algılanabilir sinyal için bir küme probları ~ 30 sayısıdır. Özellikle çok kısa transkript ölçülür Eğer hassas numarası faiz, gen göre değişebilir.</li>
	<li>Optik kurulum uygun bir boya seçin (malzemelerin tabloya bakın). Not: Cy3 boya veya düşük bir fotoğraf beyazlatma duyarlılık ile optik eşdeğer bir boya önerilir. Çift etiketleme için bir Cy5 ya da bir optik eşdeğer adaydır boya (malzemelerin tabloya bakın). Fırtına görüntüleme etiketli mRNA uygun boyaları kapasitelerini Floresans emisyon birden fazla döngüleri için karakterizedir. Bazı smFISH boya kullanılabilir fırtına görüntüleme için (malzeme tabloya bakın). İki (veya daha fazla) Tutanaklar aynı hücrede farklı genler karşılık gelen görüntü biri olan spectra az veya hiç çakışma var boyalar için Birleşik Oligonükleotid probları seçmelisiniz.</li>
</ol>
2. reaktif hazırlık
Not: Filtre uygulanmış pipet ipuçları ve tüpler gibi RNase free sarf malzemeleri kullanarak örnekleri RNAse free tutmak için ve herhangi bir çalışma ortamı temiz tutmak için önemlidir. Hedef transkript bozulma önlemek için hücre fiksasyon kullanılan tüm reaktifler nükleaz ücretsiz olması gerekir (malzemelerin tabloya bakın) veya diethylpyrocarbonate (DEPC)-tedavi ve sterilize.
<ol>
	<li>Arabellekleri için smFISH
	<ol>
		<li>1 x PBS (fosfat tamponlu tuz, bir fosfat tampon konsantrasyonu 0.01 M ve Sodyum Klorür konsantrasyon 0.154 m, (pH 7,4) ile çözüm) RNase free hazır olun. 10 x PBS RNase free seyreltik (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz-serbest su (malzemelerin tabloya bakın) 1:10, v/v oranı.<ol>
			<li>Alternatif olarak DEPC tedavi 1 hazırlamak PBS x.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>RNase free hazırlamak 2 x SSC (serum sodyum sitrat arabellek, 0,03 M sodyum sitrat, (pH 7,0) 0.3 M NaCl). RNase free seyreltik 20 x SSC (malzemelerin tabloya bakın) nükleaz ücretsiz su 1:10 v/v oranı.<ol>
			<li>Alternatif olarak, DEPC tedavi 2 hazırlamak x SSC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oligonükleotid sonda hisse senedi çözüm.
	<ol>
		<li>Bir sonda hazır 25 µM. oluşturmak için TE arabelleği (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 200 µL kurutulmuş Oligonükleotid sonda grubunda yeniden dağıtılması Mix de tarafından yukarı ve aşağı, pipetting ve sonra girdap ve santrifüj kısaca.</li>
		<li>Donma ve hisse senedi çözüm tüp tezcan önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots edin. -20 ° c veya daha düşük stok çözüm depolamak ve ışıktan korumak. Not: 250 hibridizasyon reaksiyonlar 5 nmol sonda kümesi sağlar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hibridizasyon arabellek (aşağıdaki Skinner vd. 7 ):
	<ol>
		<li>5 mL su nükleaz ücretsiz 50 mL polipropilen alt konik tüp ekleyin. Dextran sülfat 1 g için su ekleyin ve dinç vortexing tarafından çözülür. Kadar kabarcıklar (~ 30 min) ortadan içeriği bir orbital shaker karıştırın.</li>
		<li>Deiyonize suyla formamide, E. coli tRNA, 10 mg çözüm 3,530 µL 20 SSC x 1 mL, 100 µL 200 mM vanadyl-ribonucleoside kompleks ve 50 mg/ml BSA 40 µL ekleyin. Homojen olana son hacim için 10 mL DEPC tedavi su veya su nükleaz-Alerjik ve girdap eklenmesi tarafından çözüm getirin. Not: donma ve erime çözüm önlemek için karşılık gelen tutarı çalıştırmak tek bir deneysel kullanılacak beklenen stok çözümün birkaç aliquots olun. Mağaza-20 ° C'de hisse senedi çözüm Şişeyi açmadan önce oda sıcaklığına kadar sıcak formamide bildirin emin olun. Arka plan azaltmak için en uygun formamide konsantrasyonu (% 10-40 hacmen oranı) kalibre için önerilmektedir. 
		Uyarı: UYARI! Formamide çok zehirli ve bilinen bir teratogen. Gözleri ya da deri, solunum veya sindirim ile temasından sakının. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa.</li>
		<li>Çözüm 0,22-µm filtreden geçirilerek sterilize. Aliquots içinde tutmak ve bir yıl için-20 ° C depolama yapar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 x PBS'ye % 37 formaldehit (v/v) ekleyerek fiksasyon arabellek (1 x PBS % 4.6 formaldehit) hazırlamak (bkz. 2.1.1) 1:8 v/v oranı ve girdap. DİKKAT: UYARI! Formaldehit çok zehirli ve bilinen bir kanserojen. Bir duman başlık altında koruyucu eldiven ve önlük giyerken başa.</li>
	<li>SmFISH için yıkama arabellek hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC) 2'ye deiyonize suyla formamide ekleyerek x SSC (bkz: 2.1.2) 1:4 v/v oranı ve girdap.</li>
	<li>Görüntüleme arabellek arabellek yıkamak için 5 mM cysteamine ve oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz, 56 nM katalaz ve % 10 glikoz (w/v)) ekleyerek smFISH için hazırlamak (% 20 formamide 2 x SSC)</li>
	<li>Fırtına arabellekleri
	<ol>
		<li>Arabellek A 50 mM Tris-HCl ve 10 mM NaCl nükleaz ücretsiz su ekleyerek hazırlayın. Not: RT yıl boyunca dükkanda.</li>
		<li>Arabellek B 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl ve % 10 w/v ekleyerek glikoz nükleaz ücretsiz su için hazırlayın. Not: Mağaza 4 ° C'de için bir yıl kadar.</li>
		<li>MEA arabellek 77 mg cysteamine 1 ml (1 M çözüm sağlar) arabelleği A çözülerek hazırlayın. Not: Bu 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.</li>
		<li>Gloxy arabellek 8,440 AU (rasgele adet) glikoz oksidaz ekleyerek hazırlamak ve 1 ml 70,200 AU katalaz tampon A. Not: 50 x hisse senedi çözüm, yapar o-ebilmek var olmak stok 4 ° C'de 1 ay için.</li>
		<li>MEA arabellek ve 1 Gloxy arabellek arabellek B. x 50 mM ekleyerek fırtına için görüntüleme arabellek hazırlamak Not: Görüntüleme arabellek fırtına için 5 mM cysteamine, oksijen gidericiler (7 µM glikoz oksidaz ve 56 nM katalaz) 50 mm Tris ile 10 mM NaCl ve % 10 glikoz pH 8.0 oluşur. Sadece görüntüleme önce hazırlamak, saklanır ve RT yaklaşık 2 saat için kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. örnek fiksasyon
<ol>
	<li>Bakteri hücreleri (örneğin, E. büyümek</li></ol>coli MG1655) büyüme medya seçimi (örneğin, LB orta) gecede inan orbital shaker 260 devir/dakika ve 37 ° c Not: arka plan sondalar non-spesifik bağlanması nedeniyle belirlemek için faiz gen silinmiş bir yük ölçümlerde, (bkz: şekil 1 ve ΔsodB içinde Δgalk aynı yordamı yapılmalıdır Şekil 2).
	<li>Gecede kültür 1: taze ortamda 100 sulandırmak ve optik yoğunluğu (OD600) bir Spektrofotometre 0,2 - değeri kadar her ~ 1 h ölçü birimi 0.4; 4 mL kültür-meli var olmak yeterli. Not: Seçilen mikroskop faz kontrast veya fark girişim kontrast yetenekleri varsa, E. coli dış membran 2 mikron lipofilik floresan marker ile Etiketlenmiş (malzemelerin tabloya bakınız), hangi eklenmektedir Bakteriyel süspansiyon 20 dk önce fiksasyon17. Fiksasyon ve daha ileri tedavi aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Bir farklı emisyon spektral örtüşme etiketli-sonda seti ile en aza indirmek için spektrum, sahip bir floresan işaretçisi seçmeye özen göstermelidir.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 4 ° C'de 4500 g de 5 min için Süpernatant tüm tüpler kaldırın.</li>
	<li>1 mL 1 x PBS için her tüpün ekleyin ve hücre-hücre toplama en aza indirmek için Pelet resuspend. Sonra yavaşça fiksasyon tampon ve girdap 4 mL ekleyin.</li>
	<li>24 ° C'de 30 min için bir orbital Çalkalayıcı-260 devirde örneklerinde kuluçkaya</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 10 dk, 1000 g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın. 1 mL 1 x PBS ekleyin.</li>
	<li>Süspansiyonlar (malzemelerin tabloya bakın) 1.8 µL alt konik mikro-santrifüj tüpleri için aktarmak ve iki kere 3,6 adımı yineleyin.</li>

4. örnek Permeabilization
<ol>
	<li>Süpernatant çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Küçük hacimli Pipetler, gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.</li>
	<li>300 µL DEPC tedavi su veya su nükleaz ücretsiz resuspend. 350 µL yüksek dereceli mutlak etanol (% 99) ekleyin ve karışımı yavaşça tüp ters çevirme. Etanol ve mix yeniden, son etanol konsantrasyonu % 70 (v/v oranı) ulaşmak için başka bir 350 µL ekleyin. DİKKAT: UYARI! Etanol yanıcı.</li>
	<li>Örnek 20 rpm (RT) oda sıcaklığında 1 h için bir tüp rotator ile döndürme, veya bir gece 4 ° C'de. Örnekleri 4 ° C'de bir haftaya saklanabilir.</li>
</ol>
5. hibridizasyon
<ol>
	<li>Pelet hücreleri tarafından Santrifüjü 7 dk, 750 x g, 4 ° C. Süpernatant kaldırın.</li>
	<li>1 mL % 20 örnekleri arabelleğe yıkama ve ayakta birkaç dakika veya pipet Pelet tamamen erimesi için bırakın ekleyin.</li>
	<li>Pelet hücreleri Santrifüjü için 750 x g, 4 ° c de 7 min tarafından</li>
	<li>Süpernatant çok yavaşça pipetting tarafından çıkarın. Küçük hacimli Pipetler gerekirse, pelet dışında tüm sıvı kaldırmak kullanın.</li>
	<li>Oligonükleotid sonda ayarla hisse senedi çözüm hibridizasyon arabellek aliquot böylece son Oligonükleotid konsantrasyon 250 eklemek nM; girdap şiddetle. Not: Bir iki veya daha fazla farklı hedef mRNA'ların aynı hücrede aynı anda etiketleyebilirsiniz. Her iki hedef grupları sonda hibridizasyon arabelleğe ekleyin. Boyalar farklı emisyon spektral örtüşme (örneğin, Cy3 ve Cy5) en aza indirmek için spectra sahip seçmek için özen göstermelidir. Fırtına görüntüleme için amaçlanan örnekleri ayarla (örneğin, tablo malzemelerin) fırtına için uygun bir boya ile konjuge bir Oligonükleotid sonda ile melezleşmiştir emin olun.</li>
	<li>(Bkz. Adım 5,4) örnekleri (çözüm oldukça viskoz) kabarcıklar nesil kaçınırken Oligonükleotid probları içeren 50 µL hibridizasyon arabelleği askıya.</li>
	<li>Örnekleri gece karanlıkta 30 ° C sıcak bir blok üzerinde bırakın. Not: Bu örnekleri 6 ay 4 ° C'de depolanmış olabilir</li>
</ol>
6. çamaşır
<ol>
	<li>Görüntü için her örnek için bir yeni microcentrifuge tüp kullanın. 1 mL yıkama arabellek ekleyin.</li>
	<li>10-15 µL melezleşmiştir örneklerinden yıkama tamponu ve mix/girdap içeren yeni tüp ekleyin.</li>
	<li>Pelet hücreleri tarafından 7 dakika aralıklarla, 750 x g 4 ° C'de Süpernatant kaldırın. Not: arka plan azaltmak için 30 ° C'de 1 h için kuluçkaya</li>
	<li>İki kez daha fazla yıkamak (1 mL yıkama arabellekte resuspend, santrifüj kapasitesi ve Pelet kaldırın).</li>
	<li>25 µL yıkama arabellekte resuspend. Not: bir fotoğraf beyazlatma azaltmak için yıkama arabelleğe tek molekül Floresans deneyler6boya kararlılığını artırmak için sistem (2,6) atma bir oksijen ekleyebilirsiniz.</li>
</ol>
7. görüntüleme için örnek hazırlanması
Not: Hücreleri floresan ve faz kontrast mikroskop altında uygun görüntüleme izni vermesi için immobilize gerekir. Hangi bakış farklı alanları farklı odak uçaklar yansıma örnekleri hazırlamak için aşağıdaki yöntemleri kullanılabilir.
<ol>
	<li>Özel jel hazırlık
	<ol>
		<li>150 mg özel 10 mL 2 x SSC arabelleğe ekleyin. 2 eklemek değil x SSC için özel, ya da o değil düzgün dağıtılması.</li>
		<li>Mikrodalga fırında 10-15 s her zaman-e kadar büyük kabarcıklar oluşmaya başlar. Birkaç dakika soğuması için bir kenara koyun.</li>
		<li>Böylece slaytın Merkezi maruz kalır ayıran bir silikon çerçeve slayt üzerinde yer.</li>
		<li>Bir 10 mm çapında (1-2 mm kalınlığında) katı halka slaytın ortasına yerleştirin ve jel küçük bir miktar, sızdırmazlık için mevduat. Sertleşmesine o için birkaç dakika bekleyin.</li>
		<li>Yüksek kubbe şekli kurdu kadar daha jöle ekleyin. Sertleşmesine bunun için 10 dakika bekleyin ve (iyi cımbız veya başka bir yöntemi kullanarak) yüzük kaldırın.</li>
		<li>(Bkz: 6.5) yıkanmış bakteriyel hücre jel ve mühür #0 coverslip slayt ile ~ 10 μL Kasası.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odası numune hazırlama smFISH için
	<ol>
		<li>Alternatif olarak (için adım 7.1) örnekleri (bkz: 6.5) yıkanmış bakteri hücreleri Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekleri immobilizing tarafından görüntüleme için hazır olun.</li>
		<li>Karanlık gecede görselleştirme hücre yüzeyine yapışma sağlamak için önce oda sıcaklığında örneklerinde kuluçkaya. Görselleştirme daha önce bir kez yıkama arabellek ile yıkayın (. 5); smFISH (2,6) için yıkama buffer(2.5) veya görüntüleme arabellek ile ıslak örnek tutmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fırtına için odası numune hazırlama
	<ol>
		<li>Örnekleri fırtına için Poli-D-lizin-kaplı cam alt tek kullanımlık plastik petri yemekler üzerinde görüntüleme için hazır olun.</li>
		<li>Örnekleri, RT, karanlık gecede kuluçkaya. Görselleştirme yıkama daha önce bir kez ile yıkama arabellek için smFISH (2.5); ve görüntüleme arabellek fırtına (2.7.5) ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8.Transkript görselleştirme
<ol>
	<li>Görüntü hücre motorlu bir sahne ile donatılmış geniş alanlı floresan mikroskop ile (malzemelerin tabloya bakın). Not: Bir boya ile floresan emisyon birden fazla döngüleri yetenekli etiketli hücreleri fırtına değiştirilmek üzere kullanın. 3D süper çözünürlük görüntüleme sistemi kullanarak örnek resim (örneğin, malzemelerin tabloya bakın).</li>
	<li>(Önerilen) kullan bir 60-100 x N.A &#62; 1.3 yağı daldırma faz kontrast objektif lens cıva veya metal halide lamba; gibi güçlü bir ışık kaynağı ile LED tabanlı ışık kaynakları da önerilir.</li>
	<li>Bir standart soğutmalı CCD kamera, ideal olarak düşük ışık düzeyi görüntüleme hızı (biz kullanmak yerine bir kamera ile 16 µm piksel boyutu) için optimize edilmiş kullanımı (malzeme tabloya bakın). Not: Kullanım bir soğutulmuş EMCCD (elektron birleştiğinde şarj cihaz çarparak) kamera CCD kamera algılama, özellikle tek moleküllerin engeller termal gürültü azaltmak gereklidir.</li>
	<li>Filtresi kullan seçilen fluorophores için uygun ayarlar.</li>
	<li>Düzgün hücre sınırlarını belirlemek için her örnek faz kontrast optik ile veya dış hücre membran fluorescently etiketleme görünümünde farklı alanları görüntülerini elde etmek. Görüntüleri tüm kanallar için farklı odak uçaklar (z-yığın), (genellikle 13 dilimleri ayırarak tarafından 250 nm alınır). Not: Mikroskop ve filtre setleri, motorlu sahne ticari tarafından kontrol edilmelidir (malzemelerin tabloya bakın) ya da bir yığın görüntülerin sırayla yakalayabilir şirket içi bilgisayar yazılımı.</li>
</ol>
9. veri analizi
<ol>
	<li>Görüntü yığınları veri analizi için uygun bir biçime dönüştürme.</li>
	<li>Hedef kopya sayısını tahmin mRNA floresan foci hücrede toplam yoğunluğunu, yerine ayrık 'noktalar' şu anda mevcut diğer iletişim kuralları olduğu gibi sayma.</li>
	<li>Görüntü analizi ile açık kaynak yazılım18 veya özel olarak oluşturulmuş bir program ile yerine getirir. Veri ayrıntıları için bkz: görüntüleme ve analiz Skinner vd. 7</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+biology.">Noise in biology.</a> Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).</li><li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli.">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li><li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+post-transcriptional+regulation+on+phenotypic+noise+in+Escherichia+coli.">Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).</li><li>van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Spatial+Organization+of+mRNA,+Plasmids,+and+Ribosomes+in+a+Bacterial+Host+Overexpressing+Membrane+Proteins.">On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins.</a> PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), (2010).</li><li>Skinner, S. O., La Sep&#250;lveda, ., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization.">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li><li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+DNA-RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+to+study+X+chromosome+inactivation+in+differentiated+female+mouse+embryonic+stem+cells.">Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells.</a> J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).</li><li>Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+imaging.+Spatially+resolved,+highly+multiplexed+RNA+profiling+in+single+cells.">RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.</a> Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).</li><li>van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+messengers:+An+update+and+outlook+on+RNA+visualization+in+bacteria.">Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria.</a> Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).</li><li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA.">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li><li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome.">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> Elife. 5, 1-22 (2016).</li><li>Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+Endogenous+mRNA+Using+RNA-Based+Fluorescence+"Turn-On"+Probe.">Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe.</a> ACS Chem. Biol. , (2016).</li><li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria.">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).</li><li>Golding, I., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8+Spatiotemporal+Dynamics+in+Bacterial+Cells:+Real-Time+Studies+with+Single-Event+Resolution.">Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution.</a> Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).</li><li>So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli.">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).</li><li>Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+Escherichia+coli+nucleoids+reveals+highly+structured+and+asymmetric+segregation+during+fast+growth.">Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth.</a> J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).</li><li>Sliusarenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbetracker+software.">Microbetracker software.</a> Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).</li><li>Arbel-Goren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+degradation+and+noise+of+small+RNA-controlled+genes+in+a+switch+activated+network+in+Escherichia+coli.">Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).</li><li>Brandt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-state+stabilization-change+mechanism+for+proton-pumping+complex+I.">A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

E. coli hücrelerdeki smFISH yöntem2kullanarak farklı genler transkript sayısı bizim laboratuvar olarak ölçülen var. Kısacası, bu yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: hücre fiksasyon, membranlar sonda penetrasyon için izin vermek için permeabilization sonda hibridizasyon ve örnek bir standart floresan mikroskop kullanarak görüntüleme. Bu yordam önceden yayınlanmış olanlar bazı değişiklikler6,7,</s...

Stochasticity gen ifadesinin temel ve kaçınılmaz bir unsuru ve hücre-hücre heterojenite1, transkriptler ve proteinler2,3düzeyinde hem de açmaktadır. İyi tanımlanmış koşullar altında hücreler arasında değişkenlik miktarının benzersiz bir pencere gen ekspresyonu ve onun yönetmelik altında yatan temel işlemleri halinde sunmaktadır. Bakterilerde hücre-hücre heterojen bir önemli kaynağı transkripsiyon düzeyinde gerçekleşir. Transkript numaraları sadece stochasticity transkripsiyonu, aynı zamanda düzenleme gibi çoğu işlemleri nedeniyle küçük RNA'ların ve RNAases2tarafından değişir. Doğrudan erişim Bu heterojenlik nicel bir moda bir fluorescently smFISH içinde belirli bir gen bireysel Tutanaklar etiketleyerek yoludur. Bu metodoloji algılama ve belirli RNA molekülleri, hücre altı yerelleştirme sabit, bireysel bakteri hücreleri4sağlar. mRNA'ların seçmeli olarak faiz5,6transkript bağlamak için tasarlanmış fluorescently etiketli ~ 20 Bankası-uzun oligonucleotides bir dizi melezleşmiştir. Birden çok etiket yukarıda arka plan Floresans algılama sağlar ve bireysel mRNA molekülleri kırınım-sınırlı noktalar bir floresan mikroskop altında7 (bkz: şekil 1) olarak görünür. MRNA molekülleri, tamamlayıcı oligomer probları ikincil fluorescently etiketli muhabir teknikleri8kullanarak algılanır konjuge anhidridler (örneğin, biotin veya digoxigenin) taşımak etiketleme için diğer yaklaşım vardır.
Tutanaklar, ek olarak smFISH hakkında kantitatif bilgi başka yöntemleri de vardır. Kuzey gibi bazı leke veya kantitatif PCR, toplu yoklama ve böylece ne mRNA kopya sayısı ne de tek tek hücreler içindeki konumlarını ölçebilirsiniz. Bu nedenle bu yöntemler hücre hücre değişkenlik ölçmek uygun değildir. Hata-sağlam Floresans in situ hibridizasyon (MERFISH) hem RNA'ların kopya numarası hücrelerindeki hem de denilen hücre içi konumlarını miktar multiplexed için izin veren bir son görüntü tabanlı teknik geliştirilmiştir. MERFISH tanımlanmış bir arada sabit sayıda Oligonükleotid fluorescently etiketli sonda gelen oluşan benzersiz bir barkod atama temel alır. Bu barkodları smFISH ölçümleri sıralı tur olarak okunduğu, photobleaching ile hibridizasyon, böylece artan işlem hacmi iki büyüklük9,10tarafından aşağıdaki her yuvarlak. Bu teknik bir otomatik akışkan sistemi ve sonda kümesinin uygun tasarım gerektirir.
Birden çok floresan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)11gibi roman süper çözümleme teknikleri ile birlikte bireysel transkript etiketlerine göre ile birlikte çözünürlükte panolarında bir artış sağlar transkript hücre altı lokalizasyonu. FIRTINADA, Floresans emisyon (yanıp sönen) prob molekül başına birden fazla döngüleri için uygun kombinasyonu floresan problar ve görüntüleme arabellek sağlar. Fırtına da E. coli transcriptome görüntü ve aynı anda transkriptlerinizin faiz12etiketleme tarafından RNA, genom çapında mekansal organizasyonu gözlemlemek için kullanılabilir.
Yukarıda gözden tüm tek hücreli yöntemleri sabit hücrelerdeki transkript görüntüleme üzerinde temel alır. Bu nedenle, onlar transkript hücrelerdeki Kinetik özelliklerinin ile ilgili herhangi bir bilgi vermeyin. Transkript canlı hücreleri13izlemek için mRNA'ların ilgi siteleri bağlama, bir dizi gen füzyonu tarafından etiketli. Bu ikinci o zaman bakteriyofaj gibi yeşil flüoresan protein (GFP)10,14,15floresan bir protein için erimiş MS2 kat protein gibi bir RNA-bağlayıcı protein tarafından tanınır.
Burada DNA probları fluorescently etiketli smFISH deneyler, kullanmak için bir dizi bireysel mRNA'ların özellikle E. colietiketleme yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, aynı etiketleme şeması fırtına ölçümleri ile küçük değişiklikler için kullanılan gösterir.

<table><tbody><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute</td><td>Mallinckrodt Baker - Avantor</td><td>8025.25</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 20X SSC</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 10X PBS</td><td>Life Technologies/Ambion</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>nuclease-free water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide, nuclease free</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753-500UN</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA (50mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM</td><td>New England Biolab</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine and oxygen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-fucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8150</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td><td>Life Technologies</td><td>V2286</td><td></td></tr><tr><td>Agarose,low melting reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A2-2.0&lt;span&gt; &lt;/span&gt;666208</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Super life nitrile powder free examination gloves</td><td>Supermax</td><td>TC-N-9889</td><td></td></tr><tr><td>Brand sterilization incubator tape</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR61750</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.8 ml)</td><td>Axygen - Corning Life Sciences</td><td>MCT-175C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 5 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 10 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (Corning 25 ml)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer cuvettes</td><td>Sarstedt</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 0.2 - 20 &amp;mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT20</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 10 - 200 &amp;mu;l</td><td>Axigene/corning</td><td>TF-200</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 100 - 1000 &amp;mu;l</td><td>FroggaBio</td><td>FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free pipette tips 100 - 1000 &amp;mu;l</td><td>Sorenson</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Syringe disposile 10 mL needle G-21</td><td>Becton Dickinson, Biosciences</td><td>BD-309643</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.2 um Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534 K</td><td></td></tr><tr><td>Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc</td><td>Nikon</td><td>MXA20233</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides 76 x26, 3&quot;x1&quot;x1mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>421-004ET</td><td></td></tr><tr><td>#0 coverslip slide 24x60</td><td>Thermo Fisher Scientific/Menzel</td><td>BNBB024060A0</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>M.R.C</td><td>TOU-50</td><td></td></tr><tr><td>Hot block</td><td>M.R.C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fried Electric Company</td><td>G-560-E</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>4-000-501-I</td><td></td></tr><tr><td>OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer</td><td>Midsci</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>iXon X3 EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td> </td></tr><tr><td>Eclipse Ti microscope</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td> </td></tr><tr><td>CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td> </td></tr><tr><td>Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP</td><td>Nikon</td><td>49005</td><td> </td></tr><tr><td>Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P</td><td>Nikon</td><td>49009</td><td> </td></tr><tr><td>Nis-elements AR auto reaserch software</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td> </td></tr><tr><td>STORM microscope</td><td>Vutara</td><td>SR-200</td><td> </td></tr><tr><td>NA 1.2 water immersion objective&lt;span&gt; &lt;/span&gt;</td><td>Olympus</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>SRX image acquisition and analysis software</td><td>Vutara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 512 EMCCD camera</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&amp;reg; FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor&amp;reg; Red 590 Dye</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Probe Sequence for galK mRNA:&lt;/strong&gt;</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>Stellaris&amp;reg; FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor&amp;reg; Red 670 Dye</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td>SMF-1083-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Probe Sequence for sodB mRNA:&lt;/strong&gt;</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttttttctttcagactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tagccaaatgcgttggcaaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctgaatggtgtgagtggcag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caccaatcaaattcacgcgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgaaaccgtcgttgtagtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgataatcaatcgcgcaggg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtggtgcacaactgatcacg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acgcgaactttacggtcatc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gctgattttcataatcggct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcatcgagggaaaactcgtc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gttttcatgtgcgacaatgg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cacgccacgaacgtagttag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttacgcagttgcagatgttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tccagtgaagcggaagaact</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgctgcaatacggttccgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtccagcggcagatgataaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgaccgttaagcgcgatttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>agcctacaaactggttttct</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gcggaaattagctgatccat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>aaggcatgatctttcttgcc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>cagtgagcggcaatcgatca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgggcatggaaactgctttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gatgatgacgacagccacac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gggtacgtttgaagttactg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtgttgtattcgctgccaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggtttcgcactgttcacgac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tggctgctggaagaaacgcg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttcaatggtgacatcacgca</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>catgcgcaacagcgttgaac</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggcgttttcagtcagtatat</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atacgtttcaggtcgccttg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>tgagactccgccatcaactc</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gaaatcatcgcgcatagagg</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>caatttgcggcacggtgatt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ttgacgatttctaccagagt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>acctttgtcgccaatcacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ggatcagcgcgacgatacag</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>atattgttcagcgacagctt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>gtctctttaatacctgtttt</td><td> </td><td> </td><td></td></tr><tr><td>ctccttgtgatggtttacaa</td><td> </td><td> </td><td></td></tr></tbody></table>

method for labeling transcripts in individual escherichia coli cells for single-molecule fluorescence in situ hybridization experiments

Bir yöntem bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için sabit bakterilerde etiketleme için tanımlanır. smFISH mRNA kopya numarası ilgi genlerin hücre hücre değişkenlik ölçümü transkriptleri hücre altı konumunu sağlar. Ana adımları bakteriyel hücre kültürü fiksasyonu, hücre zarları permeabilization ve hedef transkript hibridizasyon setleri ile piyasada kısa Oligonükleotid fluorescently etiketli probları vardır. smFISH farklı floresan işaretleri arasında spektral örtüşme tarafından uygulanan sınırlamaları ile aynı hücrede birden çok gen transkript görüntüleme izin verebilirsiniz. Aşağıda resimli Protokolü tamamlanmasını takiben, hücreleri kolayca düşük yoğunluktaki floresan için uygun bir fotoğraf makinesi ile birleştiğinde bir mikroskop kullanarak yansıması. Bu görüntüler, segmentasyon faz kontrast kare veya hücre zarı boyama, elde edilen hücre dağılımları ile birlikte mRNA kopya numarası dağıtım örneği açık kaynak veya özel olarak yazılmış yazılım kullanarak hücre hesaplama sağlar. Burada açıklanan etiketleme yöntemi Ayrıca resmi transkript Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) ile uygulanabilir.

Biz smFISH ölçümleri galK ve sodB transkript E. coli hücrelerdeki yürüttü. Transkript belirli dizileri için hedef sıra, floresan molekülünü Birleşik her sonda tamamlayıcı bir dizi melezleşmiştir (malzemelerin tabloya bakın). Floresan ve faz kontrast görüntüleri MG1655 vahşi-tip e.coli suşu (WT) veya bir JW0740 (Keio koleksiyon)19 galK silinmiş yük (ΔgalK) 2 mm D-fucose şekil 1A ve <...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments at JoVE.com

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

method-for-labeling-transcripts-individual-escherichia-coli-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

8.2K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science. Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Video: Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genetik

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Biyokimya

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

<meta charset="utf8"></head><body>smFRET-TIRF Çalışmaları için RNA'ların Çift Renkli Uç Etiketleme ve Vezikül Kapsüllenmesi

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their conformational changes over time. To monitor RNA dynamics with smFRET, we developed a method to covalently label RNAs at their termini with a FRET pair of fluorophores. This direct end-labeling strategy targets the 5&#39;-phosphate by carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) activation and the 3&#39;-ribose by periodate oxidation, which can be adapted to other RNAs regardless of their size and sequence to study them independently of artificial modifications. Furthermore, the 5&#39;-EDC/NHS activation is of general interest to all nucleic acids with a 5&#39;-phosphate. The use of commercially available chemicals eliminates the need to synthesize RNA-specific probes.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy requires the surface-immobilized molecules of interest to be within the evanescent field to be illuminated. A sophisticated way of keeping the RNA molecules within the evanescent field is to encapsulate them in phospholipid vesicles. Encapsulation benefits from the best of both worlds, tethering the molecule to the surface while enabling free diffusion of the molecule. We ensure that each vesicle contains only a single RNA molecule, enabling single-molecule imaging. Upon dual-end labeling and encapsulation of the RNA of interest, smFRET measurements offer a dynamic and detailed view of RNA behavior.

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

This article describes the dual-color labeling of long RNAs at termini positions and their surface immobilization via encapsulation in phospholipid vesicles for single-molecule FRET TIRF microscopy applications. Combining these techniques enables precise visualization and analysis of RNA dynamics at the single-molecule level.

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Biyoloji

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz