Bu araştırma hibe GM046406 (DB) tarafından ve Sayısal Biyoloji Genel Tıp Bilimleri Merkezi (GM071508) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. RSM NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu fon kabul eder. MNM bir Lewis-Sigler Bursu tarafından desteklenmektedir. Biz metabolik döngüsü projeye katkılarından dolayı yararlı tartışmalar ve eski üyeleri Allegra Petti ve Nikolai Slavov için Botstein laboratuar üyeleri kabul etmek istiyorum. Biz bize FISH yöntemi ile başladı almak için Daniel Zenklusen ve Robert Singer teşekkür ederim.

Şekiller 1 ve 2, FISH deney prosedürleri ve FISH görüntü ölçülmesi için kullanılan bir görüntü analiz boru hattı arasında şemalardır. 1. Hazırlanır Çözümler Aşağıda * çözümler Singer probları ile kullanım içindir. Stellaris sondalar kullanıyorsanız, Hibritleşme Tampon ve Yıkama Tampon hem de &quot;% 10 formamid&quot; ile &quot;% 40 formamid&quot; değiştirin. Hibridizasyon Tampon ek değişiklikler Stellaris problar kullanılarak (1) 1 g Dekstran Sülfat ekleyin ve (2) 10 mg ssDNA içermez bulunmaktadır. Tampon B 8 ml 1 M KH 2 PO 4 41.5 ml 1M K 2 HPO 4 Sorbitol 109.3 g Spheroplasting Tampon 890 ul Tampon B 100 ul VRC 10 ul 25.000 U / ml Lyticase 2 ul β-merkaptoetanol &lt;Güçlü&gt; hibridizasyon tamponu (10 mL, nihai hacim) 10 mg E. coli tRNA 10 mg ssDNA * 100 ul 200 mM VRC stok 50 mg / ml BSA, 40 ul 1 mi 20X SSC 4 ml% 40 Formamid * Nükleazlar su (10 ml nihai hacme kadar) 1 g Dekstran Sülfat &#39;* * Melezleme tamponu kolaylık sağlamak için -20 ° C&#39;de 0.5 ml alikotları muhafaza edilebilir. (50 mi, nihai hacim) tampon yıkaması 5 ml 20X SSC 20 mi% 40 Formamid * Nükleazlar su (50 ml nihai hacme kadar) Tampon Etiketleme 1.06 gr sodyum karbonat 100 ml su DEPC pH 9&#39;a 2. Probe-etiketleme (Singer Sondalar Sadece) Biz, bir ABI oligonükleotid sentezi aygıtı kullanılarak içi sentez ile elde edilir, bu problar. Typicortağı, 4-5 ~ 50 bp oligonükleotidler, tercihen 10, en az 8 + bp aralıklı birkaç thymidines, amino-alil timidin yerine, ilgilenilen genin homolog olduğu sentezlenir. CY boyalar kullanırken Çünkü ozon onların duyarlılık, biz bir ozon-free çalışır. <ol><li> ~ 5 prob elde ve 100 ul suda tekrar süspansiyon - Nanodrop üzerinde kontrol konsantrasyonları. </li><li> Kaç prob / gen, 10 mg oligonükleotid / geninin toplam birleştirmek bağlı olarak (örneğin 5 prob / gen, daha sonra 2 mg / prob istiyorsanız varsa). </li><li> QIAquick Nükleotid Kazıma Seti Protokole göre problar arındırmak için QIAquick sütunları kullanın. </li><li> Tampon PN Birleştirilen prob ve karışım hacmi toplam 10 hacim ekleyin. </li><li> QIAquick sütuna örnek uygulama - toplam hacmi 750 ul büyükse, her spin hacim yarısını kullanarak iki kez aşağı doğru döndürün </li><li> 1 dakika bekletin. </li><li> 6,000 rpm&#39;de 1 dakika santrifüj. </li><li> 750 ul Tampon PE ile yıkayın. </li><li> Santrifüj6,000 rpm&#39;de 1 dk. </li><li> Kuru 13.000 rpm&#39;de 1 dakika akışı ve yeniden spin kolon atın. </li><li> H 2 O pH 7.0 ve 8.5 içinde ve membran doğrudan yerleştirildiğinden emin olun - yeni mikrosantrifüj tüp ve 50 ul H 2 O ile Zehir DNA yerleştirin QIAquick sütun. </li><li> 1 dakika bekletin. </li><li> DNA Zehir 13.000 rpm&#39;de 1 dakika santrifüj. </li><li> 45 ° C&#39;de DNA&#39;nın Lyophilize </li><li> Yeniden süspanse 10 ul tampon içinde etiketleme pelet ve boya dokunmadan boya tüp ekleyin. </li><li> Başka bir 10 ul etiketleme tamponu ile tekrarlayın. </li><li> Vortex ve boya ve DNA tüp aşağı doğru döndürün. </li><li> Alüminyum folyo ile tüpler kapak ve etiket RT O / N karanlıkta tutmak. </li><li> QIAquick Nükleotid Kazıma Seti Protokolü tekrarlayın. Iki fark ile gerçekleştirin: - Sensörler için 200 ul PN tampon ekleyin ve sütunlar 2x ile etiketli probları koydu. - Elüsyon önce herhangi bir serbest boya aşındırmak için tampon PE ile 3 yıkar gerçekleştirin. </li><li> After elüsyon Nanodrop ile konsantrasyonu elde. Etiketleme verimliliği genellikle tek iplikli DNA ~ 0.25 pmol / ng. </li></ol> 3. Lamel Hazırlık <ol><li> Plazma-kendine çeki düzen vermek vakum odası (slaytlar yer lamelleri <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (daha merkeze yakın). </li><li> Mikrodalga vakum odası koyun ve kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Pompa açın ilk önce pompa çalıştırıldığında sadece bir kez vakum açın. </li><li> Mikrodalga açın ve plazma görünür sonra 5 saniye dur. </li><li> Pompa daha sonra vakum kapatın. </li><li> Vakum odası çekin ve forseps (düşmüş olanlar tekrar temizlenmesi gerekir) ile lamelleri çıkarın. </li><li> Sıra 12-kuyucuğu temizlenir tarafı yukarı lamelleri. </li></ol> 4. Tespit Prosedürü <ol><li> Asgari medya etrafında 0.1-0.2 bir OD 600 maya büyütün. Hücreler, 10 ml kadar FO verimlerir ~ 10 ayrı döllemeler. </li><li> Büyüme ortamı (kültür 10 ml +, 1 ml% 37 formaldehit) ile doğrudan 1/10 hacim% 37 formaldehid ilave edin ve 45 dakika bekletin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp (1 dakika 13.000 rpm dönüş olabilir) 1 ml buz Tampon B ile 2x yıkayın. </li><li> Spheroplasting tampon 1 ml ilave edilir. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. En hücreleri (yani faz-parlak değil) siyah kadar hücreleri mikroskop altında birkaç dakikada kontrol edin. </li><li> Düşük hızda (~ 3500 rpm) iplik, buz Tampon B ile 2x yıkayın. </li><li> ,% 70 EtOH 1 ml ekleyin yavaşça tekrar süspansiyon ve 4 gece bekletin ° C (-20 ° C&#39;de süresiz saklayabilirsiniz). </li></ol> 5. Hibridizasyon Prosedürü <ol><li> , Hibridizasyon çözeltisi hazırlayın: hibridizasyon tamponu 100 ul, daha sonra prob 1-3 ul, girdap ve santrifüj ekleyin. Şarkıcı prob prob set başına 8-10 ng toplam (yani başına gen) kullanın. Biz 3 dif aynı anda 3 genler kadar görüntülü varlara etiketli prob ayarlar. </li></ol> Açmadan önce oda sıcaklığına hibridizasyon çözüm ısıtmak için emin olun. Stellaris probları için, 1 ul 1:10 her 1:20, 01:50 ve bir iyi olduğunu görmek için prob 1:100 çalışma seyreltme ekleyerek 4 ayrı hibridizasyon reaksiyonları başlatmak için önerilir. Stellaris probları çalışma seyreltileri hibridizasyon tamponu içinde hazırlanmıştır. <ol start="2"><li> Santrifüj (sonraki tüm adımlar için, 3.500 rpm, 5 dakika) sabit hücreler (örneğin 200 ul) ve etanol uzak aspire. </li><li> Yavaşça hibridizasyon tamponu ile aynı oranda formamid içeren 1 ml yıkama tamponu tekrar süspansiyon. 2-5 dakika bekletin. </li><li> Örnek ve aspirat yıkama tamponu santrifüj, ardından hibridizasyon solüsyonu ekleyin. Nazik çalkalama ile karanlıkta inkübe, 37 O / N ° C </li></ol> Not: aşağıdaki yordamı lamelleri / görüntüleme hücreleri uygulamak içindir. Wgörmek alternatif reaktif oksijen türleri tutucu çözümü de dahil olmak üzere 96-tabak, içinde / görüntüleme hücreleri külleme <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> Ertesi gün, ya da önceden, temiz (prosedür) ve 5 dakika boyunca 150 ul% 0.01 Poli-L-lisin ile kapak slipleri tedavi. Aspire, dH 2 O ile 3x yıkayın ve kurumaya bırakın, kurumaya bırakın. </li><li> Sabah, numune, yıkama tamponu 1 ml yavaşça tekrar süspansiyon, santrifüj ve aspire, sonra 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de yıkama tamponu ve inkübe başka bir 1 ml süspansiyon haline getirin. </li><li> 2X SSC +% 0.1 çalkalayıcıda oda sıcaklığında Triton X-100, 15 dakika ile yıkayınız. </li><li> Bu montaj önce RT gelip izin dondurucu orta dışarı montaj atın. </li><li> Çalkalayıcı RT 15 dk 1X SSC ile yıkayın. </li><li> PBS (0.1 ug / ml nihai) ve 150 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri içine DAPI seyreltilir. </li><li> Temizlenir / poli-lys-Trea üzerine yer çözümü12-plaka ted kapak fişleri; en az 30 dakika rahatsız. </li><li> Çözüm çıkarın (bir yedek olarak yedek bir kapak kayma yerleştirin olabilir) ve 1 ml 1X PBS ile 3x yıkayın. </li><li> Bir slayt (Invitrogen P36934) üzerine Altın montaj orta uzatmak 3 ul yerleştirin. Eğer orta montaj kurumasını önlemek için birden fazla kapak fişleri varsa bir zamanda bu birini yapın. </li><li> Cımbız ile tutarak 12-plaka lamel ~ 0.5 ml etanol ekleyin, kuru kapak kayma ve hava çıkarın. </li><li> Orta montaj üzerine kayma hücre tarafı kapağını aşağı ve karanlıkta sertleşmesine birkaç saat ya da O / N izin yerleştirin. </li><li> Oje ile kenarları mühür ve görüntüleme geçin. </li></ol> 6. Olympus IX-81 Ters Mikroskop Genel Bakış Hücre Görüntüleme <ol><li> Görüntü elde etmek için biz Slidebook (akıllı-imaging.com) yazılımı ve 100X, 1.45 NA, TIRFM yağ objektif kullanmaktadır. Chroma filtre setleri (reaktif bakınız): Seri GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 ve Cy5 görüntüleme için. </li><li> DAPI filtre kullanınbulmak ve hücreler odaklanmak. </li><li> Referans noktası olarak bu ayarlayın. </li><li> Toplam mesafe 0.2 mcM boyutu (25 uçakları) ile 5 mcM olan referans noktasının çevresinde görüntülerin bir z-yığını alın. Her boya kanal (yani her sonda seti) için tekrarlayın. </li><li> Görüntü analizi için bir 16-bit TIFF olarak ihracat. </li></ol> 7. Görüntü Analiz Genel Bakış (Singer Sondalar) Aşağıda biz MATLAB FISH görüntüleri analiz için kullanılacak hesaplama yöntemleri bir taslak sağlar. Kullanılan ilgili MATLAB fonksiyonları sağda parantez vardır. Algoritmalar ve eşikleri şu anda Singer tarzı problar veri için ayarlanmış. Stellaris tarzı problar kullanılarak özellikle son filtreleme adım (7.8) bazı ayarlama, gerektirecektir. Hücre Tanımlama 15 <ol><li> DAPI görüntüleri 16 küresel bir eşik kullanarak arka plan ayrı hücrelere [graythresh]. </li><li> Genişletilmiş maksimum fonksiyonu [im kullanarak çekirdekleri tanımlamakextendedmax]. </li><li> Bir havza algoritması için tohum olarak çekirdekleri kullanarak Bölüm hücreleri [havza]. </li></ol> Her bir floresan kanal noktaları bulmak <ol start="4"><li> Arka plan normalleştirmek ve gürültü oranı sinyal geliştirmek için tophat dönüşüm yapın [bwmorph]. </li><li> Her nokta için in-odak katman (z-düzleminde) tanımlamak için maksimum bul [imregionalmax]. </li><li> Bir radyal degrade için doğrusal bir uyum modeli kullanılarak potansiyel noktalar Filtre. </li></ol> Tedbir nokta yoğunluğu ve filtre tek vs çoklu yoklama sinyalleri <ol start="7"><li> Önceden tanımlanmış in-odak tabakası ve tahmin yoğunluğu 17 noktaya bir 2D Gauss profile uyan. </li><li> Bir eşik (histogram dayalı) kullanarak zayıf noktaları filtre. Şarkıcı tipi problar için bu önemlidir, ama Stellaris problar için daha az böyledir. </li><li> Her hücrede noktalar sayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+Detection+of+Rna-DNA+Hybrid+Molecules+in+Cytological+Preparations.">Formation and Detection of Rna-DNA Hybrid Molecules in Cytological Preparations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 63, 378 (1969).</li><li>Jones, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+and+Nuclear+Location+of+Mouse+Satellite+DNA+in+Individual+Cells.">Chromosomal and Nuclear Location of Mouse Satellite DNA in Individual Cells.</a> Nature. 225, 912 (1970).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+cycling+in+single+yeast+cells+from+unsynchronized+steady-state+populations+limited+on+glucose+or+phosphate.">Metabolic cycling in single yeast cells from unsynchronized steady-state populations limited on glucose or phosphate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6946-6951 (2010).</li><li>Trcek, T., Larson, D. R., Moldon, A., Query, C. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mRNA+decay+measurements+reveal+promoter-+regulated+mRNA+stability+in+yeast.">Single-molecule mRNA decay measurements reveal promoter- regulated mRNA stability in yeast.</a> Cell. 147, 1484-1497 (2011).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Gandhi, S. J., Zenklusen, D., Lionnet, T., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+functionally+related+constitutive+genes+is+not+coordinated.">Transcription of functionally related constitutive genes is not coordinated.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 27-34 (2011).</li><li>Itzkovitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+transcript+counting+of+stem-cell+markers+in+the+mouse+intestine.">Single-molecule transcript counting of stem-cell markers in the mouse intestine.</a> Nature Cell Biology. 14, 106-U193 (2012).</li><li>Raj, A., Rifkin, S. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+gene+expression+underlies+incomplete+penetrance.">Variability in gene expression underlies incomplete penetrance.</a> Nature. 463, 913-U984 (2010).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472 (10), 365-386 (2010).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tlreshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Tlreshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22, 4447-4459 (2011).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9, 743-U159 (2012).</li><li>Levsky, J. M., Shenoy, S. M., Pezo, R. C., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+profiling.">Single-cell gene expression profiling.</a> Science. 297, 836-840 (2002).</li><li>Wyart, M., Botstein, D., Wingreen, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Gene+Expression+Dynamics+Using+Pairwise+RNA+FISH+Data.">Evaluating Gene Expression Dynamics Using Pairwise RNA FISH Data.</a> Plos Computational Biology. 6, (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının var beyan ederim.

Bugüne kadar, BALIK öncelikle düşük verimli yöntem olmuştur. Cy3, Cy3.5 ve Cy5 boyaların kullanımı bir anda üç tek hücrelerde araştırabilirsiniz genlerin sayısını sınırlar. Bazı ek problar geliştirilmiştir (Stellaris) ama ayırt prob sayısı hala en yedi yer almaktadır. Bu sınırlama aşmak için, birden fazla fluorophores kullanarak kombinasyon etiketleme stratejileri farklı mRNA türleri 19,20 için barkod oluşturmak için kullanılmıştır. En son, Lübeck ve Cai tek maya hücreleri 19 FISH ile eş zamanlı olarak 32 farklı türler ölçmek için optik ve spektral barkod kullanılır. Bu son Kombinatoryal yaklaşımın bir sınırlama süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımını gerektirir. Barkodlu probları ayırt etmek için gerekli analiz de oldukça karmaşıktır. Biz, Cy3 ve Cy3.5 FISH deneyleri için Cy5 tercih olduğunu bulduk. Cy5 boya sınırlamaları biri de duyarlılığı olanphotobleaching için. Ancak, Stellaris son zamanlarda photobleaching karşı daha dayanıklı olarak ilan edilir Cy5 türevleri geliştirdi, ve bu teknik sorunu hafifletmek olabilir. Ticari problar için fiyatları gelecekte azalması gerektiği halde, prob set başına $ 1,000 - Ayrıca bu BALIK dikkati çekiyor uygulamak için pahalı bir yöntemdir ve Singer ve Stellaris hem probları genellikle 700 $ mal olduğunu. Reaktifler ve verimli etiketleme koruyucu fiyat alt aralığı aşağı Singer probları getiriyor. Büyük teknik zorluklardan biri gelişmiş nokta belirleyici algoritmalarının uygulanmasını gerektirir tek veya çoklu prob noktalar, ayrılmasıdır. Bu özel deney kurulumları için görüntü analiz parametreleri ayarlamak için kapsamlı manuel yorum alabilir. Ilgili MATLAB fonksiyonları ile hesaplama boru hattı bir taslak protokol Bölüm 7&#39;de verilmiştir. Bu sorun biraz sadece var Stellaris sondaları tarafından azaltılabilir edilir<html> prob başına bir etiket. Bu nedenle, bir sinyal görmek için birden fazla prob ko gerektirir. BALIK hücre sabitleme gerektirir çünkü, zaman içinde izleme tek tek hücrelerin kolaylaştırmak değildir. Daha önce, bireysel metabolik bisiklet maya nüfus 6 gen ifadesinin dinamiklerini yeniden BALIK anlık verileri kullanılmıştır. Metabolik bisiklet önceden aç bırakılmış, sürekli kültürlerde görülmektedir, ve oksijen tüketimi nüfus-çapında bir toplu titreşimler ile karakterize edilir. Bu salınımlar oksijen tüketimi farklı aşamalarında her maya genlerinin yarısını meydana transkript genom titreşimler ile ilişkilidir. Biz metabolik bisiklet eşitlenmemiş sürekli maya kültürleri mevcut olup olmadığını belirlemek için çalıştı. Varsa, senkron nüfus anti-ilişkili olan transkript de ilişkili transkript için eşitlenmemiş tek hücre, ve tersi anti-ilişkili olmalıdır. ent &quot;zaman içinde mRNA üretiminin dinamiklerini yeniden için&gt;, gözlenen anlık veri temel davranış modeli beklenen ne karşılaştırılmalıdır. gibi ne zaman teorik sınırlamalar vardır&quot; gen ifadesi veri anlık &quot;belirlemek için kullanılabilir temel gen dinamikleri ve hangi modelleri çeşitleri 21 ayırt edilebilir. metabolik döngüsü veri, yerine doğrudan geçici salınımlar varlığını gösteren için, istatistiksel ölçümler toplu mikroarray ile uyumlu bir hücre özerk salınım programı gerçekten var olduğunu kanıtlamak için uygulanmıştır ölçümleri.

Toplu ölçüm teknikleri kullanarak, bu tahlil tek hücre içinde 1 transkriptleri veya transkripsiyonel aktivitesinin sayısını mümkün değildir. Gen ifadesinin gazetecilere gibi ilgi rehberleri tarafından yönlendirilen floresan proteinleri kullanarak bir ölçüde bu sorunu gidermek, ancak kat floresan proteinleri için gerekli zaman erken dinamikleri gizler olabilir. Uzun ömürlü floresan proteinleri de mRNA yaşam rapor edemez. FISH yöntemi ve tek molekül çözünürlüğe sahip, çekirdekte transkripsiyon başlangıcından itibaren tek bir hücre içinde daha sonraki olgunlaşma ve çürümeye, onun bütün ömrü boyunca tahlilinde mRNA için kullanılabilir. DNA elemanları soruşturma radyoaktif RNA prob kullanılan nükleik asitlerin görselleştirmek için yerinde deneylerde orijinal. Bu kurbağa Xenopus laevis 2 ve fare doku 3 uydu DNA yumurtalıklarda ribozomal DNA görselleştirme dahil. Yerinde exper ilk floresaniment Özellikle DNA dizilerinin 4 soruşturma için bir fluorofor ile işaretlenmiş bir RNA molekülü kullanılır. In situ RNA görselleştirmek için floresan probları ilk uygulama tavuk kas dokusu kültürü 5 aktin geni ifade görselleştirme oldu. Daha yakın zamanlarda, tomurcuklanan maya, BALIK maya metabolik döngüsü 6 sırasında transkripsiyon salınımlar araştırmak için kullanılmıştır, hücre döngüsü ilerlemesi 7 ve mitoz 8 sırasında mRNA transkript mekansal lokalizasyonu sırasında mRNA&#39;ların çürüme. BALIK daha fazlasını maya genlerinin yarısından oluşturan yapısal olarak transkripsiyonu gen bölgesi ilintisiz dalgalanmalar ilintisiz transkripsiyon başlatma 9 ortaya olduğunu göstermek için maya kullanılmaktadır. Olmayan maya türlerde, BALIK fare bağırsak 10 kök-hücre belirteçleri tanımlamak için ve hücre kaderi eksik penetrans C. Stokastik gen hareketlerinden kaynaklanabilecek olabilir belirlemek için kullanılmıştırelegans embriyolar 11. Burada anlatılan yöntem FISH mesajları mRNA&#39;ya dye-etiketli, tek iplikli DNA probları ile hibridize çalışır. Hücreler görüntülü ve mRNA bir nokta tespit algoritması kullanılarak sayılır. Tek sarmallı sondalar bir DNA synthesizer ile oluşturulan ve daha sonra etiketli (Singer probları olarak anılmaktadır) veya ön-etiketli sondalar (Stellaris probları) 12,13 olarak ticari sipariş edilebilir. Singer Stellaris problar arasındaki önemli bir fark, Stellaris sondalar (yaklaşık 20 bp) olarak Raj ve arkadaşları tarafından tarif prob başına sadece tek bir etiket ile kısa süre Singer probları daha uzundur (~ 50 bp) ve multi-etiketli olmasıdır 14. Buna ek olarak, Stellaris yaklaşım Singer (sırasıyla, gen başına yaklaşık 30 karşılık 5 sondaları) daha gen başına çok fazla sonda kullanır. Aşağıda prob ya tip kullanımını açıklayan bir protokol sağlar. Bölüm 2&#39;de, biz amino-alil timidin içeren problar w etiketleme için bir protokol sağlarseçilmiş bir Cy boya ith. MRNA&#39;ya noktaları belirlemek için gereken bilgi işlem adımlarının bir bakış Bölüm 7&#39;de verilmektedir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadyl Ribonucleoside Complex</td>
			<td>NEB</td>
			<td>S1402S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyticase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5263</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli tRNA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1010954001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03446l</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI, dilactate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9564</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X (RNase free)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shelton Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6001</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline-sodium citrate (SSC) 20X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82021-484</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (deionized)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9932</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3155</td>
			<td>For GLOX solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>150710</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylysine (0.01%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cs-18R15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Nucleotide Removal Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28304</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FISH Probes</td>
			<td>Biosearch Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Custom order for your desired mRNA sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 96-well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>265300</td>
			<td>Alternative to coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351143</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>monofunctional NHS-ester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma-Preen I Cleaner</td>
			<td>Terra Universal</td>
			<td>9505-00</td>
			<td>Controller (Cat #9505-17 optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Alcatel</td>
			<td>205SDMLAM</td>
			<td>For operating Plasma-Preen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield Fluorescence Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-UB617R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>X-Cite</td>
			<td>XCT 10-A</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Sets</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled CCD or EMCCD Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-98-24ER</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and analysis of mrna molecules using fluorescence in situ hybridization in saccharomyces cerevisiae

In situ Hibridizasyon Floresans (FISH) yöntemi bir yerli hücresel ortamda nükleik asitler algılamasını sağlar. Burada tek maya hücrelerinde mRNA sayısı ölçmek için FISH kullanmak için bir protokol sağlar. Hücreler ilgi herhangi bir durumda yetişen ve daha sonra sabit ve geçirgen yapılabilir. Daha sonra, floresan boyalar ile konjuge birden fazla tek sarmallı deoxyoligonucleotides mRNA etiket ve görselleştirmek için kullanılır. Tek mRNA moleküllerden kırınım-sınırlı floresan hücre başına mRNA sayısını belirlemek ve saymak için bir nokta algılama algoritması kullanılarak ölçülür. Kuzey benekleri, RT-PCR ve gen ekspresyonu microarrays daha standart ölçme yöntemleri toplu popülasyondaki ortalama mRNA hakkında bilgi sağlamak da, balık tek molekül çözünürlükte tek bir hücre içinde sayım ve bu mRNA lokalizasyonu hem de kolaylaştırır.

Şekil 3 BALIK görüntülerden hesaplanır ve tek hücre mevcut mRNA sayısını belirlemek için kullanılan tipik histogramlar gösterir. Mikroskopi tabanlı RNA miktar en önemli avantajı bir transkript lokalizasyonu hakkında bilgi alabilirsiniz olmasıdır. Örneğin, bir uyarılabilir CBF1 alel (Şekil 4) ile birlikte tek bir hücre içinde mRNA tanımlamak için kullanılır BALIK. Birçok mRNA moleküllerinin transkripsiyon yerinde mevcut olduğu için, biz çekirdek içinde transkripsiyon sitelerin varlığı ve konumu tespit edebiliyoruz. Farklı genler etiket mRNA için farklı boya kullanarak, bir aynı hücrelerde birden mRNA türleri ölçmek olabilir. Bunu göstermek için, maya hücreleri α-faktörü ve sorbitol mevcudiyetinde kuluçkalanmıştır. FUS1 transkripsiyon (Quasar670 boya, kırmızı) α-faktörü ile meydana gelir. STL1 transkripsiyon (Quasar 570 boya, yeşil) hücre dışı osmolaritesi artışlar tarafından indüklenir ( <strong&gt; Şekil 5). Şekil 4, Singer probları ile balık bir örnektir. Şekil 5, Stellaris probları ile FISH bir örnektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Şekil 1. FISH deneysel işlemin şematik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Şekil 2. Görüntü analiz boru hattı şematik. Son noktalar sağdaki şekilde belirlenir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Şekil 3,. Şarkıcı problar kullanarak belirli bir gen için nokta yoğunluğu Histogram </strong&gt;. Probe yoğunlukları içinde (kırmızı) ve dış (mavi) hücreleri de hesaplanır. Düşük yoğunluk noktalar gürültü ya da tek prob ya vardır. Gerçek mRNA mesajları birden fazla prob ile etiketlenir. Stellaris prob kullanıldığında, tek bir prob eşikleri ve filtreleme buna uygun olarak ayarlanmalıdır saptanabilir ve bu nedenle daha az bulunmaktadır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Şekil 4. Şarkıcı FISH prosedürünün Temsilcisi sonuçları. Bu deneyde, CBF1 transkripsiyon indüklenebilir bir promotör 18 ile aktive edilir. Çekirdekler DAPI ile mavi boyandı. CBF1 mRNA Cy3-etiketli probları ile etiketlenir. Beyaz oklar çekirdeğinde CBF1 transkripsiyon sitelerinin varlığı vurgulamaktadır. Tek mRNA transkript sitoplazma görülebilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Şekil 5,. Stellaris FISH prosedürünün Temsilcisi sonuçları. Mata maya hücreleri aynı anda 30 ng / ml α-faktörü ve 10 dakika sorbitol 0.75 M maruz kalan ve aynı anda FUS1 (Quasar 670, kırmızı) ve STL1 (Quasar 570, yeşil) transkript için probed edildi. Vurgulanan kutusunda, biz bir hücre feromon sadece yanıt (FUS1 başlangıç ​​sitesi, kırmızı) ve başka ağırlıklı olarak (yeşil, STL1 başlangıç ​​sitesi) sorbitol yanıt görebilirsiniz.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem anlatılmaktadır<em&gt; In situ</emTek-molekül çözünürlükte tek hücrelerde mRNA sayım için&gt; Hibridizasyon (FISH).

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

visualization-analysis-mrna-molecules-using-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

34.6K Görüntüleme.  Princeton University. Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem anlatılmaktadır In situ Hibridizasyon (FISH).

Video: Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.