Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Anne Dodson teşekkür ediyoruz ve Stephanie Heinrich smFISH Protokolü en iyi duruma getirme konusunda tavsiye için Xavier Darzacq için analiz platformunda, Haiyan Huang öneriler istatistiksel analizi için yardım edin. Bu eser Mart Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable güvenir (00027344), Damon Runyon'un Kanser Araştırma Vakfı (35-15) ve Glenn Vakfı'na EÜ ve bir NSF yüksek lisans araştırma bursu Grant No fon tarafından desteklenmiştir DGE-1106400 Dizayn Merkezi için.

Not: Tüm tamponları ve bu protokol için kullanılan ortamı Tablo 1' de listelenmiştir. Satıcı bilgileri reaktifleri için Malzemeler tablolistelenir.
Gün 1/1-2 gün:
Not: bitkisel kültür için 0.4-0.6 tercih edilen bir ortamda, bir OD600 hücrelerin büyümesine. Segregasyonun kültür için hücreleri (genellikle bir OD600 itibaren 1.85 içinde kültür) tercih edilen bir yöntemle mayoz geçmesi için ikna etmek.
1. örnek fiksasyon ve sindirim
<ol><li>~3.5 OD%600 3 formaldehit hücrelerinin toplam düzeltmek.<ol>
<li>Bitkisel kültür için 480 µL % 37 formaldehit 15 mL konik tüpler kültürünün 5.52 mL ekleyin.</li>
		<li>Segregasyonun kültür için 160 µL % 37 formaldehit 2 mL microcentrifuge tüpler 1840 µL kültürünün ekleyin. ~ 5 kat için ters çevir'i karıştırın. Uyarı: Toksik formaldehit. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüpler bir silindir davul oda sıcaklığında 20 dakika yerleştirin. Segregasyonun örnekleri,-20 dk, oda sıcaklığında sabitleme sonra gecede 4 ˚C sabitleme devam etmek için döner. Not: Gece fiksasyon tekrarlanabilirlik ve segregasyonun örnekleri için elde edilen smFISH verilerin kalitesini artırır. Fiksasyon zaman optimize edilmelidir.</li>
	<li>Örnekler tespit ederken, 200 mM Vanadyl Ribonucleoside kompleksleri (VRC), en az 10 dk 65 ˚C çözülme.</li>
	<li>Sindirim ana karışımda 15 mL Tüp hazırlayın: 1 örnek için arabellek b 425 µL 200 mM (65 ˚C ısındı); VRC 40 µL ile karıştırın. 5 örnekleri için 2125 µL arabellek b 200 µL 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC ile karıştırın. Açık kahverengi yeşil VRC eklenmesinden sonra görünür ana karışıma eklemeden önce VRC tam olarak resuspend için girdap ~ 5 s. Not: VRC eklenmesi sırasında sindirim smFISH sonuçları, tutarlılığını potansiyel olarak ham özü saf zymolyase karışımı tarafından tanıtıldı nükleaz kirletici engelleyerek iyileştirir. Bu adımda gerekli VRC miktarı optimize edilmelidir.</li>
	<li>Bitkisel örnekleri için ~ 1057 x g 3 dk de tüpler santrifüj kapasitesi. Segregasyonun örnekleri (sonra gece fiksasyon) için 1,5 dk. Decant 21.000 x g, santrifüj kapasitesi veya süpernatant formaldehit atık için Aspire edin. Not: Oda sıcaklığında tüm Santrifüjü adımlar gerçekleştirilir.</li>
	<li>1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri yukarı ve aşağı pipetting veya tüplerin ters çevirme ve karıştırmak için flicking resuspend. Bitkisel örnekleri 2 mL tüpler için resuspension sonra aktarın.</li>
	<li>1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.</li>
	<li>1.5 mL soğuk arabellek b hücreleri resuspend</li>
	<li>1.5 dakika süreyle santrifüj 21.000 x g de kaldırmak sıvı dökme vakum aspirasyon veya pipetting, ~ 100 µL bırakarak.</li>
	<li>Hücreleri 21.000 x g de 1,5 dk. aspiratı soğuk arabellek B. santrifüj 1,5 ml sıvı vakum tamamen veya pipetting resuspend.</li>
	<li>Sindirim ana mix ve kısaca resuspend girdap 425 µL hücrelerde resuspend. 100T 10 mg/mL zymolyase 5 µL her tüp için ekleyin. Not: Girdap önce tüpler için ekleme her zaman zymolyase. Zymolyase ana karışıma eklemek yerine her tüp için ayrı ayrı ekleyin. Her iki adım zymolyase hızlı bir şekilde precipitates çünkü tüpleri arasında sindirim tutarlılığı korumaya yardımcı olmak.</li>
	<li>Girdap 2-3 s karıştırmak için. Tüpler silindir davulunun üstündeki yerleştirin ve 15-30 dk 30 ˚C, sindirmek. Bitkisel hücreleri ve erken segregasyonun aşamaları, genellikle ~ 15 dk sürer ve segregasyonun profaz ve segregasyonun bölümler için genellikle ~ 30 dakika sürer. Not: mikroskobunun her 5 dk 15 dk sonra denetleyin ve saydam olmayan ve Refraktif ~ %80 hücre görünür sindirim durdurur. Şu andan itibaren çok kırılgan hücrelerdir. Hücreleri nazikçe işlemek ve vakum aspirasyon ya da vortexing kullanmayın.
</li>
	<li>Tüpler ~ 376 x g 3 dk. Kaldır, sıvı tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı 1 - 2 kez için pipetting tarafından arabellek b 1 mL içeren hücreleri resuspend karıştırın.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır Tampon B sıvı, tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça 1 mL % 70 etanol (RNase free su ile seyreltilmiş) hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 3,5-4 saat için kuluçkaya.</li>
</ol>2. hibridizasyon
<ol><li>Formamide oda sıcaklığına getirmek (50 mL aliquot için ~ 30 dk su banyosunda alır). Not: formamide şişe şişe formamide oksidasyonunu önlemek için oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar açmayın. Dikkat: Formamide zehirlidir. İdare ve kurumsal düzenlemelere göre atmayın.</li>
	<li>% 10 formamide yıkama arabellekte bir 15 mL konik Tüp hazırlayın.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. kaldırmak 500 µL % 70 etanol için de tüpler santrifüj kapasitesi pipetting tarafından. Yavaşça yukarı ve aşağı kalan hücreleri resuspend ve sonra hücreleri düşük yapışma tüpler için aktarmak için damlalıklı. Not: yüksek yapışma borular kullanarak büyük ölçüde hücre kaybı sırasında sonraki yıkar azaltır.</li>
	<li>Tüpler ~ 376 x g 3 dk. çıkarmak için de tekrar pipetting tarafından tüm etanol santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>1 mL % 10 formamide yıkama arabellek ve yavaşça damlalıklı aşağı yukarı 2 - 3 kez eklemek hücreleri resuspend.</li>
	<li>Hücreleri hibridizasyon çözüm hazırlarken ~ 20 min için oda sıcaklığında oturmak izin. 1 örnek için 50 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 5 µL ve her sonda (200 nM final) 1 µL karıştırın. 5 örnekleri için 250 µL hibridizasyon arabelleği (Oda sıcaklığı), 200 mm (65 ˚C ısındı) VRC 25 µL ve her sonda (200 nM final) 5 µL karıştırın.<ol>
<li>Hibridizasyon (-20 ˚C dondurulmuş) arabellek formamide oksidasyonu önlemek için tüp açmadan önce oda sıcaklığına çözülme.</li>
		<li>200 mM VRC, sondalar, eklemeden önce 5-10 s için girdap ekledikten sonra hangi tasarlanmış ve ticari satın ve üreticinin yönergelerine göre yeniden düzenlendi.</li>
		<li>İki problar Co inkübe varsa, 1:10 1 µL ekleyin seyreltme prob #1 stok, hem de 1:10 1 µL seyreltme, son seyreltme yapmak için prob #2 stokunun ~ 1:500 her iki soruşturma için. Olmak en iyi sinyal-gürültü oranı ihtiyaçları için gerekli konsantrasyonu (Ayrıntılar için bkz: tartışma) en iyi duruma getirilmiş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hibridizasyon çözümünün en az 50 µL her tüp için ekleyin. Karıştırmak için tüpler fiske.</li>
	<li>Bir rulo davul üzerinde 30 ˚C, en az 16 saat karanlıkta kuluçkaya.</li>
</ol>Gün 2/gün 3
3. yıkama ve görüntüleme
<ol><li>Formamide oda sıcaklığına getirmek.</li>
	<li>% 10 formamide yıkama arabellek (FWB) 15 mL konik Tüp hazırlayın.</li>
	<li>Tüpler rulo davul kaldır ve ışıktan korumak için bir folyo kaplı kutusuna koyun.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tehlikeli atık pipetting tarafından santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL % 10 FWB resuspend 2 - 3 kez.</li>
	<li>30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>3 dk. için çıkarmak süpernatant tehlikeli atık için pipetting tarafından ~ 376 x g de örnekler santrifüj kapasitesi ve ~ 50 µL bırakın.</li>
	<li>Bu arada, DAPI/FWB 15 mL konik tüp içinde hazırlamak: 1 örnek için 1000 µL % 10 formamide yıkama arabelleği 5 mg/mL DAPI 1 µL ile karıştırın. 10 örnekleri için 10 mL % 10 formamide yıkama arabellek 5 mg/mL DAPI 10 µL ile karıştırın. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting 1 mL DAPI/FWB resuspend 2 - 3 kez.</li>
	<li>30 dk folyo kaplı kutusunda (değil döner) için 30 ˚C, kuluçkaya.</li>
	<li>Anti-çamaşır suyu reaktifler buz çözme.</li>
	<li>~ 376 x g 3 dk. Kaldır de örnekleri süpernatant tamamen pipetting tarafından santrifüj kapasitesi. Gerekirse, tüm süpernatant kaldırmak için tekrar santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hemen görüntüsü değil örnekleri, Pelet GLOX arabellek olmadan enzimler 50 µL içinde resuspend. Damlalıklı aşağı yukarı 3 - 4 kez karıştırmak için.<ol>
<li>Unimaged örnekleri folyo kaplı kutuda 4 ˚C görüntüye kadar hazır tutun. Görüntü hazır olduğunuzda ~ 376 x g 2 min için de örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant tamamen kaldırmak pipetting göre. Aşağıdaki gibi enzimler ile GLOX içinde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen yansıma örnekleri için 15-20 µL GLOX arabelleği enzimler ile ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için damlalıklı. Not: eklendi birim hücre Pelet boyutuna bağlı olarak değişebilir. Biz 15 µL GLOX arabelleği enzimler ile Pelet resuspending tavsiye ve mikroskop hücre yoğunluğu kontrol edin. Hücreleri (çok yoğun hücreleri birbiri topaklanma) varsa, enzimler ile ilave GLOX tampon ekleyin. Hücreleri çok seyrek ise örnek santrifüj kapasitesi ve ~ 5 µL arabelleği kaldırın.</li>
	<li>Damlalıklı 5 µL üzerine bir coverslip (18 mm x 18 mm, No. 1) ve koymak bir slayt üzerinde coverslip.</li>
	<li>Coverslip yerleştirildiği bir laboratuvar silin slayt üzerine koy. Yavaşça laboratuvar silme slayt (sıvı tüm dört coverslip kenarlarından çıkıyor görmelisiniz) ayarlamak için tuşuna basın.</li>
	<li>Slayt alüminyum folyo ile kaplı bir kutu içinde mikroskop Oda aktarın.</li>
	<li>Yüksek büyütme (60-100 X) ve yüksek sayısal diyafram ile geniş alanlı floresan mikroskop kullanarak görüntü. Not: önemli ölçüde tahsil edilecek ışık miktarını sınırlamak gibi smFISH sondalar tarafından yayılan fotonlar maksimum sayıda toplamak için confocal mikroskoplar, tavsiye edilmez. Burada, veri toplanmıştır üzerinde bir 100 X, 1.4 NA amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) görüntüsü 1.3 s, %100 T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, %100 T; ve DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, %32 - %50 T. Bir parlak alan başvuru yansıması da elde edilebilir. Adım boyu ile 15-25 dilim 0,1-0,2 elde µm, üzerinden tamamen aşağıda görüş alanı tamamen yukarıda, odak tüm sağlamak için RNA noktalar sayılı mı.</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Balık-quant17 ve StarSearch2gibi yayımlanmış smFISH analiz araçları ile veya deneme tam ihtiyaçlarına bağlı olarak özel programları ile smFISH veri analiz. Not: Bir iyi analiz boru hattı doğru RNA noktalar ayrı arka plan ve X, Y ve Z (isteğe bağlı) koordinatları ve her yerinde, her hücrede noktaların sayısını yoğunluğu gibi istatistikleri çıkış için bir eşik belirlemek kullanıcılara izin vermelidir ve muhtemelen yanlış algılamaların filtre uygulamak için bir yol olarak parametreleri uygun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Burada sunulan Protokolü diğer yayımlanmış smFISH iletişim kuralları2,3,21,22,23türetilmiştir ve özellikle Maya zorlanma arka SK1 için optimize edilmiştir. En iyi duruma getirilmiş parametreler cep telefonu numarasını, fiksasyon süresi, Santrifüjü hız ve süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon arabellek dahil. Hibridizasyon sıcaklığı ve süresi gibi diğer parametreler optimize edilmemiş. Bu bölümde, bu protokol için herhangi bir Maya zorlanma arka plan ve faiz büyüme koşullarına uyum yardımcı olacak bir kaç not paylaşıyoruz.
Mayası hücre duvarına hücre duvarı sonda penetrasyon engelleyeceğinden mayası yüksek kaliteli smFISH görüntüleri alma karşı büyük bir sorun olduğunu. Hücre duvarı zymolyase tarafından eksik hazım sonda ve sinyal yüksek hücre hücre değişkenlik verimsiz hibridizasyon yol açar. Ancak, aşırı sindirim hücreleri çok kırılgan yapmak, önemli yol kaybı çamaşır adımları sırasında hücre ve görüntüleme için slayt hazırlık sırasında patlama hücre. Böylece, sindirim süresi optimize etmek çok önemlidir. Aynı örnek zaman farklı miktarda sindirerek tarafından pilot smFISH deney tavsiye ediyoruz. ~ %80 hücre refraktif sigara olunca sindirim durdu eğer bizim durumumuzda biz en iyi smFISH veri aldı. Genellikle, aynı büyüme koşulu için farklı genetik mutant suşları ile benzer zamanlama sindirmek. Ancak, sindirim süresi farklı büyüme koşulları ve mayoz mayası içinde farklı aşamalarında arasında karşılaştırıldığında farklıdır. Zamanlama belirlendikten sonra smFISH tekrarlanabilir kalitesidir. Not Ayrıca hafif kusurlu hücre duvarı sentezi ve/veya kompozisyon mutant suşları için sindirimi daha az 15 dk. zymolyase farklı gruplar halinde kullanımı tamamlanabilir sindirim zamanlama değişebilir.
En iyi sonda konsantrasyonu yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için gereklidir. Tasarlanmış ve bizim smFISH sondalar ticari olarak satın aldı. İyi problar (genellikle 20-mers) % %35 45, 2 baz çifti sonda ve düşük olan arasında en az bir boşluk arasında değişen GC yüzdesi olmalıdır. Biz bir web tabanlı sonda tasarımcı üretici probları listesi oluşturmak için kullanılan ve seçim için yeterli probları olsaydı, patlama algoritması Saccharomyces genom veritabanında sondalar fazla 17 baz çifti ile örtüşen ortadan kaldırmak için kullanacağımızı genomik diğer bölgeleriyle. Bu kümedeki tüm yukarıdaki ölçüt (20 probları) memnun probları sayısı daha düşük olduğu için NDC80luti (CF 590) benzersiz bölgesine anneals sonda küme için daha fazla photostable floresan boyalar (CAL Fluor 590) seçtik (~ 25 probları) üretici tarafından önerilen en az sayıda. Üreticinin yönergelerini izleyerek sonda çözüm başlamaktan sonra yaptığımız bir 1:10 seyreltme hisse senedi çözüm oluşturur ve seyreltik çözüm-20 ˚C adlı 5-µL aliquots. Her aliquot yalnızca bir kez kullanıldı. Optimizasyonu için bir seri yapmak gerekir dilutions 1:10 seyreltilmiş çözüm ve test hangi toplama en iyi sinyal-gürültü oranı verir. 1:250, 1:500, 1: 1000 ve 1:2000 özgün stoktan seyreltme dizi yapım tavsiye ediyoruz. Bizim durumumuzda, CF 590 ve Q 670 sonda kümeleri için en iyi sinyal-gürültü oranı 1:500 seyreltme faktörü sonuçlandı.
En iyi fiksasyon zaman da başarılı smFISH mayası için önemlidir. Biz o gece fiksasyon 4 ˚C bulundu yerine, oda sıcaklığında 20 dakika, sabitleme önemli ölçüde tutarlılık ve kalite segregasyonun örnekleri için smFISH sonuçlarının geliştirilmiş. Her ne kadar biz nasıl gecede fiksasyon bitkisel örnekleri etkisi olabilir test etmedim, fiksasyon, oda sıcaklığında bu büyüme durumu iyi çalıştı. Böylece, smFISH Protokolü yeni suşları veya büyüme koşulları için en iyi duruma getirmek için kısa fiksasyon saat oda sıcaklığında ile başlayan ve yüksek sinyal değişkenliği oluşursa fiksasyon zaman artan öneririz.
Diğer yayımlanmış protokolleri3,22,23ile karşılaştırıldığında, sindirim ve VRC daha yüksek bir konsantrasyon hibridizasyon sırasında sırasında RNase inhibitörü VRC bizim protokolünü kullanır. VRC ek olarak aşağıdaki iki adımı gelişmiş tutarlılık smFISH sonuçlarının muhtemelen daha iyi RNA molekülleri (enzim ham özleri saf ve RNase içerebilir zymolyase karıştırmak yanında tanıttı nükleaz etkinliğe karşı koruma kirletici maddeleri). Böylece, bizim iletişim kuralı veya VRC daha yüksek konsantrasyonlarda optimizasyonu için listelendiği gibi VRC miktarı kullanmanızı öneririz.
Hücreleri önemli bir kısmını arabellek B ve formamide yıkama arabellek çamaşır adımları sırasında kaybolabilir. Hücre kaybı azaltmak için Santrifüjü hızını artırmak. Bizim durumumuzda, örneklerimizi sırasında arabellek B cips için yüksek hızlı (21.000 x g) kullanarak önemli ölçüde azaltılmış hücre kaybı yıkar. Ancak, dolayısıyla Santrifüjü hızını değiştirme değil önerilir hücreleri zymolyase sindirim sonra çok kırılgan hale gelir. Bunun yerine, büyük ölçüde yıkama formamide yıkama arabellekte sırasında hücreleri cips yardımcı düşük yapışma tüpler bilimsel ABD üzerinden kullanmanızı öneririz. Genel olarak, bizim iletişim kuralı sürekli hücre verimli görüntüleme için yoğun bir monolayer oluşturabilirsiniz. Genellikle, 7 alanları bakış verim > 130 hücreleri miktar için uygun.
Son olarak, en uygun parametreler için ve görüntü analizi gerekli çıkışları belirlemek önemlidir. SmFISH noktalar algılamak için yayımlanan analiz programları yaygın olarak ham görüntüleri arka plan sinyal kaldırmak için Gauss çekirdek kullanarak filtre ve kullanıcılardan görüntüleri2,17her kümesi için kullanılacak sinyal-gürültü oranı belirlemek ister. Ne yazık ki, şu anda tek bir standart hangi tarafından uygun parametreleri belirlenir değildir ve bu yüzden bazı ampirik bu farklı ayarları test gereklidir. Bu adımların her biri için gerekli parametreleri ayarlamak için bir tekrarlayarak farklı parametre kümesi giriş ve ne kadar iyi her kümesinden elde edilen sonuçları maçlar bu el ile birkaç temsilcisi hücrelerde sayım odasından kontrol gerekiyor. Bir parametre kümesi bulunduktan sonra farklı büyüme koşulları ve genetik arka planlar rağmen elde edilen görüntülerin çoğu için kullanılabilir.
Ayrıca, maksimum yoğunluk projeksiyon smFISH görüntülerin miktar22önce gerçekleştirilen bir test edebilirsiniz. Bu adım nokta algılama algoritması basitleştirir ve önemli ölçüde bazı potansiyel olarak yararlı bilgiler rağmen onların hücre altı yerelleştirme gibi bireysel noktaları hakkında pahasına görüntüleme süresini azaltır. Bizim durumumuzda, mRNA molekülleri NDC80 Gen tarafından üretilen sayısı yeterince düşük noktalar de bu işlendikten sonra (tutanaklar tomurcuklanma içinde3,7Maya için nadir değildir) ayrı kaldık. Colocalization Analizi kritik nerede durumlarda analiz boru hattı colocalization değerlendirmek için her kanaldaki her smFISH spot konumunu belirlemek gerekir. Bağlı olarak özel sorular sordu, her nokta yoğunluğu gibi diğer bilgileri de boru hattı daha ayrıntılı bir çözümleme için elde edilebilir gerekebilir. Anahtar en iyi duruma getirme iletişim kuralında adımlar ve görüntü analiz boru hattı yüksek faiz soru çalışmaya smFISH verilerin kalitesini elde etmek çok önemlidir.

Dinamik, düzenleme, Gen ifadesinin bir organizma gibi çevresel stres, enfeksiyon ve değişiklikler onun yanıt gelişimi metabolizmasında kullanıyor. Transkripsiyon regülasyonu odak çalışmaları RNA bereket ölçen teknolojilerine güveniyor. Böyle bir yöntem tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) olarak adlandırdığı bireysel RNA molekülleri tek hücreler1,2tespiti için kullanılır. Bu yöntem, hücre hücre değişkenlik gen ekspresyonu ölçümü ve hücre içi RNA yerelleştirme belirlenmesi sağlar.
En sık kullanılan smFISH teknikte bireysel bir RNA molekülü tespiti hedef RNA tamamlayıcı ve aynı floresan boyalar için Birleşik birden çok kısa DNA prob (genellikle ~ 48 20-mer probları) gerektirir. Tek bir floresan sonda bağlama sinyali zayıf sonuçlar, ancak tüm probları topluluğu sinyalini sağlamdır. Tek bir sonda hedef kapalı bağlama sergi olsa bile, böyle sinyal çok zayıf olarak hedef RNA molekülü3kıyasla beklendiği için bu özellik sinyal-gürültü oranı büyük ölçüde artırır. İçinde hata algılama RNA molekülleri sayısı sayılır ve çeşitli büyüme koşullarında ve farklı mutantlar arasında göre.
İlk gelişimi beri smFISH gen ifade4,5,6,7 patlama transkripsiyon Uçbirleştirme transkripsiyon uzama1,gibi2, çeşitli yönlerini incelemek için uyarlanmıştır , 8 , 9, hücre içi allelic ifade10,11,12ve RNA yerelleştirme13,14,15. Son zamanlarda, hangi aynı genin iki transkript izoformlarının ifade eğitim için bu yöntemi kullandık kısa transkript izoformu (NDC80ORF) vardır onun tüm sıra uzun izoformu (NDC80luti ile paylaştı )16. İki mRNA izoformlarının benzersiz olarak tanımlamak için biz iki yoklama kümesi kullanılır: bir set NDC80lutibenzersiz sırasını belirli ve diğer küme başka bir floresan boya, Birleşik, iki izoformlarının ortak bölgesine bağlar. NDC80luti RNA colocalized bir yer her iki floresan sinyali ile ise tanımlanan NDC80ORF RNA biri sadece sinyal ortak soruşturma kümesinden içerir. Sayısı beri NDC80ORF transkript sonda hibridizasyon, yüksek verim ve yüksek sinyal gürültü oranı güvenle smFISH noktalar tanımlamak ve hata azaltmak gerekli "çıkarma" yöntemine göre hesaplanır yayma.
Bu kağıt tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaesmFISH gerçekleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı, cep numarası, fiksasyon süresi, sindirim süresi, sindirim arabellek, sonda konsantrasyon ve hibridizasyon içinde smFISH deneyler için kullanılan arabellek en iyi duruma getirilmiş S. cerevisiae geçiren SK1 zorlanma arka için bitkisel büyüme veya mayoz. Ancak, aynı zamanda bu el yazması Not: resim alma ve (2) ek optimizasyon farklı zorlanma arka planlar ve büyüme koşulları için gerektirebilir Protokolü adımları sonra smFISH verilerin kalitesini kontrol etmek için (1 yöntemi.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Tek molekül floresans in situ hibridizasyon (smFISH) gen ekspresyonu nedeniyle algılayıp bireysel RNA molekülleri saymak için onun yetenek tek kişilik hücrelerde çalışma için güçlü bir tekniktir. Derin-dayandırılmış yöntemleri için tamamlayıcı, smFISH hücre hücre varyasyon transkript bolca ve belirli bir RNA'ın hücre altı yerelleştirme hakkında bilgi sağlar. Son zamanlarda, NDC80 gen ifade mayası mayoz sırasında çalışmaya smFISH kullanmış, hangi iki transkript izoformlarının adlı biri yok ve tüm onun sırası ile uzun izoformu paylaşılan kısa transkript izoformu vardır. Güvenle her transkript izoformu tanımlamak için bilinen smFISH iletişim kuralları en iyi duruma getirilmiş ve yüksek tutarlılık ve kalite tomurcuklanma sırasında alınan örnekleri için smFISH veri elde Maya mayoz. Burada, en iyi duruma getirilmiş bu iletişim kuralı olup kaliteli smFISH veri elde edilir ve bu iletişim kuralı diğer maya suşları ve büyüme koşulları uygulamak için bazı ipuçları belirlemek için kullandığımız ölçütleri açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.2K Görüntüleme.  University of California, Berkeley. Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Video: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Genetik

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Gelişim Biyolojisi

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biyokimya

Drosophila'da Tek mRNA Moleküllerinin Tespiti ve Miktar Tayini

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Yazar Spotlight: Drosophila Kas Dokusunda mRNA Mekansal Dağılımının Araştırılması 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biyoloji

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Sivrisinek Spermatogenezini İncelemek için Floresan In Situ Hibridizasyon

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

Yazar Spotlight: Anofel Sivrisineğinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek molekül floresan ın Situ hibridizasyon (SM-balık) kullanmak için fare yumurta miktarını ve Localize mRNA

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon