Bu deneyde, C2C12 myoblast hücreleri Denizatı hücre kültürü plakaları belli bir yoğunlukta numaralı seribaşı. Bazal oranları kurmak için bazal oksijen tüketimi (OCR) ve ekstraselüler asitlenme (ECAR) oranları ölçülür. 1. Hücreler Enjeksiyon Hücreler metabolik farklı bileşiklerin hücrenin biyoenerjetik profili vardiya üç eklemeler (arkaya) tarafından rahatsız. Bir grup medya kontrolü &quot;bileşikler&quot; olarak eklendi çalışan, kontrol olarak hizmet verecek. <ol><li> İlk enjeksiyon oligomycin. Oligomycin F o kısmı ATP sentaz (Kompleks V) proton kanalı bloke ederek ATP sentezini inhibe eder. Mitokondriyal araştırmada, devlet 3 (fosforilleyerek) solunum önlemek için kullanılır. Hücreleri ile, ATP sentezi ve iç mitokondrial membran genelinde doğal proton sızıntısı üstesinden gelmek için gerekli O2 tüketimi yüzde ayrılmış O2 tüketimi yüzde ayırt etmek için kullanılabilir. </li><li> Ikinci enjeksiyon FCCP. FCCP (Karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) mobil bir iyon taşıyıcı bir İyonofor. Mitokondrial membran yerine ATP sentaz (Kompleks V) proton kanal üzerinden hidrojen iyonlarının taşınması ATP sentezini bozar çünkü uncoupling bir ajandır. Bu çöküş mitokondrial membran potansiyeli ATP üretimi olmadan hızlı bir enerji ve oksijen tüketimine yol açar. Bu durumda, hücreler ATP üretmek için glikoliz ile enerji dengesini korumak için bir girişim olarak hem OCR ve ECAR nedeniyle uncoupling OCR ve ECAR artacaktır. FCCP tedavi maksimum kontrolsüz OCR ve ilk bazal OCR arasındaki sayısal fark olarak tanımlanır hücrelerinin &quot;yedek&quot; solunum kapasitesini hesaplamak için kullanılabilir. ,, Maksimal fizyolojik veya patofizyolojik uyaran koşullar altında bile bazı yedek solunum kapasitesi bakım, canlılık ve / veya hücre hayatta kalma tanımlanmasında önemli bir faktör olduğu ileri sürülmektedir. Mitokondri biyoenerjetik kapasitesi etkilenir büyük bir kısmı artan enerji talebinin şartlar altında hücrelerin strese cevap yeteneği. Bu biyoenerjetik kapasitesi hücrenin mitokondri ve elektron taşıma alan enzimlerin fonksiyonel kapasite substrat sunmak için yeteneği dahil olmak üzere birçok faktör tarafından caydırmak-mayınlı </li><li> Rotenone Kompleks I inhibitörü, üçüncü enjeksiyon, hücreleri eklenir. Bu mitokondriyal solunum kapatmaya ve hesaplanacak solunum katkıda mitokondriyal ve non-mitokondrial kesirler sağlayacaktır. Bir hücre daha glikolitik devlet vardiya olarak enerji dengesini korumak amacıyla ECAR eşlik eden bir artış, mitokondriyal fonksiyon bozukluğu nedeniyle OCR bir azalma gözlemlemek olacaktır Rotenone Kompleksi Fe-S merkezi Ben ubikinon (Koenzim Q) elektron transferini önleyen bir mitokondriyal bir inhibitörüdür. Kompleksi bu inhibisyonu ATP formunda kullanılabilir enerjiye dönüştürülür NADH potansiyel enerji engeller. </li></ol> 2. Reaktifler ve Malzeme <ol><li> Oligomycin, FCCP ve Rotenone Çözümleri (Seahorse Mito Stres Testi Kiti) </li><li> DMEM Koşu Media (Seahorse # 100.965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Damıtılmış Su (Gibco 15.230-170) </li><li> Kalibrasyon tamponu (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. Büyüme Orta <ol><li> 500 ml DMEM (Gibco 11.965-092) </li><li> % 10 FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / Strep (Gibco 15.140-122) </li><li> 5 ml sodyum piruvat (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35.050-061) </li></ol> 4. Protokol Seeding <ol><li> Hücre / besi 100 mcL 10.000 hücreleri ile XF96 hücre kültürleri plakalar numaralı seribaşı ve% 10 CO 2 ° C inkübatör 37 yerleştirilir. </li><li> Hücreler 1 saat içinde XF96 hücre kültürü plakası uyacaktır. </li><li> Tohumlama sonra XF96 24 saat içinde Testi hücreleri. </li></ol> 5. Testi Şablon Hazırlama <ol><li> Testi Sihirbazı (Ek I) kullanarak, aşağıdaki grup düzeni ile bir şablon oluşturmak: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 sütun ve grup atamaları belirlenmesi Kuyu ızgara düzeni </li></ol> 6. Bileşik Hazırlık <ol><li> XF DMEM Testi medya aşağıdaki bileşikler aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 UM Oligomycin, 30.0 um FCCP, 20,0 mcM Rotenone Bu konsantrasyonları bileşikler kuyuya enjekte edilir yapılacaktır 10X seyreltme temsil eder. Çalışma konsantrasyonları: 1 UM Oligomycin, 3.0 um FCCP, 2.0 mcM Rotenone </li></ol> 7. Medya Değişim ve Hücre Hazırlama <ol&gt; <li> XF Hazırlık İstasyonu hücre plak </li><li> Ortalama 160 mcL orta son ses düzeyini ayarlayın. </li><li> Hücreleri tahlil orta ile ön denge sağlaması için izin vermek için 60 dakika süreyle 37 ° C inkübatör CO 2 olmadan inkübe edin. </li></ol> 8. Sensör Kartuş yükleme <ol><li> Sıcak bileşikler 37 ° C sensör kartuş önce yükleme ve enjektör bağlantı noktaları aşağıdaki gibi bileşikler yüklemek için: <ol><li> Sütunlar 1-4: Yük sırasıyla A, B ve C portu, içine 16, 18, ve 20 XF Testi medya (DMEM) mcL. </li><li> Sütunlar 5-12: Port içine Oligomycin 16 mcL Yük A Port Yatak içine FCCP 18 mcL yükleyin Port C içine Rotenone 20 mcL yükleyin </li></ol></li></ol> 9 - Protokol Komutlar <table border="1"><tbody><tr><td> Komuta </td><td> Süresi (dak) </td><td> Liman </td></tr><tr><td> Ayarlamak </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dengelemek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Karışım </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Ölçmek </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Enjekte </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Karışım </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Ölçmek </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Karışım </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Ölçmek </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Enjekte </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Karışım </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Bekleyin </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Ölçmek </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Son </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Protokolü komutları

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

Ortalama Min Wu Bo Jensen, George W. Rogers ve David A. Ferrick Bioscience Denizatı, bu makalede yer reaktifler ve enstrümantasyon üreten çalışanları.

Bu testte, mitokondriyal fonksiyon prob klasik deney türetilen ve çeşitli değişiklikler hücre metabolizmasını, mitokondriyal fonksiyon ve genel biyoenerjetik anlayış amaçlayan daha karmaşık deneyler inşa etmek için bir çerçeve olarak hizmet vermektedir. Bu deneyde kullanılan tüm bileşikler, maksimal etkisi sağlar konsantrasyonu için optimize edilmelidir. Yani bu değerler bir tespit için ayrı titrasyon deneyleri gerçekleştirmek gerekir. Titrasyon eğrisi oldukça keskin olma eğilimindedir ve çok FCCP aslında OCR yanıtları azaltabilir, FCCP özellikle önemlidir. Tipik aralıkları (son konsantrasyonları) test etmek olacaktır: <ul><li> 0,1 - 1,0 ug / Oligomycin mL </li><li> 0.1 - 5,0 um FCCP </li><li> 0,1 - 1,0 UM Rotenone </li></ul> (Özellikle FCCP) üzerindeki her bileşik yanıtları tahlil medya kompozisyonu (taban türü, [glikoz], [piruvat] BSA varlığı / yokluğu, vb.) Etkilenir unutmayın. Ayrıca, XF tahlil medya kompozisyonu değişti ise, optimizasyon, yeniden yapılması gerekecektir. Varlığı ve pirüvat konsantrasyonu FCCP nedeniyle maksimal solunum kapasitesi elde etmek için özellikle önemlidir. Bioscience Denizatı pirüvat ihmal FCCP (bazal yukarıda) maksimum cevap hücrelerinin yeteneği lağvetti hücreleri hatları bir dizi gözlemledi. Tipik olarak, 1-10 mM piruvat konsantrasyonları maksimal solunum elde etmek için en uygun konsantrasyonda pirüvat anlamak için test edilmelidir. Not: [piruvat] ve [glikoz] deneme için en uygun ortam koşulları elde etmek için &quot;cross-titre&quot; olmak gerekebilir. Bu deneyde tipik sonuçlar OCR vs zaman ve gösteren başka bir ECAR vs zamanı gösteren bir grafik aşağıda sunulmuştur: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 OCR vs Zaman <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 ECAR vs Zaman Burada hücrelerin birbirini izleyen bileşik ile tedavi olarak OCR ve ECAR beklenen tepkileri gözlemlenmiştir. Oligomycin için, OCR, mitokondriyal Kompleksi V. hücrelerin Kadıköy ATP sentezlenmesi mümkün olduğundan, onlar için ATP talebi karşılamak için glikoliz dönmek ATP sentezini bloke bir sonucu olarak azalır, böylece biz ECAR bir artış gözlemliyoruz. Daha önce de gösterildiği gibi, FCCP uncoupling bir ajan olarak hareket eder. Hücreler artık iç mitokondrial membran boyunca proton sızıntısı üstesinden gelmek zorunda olduğundan daha fazla O2 mitokondriyal membrandan aşırı proton pompa tüketildiği gibi, OCR önemli ölçüde artırır. Son olarak, rotenone, sırasıyla, mitokondriyal Kompleks I ve Kompleks III inhibe elektron taşıma zinciri sona elektronların akmasına neden olur ve böylece O2 tüketimi önemli ölçüde azalır. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 Solunum parametreleri Solunum ve ECAR beklenen değişikliklerin ötesinde, solunum parametreleri bir dizi bu verileri elde edilebilir. Bu yukarıdaki şekilde özetlenebilir: İşte biz, ATP üretiminin yanı sıra, proton degrade (H + kaçak nedeniyle) korumak için ayrılan miktar ayrılmış O2 tüketiminin yüzde hücrelerinin bazal solunum hakkında bilgi alabilirsiniz görüyoruz. Ayrıca, biz Kuplajsız solunum (bazen solunum kapasitesi gibi yedek anılacaktır) koşulları altında maksimal solunum hızı elde edebilir ve nihayet, mitokondriyal süreçleri nedeniyle O2 tüketim miktarını belirlemek. Çalışmalar hızla artan sayıda hücresel biyoenerjetik değerlendirmek, mitokondriyal fonksiyon bozukluğu tespit ve, stres ve / veya hakaret cevap hücrelerinin yeteneği tahmin etmek için bu mitokondriyal profil kullanıyorlar. Bu deneysel yöntem ve yedek solunum kapasitesi fikir hakkında daha fazla bilgi ve detaylar için, aşağıdaki yayınlara 1-8 bakın bakın.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

Hücresel metabolizma ölçen ve mitokondriyal disfonksiyonu anlamak için yetenek, mitokondriyal fonksiyon obezite, şeker hastalığı, yaşlanma, kanser, kardiyovasküler fonksiyon ve emniyet toksisite rolünü anlamak araştırma ilerlemek için dünya çapında bilim adamları sağladı. Hücresel metabolizma, oksijen, glikoz, yağ asitleri, glutamin, ve enzimatik oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonları kontrol bir dizi sonraki enerji dönüşüm gibi substrat alımı, bir süreçtir. Bu hücre içi biyokimyasal reaksiyonlar sonucu ATP üretimi, ısı ve kimyasal yan, ekstrasellüler ortama laktat ve CO 2 gibi serbest bırakılması. Oksijen Tüketim Hızı - ya da OCR hücre fizyolojik devlet ve devletin bu hücrelerin değişiklik değerli içgörü, hücreleri, mitokondriyal solunumun bir göstergesi tarafından tüketilen oksijen oranı ölçüm yoluyla elde edilebilir. Oksijen, glikoz ve laktat dönüşüm bağımsız: Hücreler aynı zamanda, yani glikoliz yoluyla ATP üretmek. Kültürlü bir kuyu, laktat proton birincil kaynağıdır. Dolaylı veya ECAR - orta asitlenme Ekstra Hücresel Asidifikasyon Oranı neden hücreleri çevreleyen ekstrasellüler ortama salınan protonlar ile üretilen laktik asit ölçümü. Bu deneyde, C2C12 myoblast hücreleri Denizatı hücre kültürü plakaları belli bir yoğunlukta numaralı seribaşı. Bazal oranları kurmak için bazal oksijen tüketimi (OCR) ve ekstraselüler asitlenme (ECAR) oranları ölçülür. Bu hücreler daha sonra metabolik farklı bileşiklerin hücrenin biyoenerjetik profili vardiya üç eklemeler (arkaya) tarafından rahatsız edilir. Bu testte mitokondri değerlendirmek için klasik bir deney türetilmiştir ve mitokondri hem fizyolojik ve patofizyolojik işlevini anlamak amacıyla daha karmaşık deneyler inşa etmek ve stres ve / veya hakaret cevap hücrelerinin yeteneği tahmin etmek için bir çerçeve olarak hizmet vermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.

C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K Görüntüleme.  Novato, CA. Hücrelerinde mitokondriyal fonksiyon profil için bir yöntem bir açıklaması sağlanmaktadır. Bazal solunum hızı, solunum ATP bağlantılı, proton kaçak ve rezerv kapasitesi: mitokondriyal Profil üretilen bir deneyde ölçülebilir dört parametre mitokondriyal fonksiyon sağlar.

Video: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Yapay Diyet Deney kullanarak Yaprak bitleri Nikotin Tolerans Testi

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Biyoloji

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

Morris Su Labirent Deney

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Zebra balığı Embriyolar Metabolik Profil Analizi

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Bazal Omurgalı soylarından İlköğretim andMyogenic Öncü Hücre / Miyoblast Kültürlerinin Hazırlanması

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Hassas immünohistokimyasal sitozin Modifiye Formlar Algılama

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...