Alina El-Halili ve Martina Hajduskova teknik yardım için teşekkür ederiz. El yazması üzerinde yorum Tursun grubunun üyeleri, teşekkür ederim. Bu eser ERC-StG-2014-637530 ve ERC çiğ PCIG12-GA-2012-333922 tarafından sponsor oldu ve Max Delbrueck Merkezi tarafından Helmholtz Association moleküler tıp için desteklenir.

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakımı açısından LaGeSo Berlin, Almanya tarafından onaylanmış olan
1. çözüm hazırlık
<ol>
	<li>NGM-Ağar kaplamalar (1 L)
	<ol>
		<li>3 g-in NaCl, pepton medya (örneğin, Bacto-pepton) 2.5 g ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 1 mL ekleyin M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL ve 1 mL amfoterisin b (2.5 mg/mL stok).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM Agar RNAi tabak (1 L)
	<ol>
		<li>3 g-in NaCl, 2.5 g pepton medya ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra eklemek, kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL, amfoterisin b (2.5 mg/mL stok) 1 mL, 1 mL 1 m IPTG ve 1 mL carbenicillin (50 mg/mL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB-Agar (1 L)
	<ol>
		<li>10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g agar, 1 M Tris pH 8,0 10 mL 20 g. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ve 5 mg/mL tetrasiklin 2.5 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB orta (1 L)
	<ol>
		<li>10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g ve 1 M Tris pH 8,0 10 mL. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-tampon (1 L)
	<ol>
		<li>Na2HPO46.0 g, 3 g KH2PO4, 5 gr NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Önce kullanımı, 1 M MgSO41 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beyazlatma çözüm (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O için 10 mL ekleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNAi plakaları hazırlanması
Not: C. elegans genellikle Yuvarlak solucanlar büyüme orta Agar (NGM-Agar)10,117.5 mL içeren 6 cm Petri plakalar üzerinde laboratuvarda kültürlü. Bu iletişim kuralı 15 ° C'de muhafaza solucanlar için optimize edilmiştir NGM tabak hazırlamak için mantar ve bakteri kontaminasyonu önlemek için standart steril tekniklerini kullanın. RNAi için ayıraçlar ile desteklenmiş NGM tabak hazırlamak için iletişim kuralı şudur.
<ol>
	<li>1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 50 µg/mL carbenicillin içeren 6 cm NGM Agar RNAi tabak hazırlamak. Koyup karanlık12oda sıcaklığında 24-48 h için kuruyuncaya kadar bırakın.
	<ol>
		<li>Karanlıkta 4 ° C'de RNAi plakalar tutmak. 14 gün daha büyük ise kullanmayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lin-53 gen DNA dizisi kullanılabilir RNAi Kütüphane13 50 µg/mL içeren LB-agar plakaları donmuş gliserol stoktan ile L4440 plazmid içeren RNAi bakteri (Escherichia coli HT115) klon seçin carbenicillin ve üç fazlı streaking desen kullanarak 12.5 µg/mL tetrasiklin. 37 ° C gece12bakteri büyümek. Bu klon Candidatus lin-53 dsRNA IPTG-bağımlı üretimini sağlar.
	<ol>
		<li>Ayrıca, herhangi bir Gen dizisi boş vektör kontrol14olarak olmadan L4440 plazmid içeren RNAi bakteri büyümek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ertesi gün, bir koloni lin-53 üzerinden almak veya 200 µL pipet kullanarak boş vektör LB-Ağar kaplamalar ipucu ve her biri 50 µg/mL carbenicillin ile desteklenmiş sıvı LB orta14 2 mL içeren bir ayrı kültür tüp içine aşılamak. Onlar bir optik yoğunluk (OD) ulaşana kadar 600 kültürler 37 ° C'de gecede büyümek nm 0,6-0,8. Spektrofotometre15kullanarak OD ölçmek. Dikkat: Tetrasiklin bakteri gliserol stoktan bir azalma RNAi verimliliği 12 ' ye müşteri adayları besleme sırasında tetrasiklin dahil beri çizgiler için kullanılan LB-agar plaka aksine sıvı LB medya içermemeli</li>
	<li>Her bakteri kültürü (lin-53 veya boş vektör) 500 µL 6 cm NGM Agar RNAi tabakaları bana bir multipipette kullanarak ekleyin. Tabak kuru karanlık oda sıcaklığında gecede kapalı bir kapak ile kuluçkaya. Bu süre boyunca, NGM tabak içinde IPTG dsRNA içinde bakteri üretimi teşvik.
	<ol>
		<li>Bakteriyel kültür deneme başına başına en az 3 tabak kullanın. Bu 3 teknik her deneme için çoğaltır sağlayacaktır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4 ° C'de bakteri kurutulmuş NGM agar RNAi pilakalar karanlıkta iki haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>
3. C. elegans zorlanma BAT28 hazırlanması
<ol>
	<li>Solucan zorlanma BAT288 transgenes otIs305 içeren korumak [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 15 ° C'de standart NGM-Ağar kaplamalar kullanarak OP50 bakteri Not:10nematodunun kültür için detaylı iletişim kuralı için bakın. Rol-6(su1006) dominant bir gen olduğunu ve sık kullanılan tipik yuvarlanma hareketi neden olur fenotipik enjeksiyon işaretçisi16 . Bu otIs305 transgene izlemek için kullanılan hsp-16.2prom::che-1.<ol>
		<li>Her zaman 15 ° c BAT28 gerilme precautious aktivasyonu önlemek için tutmak hsp-16.2prom::che-1 transgene. 15 ° C yüksek sıcaklıklarda mümkün olduğu kadar yük taşıma sırasında azaltmak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yaş-solucanlar eşitlemek için beyazlatma tekniği17kullanın.
	<ol>
		<li>Yetişkin ve 900 µL M9 tampon kullanarak yumurta BAT28 içeren 6 cm NGM-Ağar kaplamalar yıkayın. Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını.</li>
		<li>0.5-1 mL çözüm ağartma ekleyin ve yetişkin solucanlar patlak açık başlayana kadar yaklaşık 1 dk için tüp sallamak. Standart bir stereomicroscope kullanarak izleyin.</li>
		<li>Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını.</li>
		<li>Solucan Pelet 800 µL M9 arabelleği ekleyerek ve de 900 x g centrifuging 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Temizlenmiş yumurta taze NGM-tabaklar OP50 bakteri ile seribaşı yerleştirin. L4 sahne (yaklaşık 4 gün) ulaşana kadar ağartılmış Vaha'da OP50 bakteri 15 ° c üzerinde büyür. L4 larvaları beyaz bir yama bir standart stereomicroscope kullanarak solucan18 ventral kenarı boyunca yaklaşık yarım tarafından tanınacak. Not: nöron dönüşüm fenotip lin-53tükenmesi üzerine mikrop hücresine elde etmek için bu ebeveyn üretimi (P0) tüketilmiş gerekir.</li></ol></li></ol>Dönüşüm fenotip için puanlama aşağıdaki üretimi (anne babaya üretimi F1) üstlenilmiştir. Şimdiden P0 Rutherford lin-53 elde etmek için L4 hayvanlar için RNAi tabi tutulmaktadır.
	
	
	<li>Elle herhangi bir bakteri içeren ve transfer edilen OP50 bakterileri uzak hareket solucanlar izin bir NGM plaka bir platin tel kullanarak çoğaltma başına 50 L4 sahne solucanlar aktarın. Yaklaşık 5 dakika için plaka üzerinde hareket solucanlar izin. NGM Agar RNAi plakaları bakterilerden kullanımı daha önce ilgili RNAi plakayı aktarmak için lin-53 RNAi bakteri (veya boş vektör kontrolü) numaralı seribaşı.
	<ol>
		<li>Gerçek RNAi plakayı OP50 bakteri aktarılmasını önlemek. Hızlı baskı 15 ° C'nin daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için çalışır</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Solucanlar NGM Agar RNAi plakaları 15 ° C'de F1 döl solucanların L3-L4 sahne ulaşana kadar yaklaşık 7 gün kuluçkaya. Onlar büyük ve F1 döl daha kalın olduğundan P0 hayvanlardan açıkça ayrılabilir.
	<ol>
		<li>Görsel olarak bir standart stereomicroscope altında F1 döl solucanlar şekil 1' de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotip gösterir olup olmadığını kontrol edin. RNAi lin-53 karşı pleiotropic etkileri vardır ve RNAi lin-53 karşı başarılı olmuştur değerlendirmek için kullanılan pvul fenotip neden olur. Not: RNAi lin-53 karşı da ölümcül F1 embriyoların neden olabilir. Önce hayvanlar L3-L4 aşamaya plakaları 15 ° C daha yüksek derece maruz kalır bu etkisi artar. Ölü embriyo tutuklandı gelişim ve çıkım eksikliği tarafından kabul edilebilir.</li>
		<li>IPTG ışığa duyarlı olduğundan plakaları karanlıkta kuluçkaya.</li>
	</ol>
	</li>

4. indüksiyon Germ hücre yeniden programlama
<ol>
	<li>Lin-53 içeren muayene RNAi plakaları kuluçkaya ve vektör RNAi tedavi F1 döl CHE-1 etkinleştirmek için karanlıkta 37 ° C'de 30 dk için boş. İçin daha verimli bir ısı şok sağlar beri Bacalı kuluçka makinesi kullanın.</li>
	<li>Isı şok hayvanların yeniden elde etmek için 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında ve plakaları gecede karanlıkta 25 ° C'de kuluçkaya izin.</li>
	<li>Bir çift stereomicroscope Floresan ışık kaynağı için birleştiğinde kullanarak incelemek gcy-5prom::gfpiçin GFP filtre altındaki hayvanlar- Şekil 2' de gösterildiği gibi sinyalleri orta gövde alanında solucanların türetilmiş. GFP sinyalleri için set mikroskop: 488 maksimum uyarma nm ile emisyon 509 maksimum nm.</li>
	<li>Montaj hayvanların agar pedi içeren mikroskobu slaytlar19orta gövde alanında GFP sinyallerle germ hücreli nöron dönüşüm derecesini değerlendirmek.
	<ol>
		<li>Germ hücreli nöron dönüşüm fenotip alellerle değerlendirmek için karanlık hayvanlar vs gösterilen hayvanları saymak. Hayvanlar değil fazla % 5 boş vektör RNAi üzerine germline diffüz GFP sinyalleri gösterir, ancak genellikle, yaklaşık hayvanların % 30 ayrı GFP sinyalleri germline lin-53 tükenmesi, üzerine gösterir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li><li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+barriers+and+enhancers:+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency.">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li><li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-Dependent+Heterochromatin:+Barrier+to+Cell+Fate+Changes.">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li><li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types.">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li><li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types.">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li><li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron.">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).</li><li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li><li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons.">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li><li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity.">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100 (2017).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetics+of+Caenorhabditis+Elegans.">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Worm+Lab:+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis.">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).</li><li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li><li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein.">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li><li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm.">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li><li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++.">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li><li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+biology.">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları var olduğunu ilan etti.

Transgenik C. elegans açıklanan iletişim kuralı'nı BAT28 strain ve RNAi lin-53 karşı birkaç adım sırayla kritik germ hücreli nöron yeniden programlama için beklenen sonuç sağlamak için basittir. Bu zorlanma BAT28 deneyler önce her zaman 15 ° C'de tutulur önemlidir. Kullanım ve bakım baskı sırasında olmak en aza indirgemek zaman 15 ° C üzerindeki sıcaklıklarda, mümkün olduğu kadar ihtiyacı var. Che-1 overexpression yetersiz indüksiyon germ hücre ASE nöron dönüşüm için neden değil bu yana doğru ısı-şok önemli koşullardır. Bu iletişim kuralında tanımlandığı gibi fenotip alellerle ölçerek tespit edilebilir. Geniş ısı-şok için hayvanların ölümcül yol açabilir. Örneğin, iç duvarları yakınında veya statik hava kuluçka makinesi alt yere genellikle yerleştirildi plakaları kapsamlı ısıl işlem deneyim. Bu nedenle, bu Bacalı ısı kuluçka makinesi kullanmak için tavsiye edilir. O zaman L3 Ektopik gcy-5prom::gfp indüksiyon vulva (şekil 3) gibi farklı vücut bölgelerde neden olabilir Ayrıca, zamanlama ısı şok indüksiyon che-1 aşırı ifade daha önce larva aşamalarında beri önemlidir 9. Ayrıca, geniş ısı-şok fenotip alellerle % 5 ve diğer dokuların, yani bağırsak artan otomatik Floresans genişletmeniz değil boş vektör RNAi hayvanlar tarafından tespit edilebilir.
Düzensiz, RNAi bakteri verimli bir şekilde hedef gen dsRNA üretmek için faaliyetlerini kaybedebilir. Ne yazık ki, bu algılanan önceden RNAi deney için mümkün değildir. Bu gibi durumlarda gliserol gelen taze bir çizgi Bölüm 2'de iletişim kuralının açıklandığı gibi yetişkin olmak. Eğer hala yok RNAi neden pleiotropic fenotip pvul fenotip lin-53, sonra bir plazmid karşı başarılı RNAi ilgili bakteri DNA izolasyonu neden olduğu gibi görünür yapılmalıdır ve taze HT115 bakteri olması gerekir lin-53 sıra içeren L4400 plazmid ile dönüştürülmüş.
Önemlisi, BAT28 zorlanma olan bir transgenesis ile hayvanların sırasında kullanılan iğne işaretçisi pRF4 nedeniyle silindir fenotip hsp-16.2prom::che-1 DNA yapısı. Zaman zaman, hayvanlar, susturmak belirtebilirsiniz haddeleme fenotip kaybetmek hsp-16.2prom::che-1 transgene. Düzgün BAT28 zorlanma korumak için taze bir tabak için 10 silindir hayvan almak ve hayvanlar haddeleme için seçme aktarabilirsiniz.
Uygulama Protokolü'nün (P0 üretimi) ailesi lin-53 için RNAi maruz kalmış değil hayvanlar germ hücreli nöron dönüşüm nedeniyle anne kurtarma4göstermez anlamına gelir F1 RNAi yordam sınırlıdır. Germ hücreleri nöronlar için dönüştürmek için alternatif bir yordam RNAi knock-down gld-1 ve mex-3 aşırı ifade bir transkripsiyon faktörü olmadan kullanarak Ciosk ve meslektaşları15 tarafından tarif edilmiştir. Ancak, elde edilen nöronlar nöronlar belirli bir türüne ait olmayan ve germ hücreleri de kas benzeri hücreler gld-1 ve mex-315RNAi aracılı tükenmesi üzerine dönüştürmek. Daha önce kanıtlanmıştır lin-53 karşı RNAi germ hücreli dönüşüm GABAergic nöron benzeri hücrelere Pitx tipi homoedomain transkripsiyon faktörü UNC-3016 CHE-14 yerine aşırı ifadesi üzerine izin . Gelecekteki tarifin için farklı kader-inducing transkripsiyon faktörleri lin-53 germ hücreleri tükenmiş olup olmadığını test edilecek diğer hücre tipleri belirli nöronlar daha dönüştürülebilir. Bu bağlamda, overexpression myogenic bHLH transkripsiyon faktörü HLH-1, homolog memeli Tanrım17, germ hücreli dönüşüm lin-53 RNAi5 üzerine kaslara neden olmaktadır. Kurulan özel somatik hücre tipi lin-53 RNAi üzerine ve uygun bir kader-inducing transkripsiyon faktörü aşırı ifade germ hücrelerinin yeniden şekillendirmek için birkaç farklı genetik ekranlar için kullanılabilir. Böyle bastırıcı veya artırıcı ekranlar hücre kader dönüştürme sırasında bir rol oynamak yasal yolları dissekan yardımcı olabilir.

Kader gibi myogenic TF Tanrım, Ektopik TF ifade tarafından yeniden programlama hücre hangi overexpressed zaman dönüştürür fibroblastlar kas benzeri hücreler1, içine doğrudan olmuştur bir araştırma odak yıllardır. Ancak, farklı hücre hücresel kimliklerini korumak mekanizmaları nedeniyle bu işlem için ateşe dayanıklı çoğu kez. Germ hücreleri koruma benzer derecede gösterir ve genellikle diğer hücre tipleri kader-inducing TF aşırı ifadesi üzerine içine germ hücreli dönüşüm önlemek için bir engel olarak hareket temel mekanizmaları vardır. Genellikle, epigenetik yönetmelik Histon modifikasyonları ve Kromatin yapısı gibi bir engel hücre kaderi2,3dönüşüm için uygular. Biz daha önce ters genetik RNAi knock-çıkışlar C. elegans içinde kullanarak uygulanan ve hücresel kimlikleri korumak ve böylece germ hücrelerinin nöron4yeniden şekillendirmek için karşı koymak faktörler tespit. Özellikle, polycomb baskıcı karmaşık 2 (PRC2) ve son derece korunmuş Histon refakatçi LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 insanlarda) önlemek germ hücreleri doğrudan dönüşüm içine glutamatergic tat nöronlarda C. elegans gibi belirli somatik hücre türleri 4 , 5. ısı şok indüklenebilir Zn-parmak TF CHE-1 taşıyan Transjenik hayvanlar kullandığımız bariyer faktörler yeniden programlama bu germ hücre tanımlamak için. CHE-1 normalde iki baş C. elegansburada glutamatergic tat nöronlar kaderi ASE6olarak adlandırdığı belirtir, nöronlarda ifade edilir. ASE nöron kader ASE özgü floresan muhabir gcy-5prom::gfpifade tarafından görüntülenmeyecektir. GCY-5 ASE doğru nöron7' ifade bir chemoreceptor var. Lin-53 tükenmesi RNAi tarafından ve indüksiyon ısı şok tarafından CHE-1'in geniş Ektopik ifade üzerine, germ hücreleri nöronlar vivo içinde4,5dönüştürülebilir. Önemlisi, zaman RNAi tedavi gibi sadece yetişkin solucanlar (P0 üretimi) lin-53 için RNAi maruz F1 döl hayvanlarla nöronlar4yeniden programlama için izin veren bir germline çıkmasına çok önemlidir.
C. elegans nöron dönüştürme yordamına yukarıda açıklanan germ hücre hücre kaderi yeniden programlama içinde yollar sinyal dolaylı gibi biyolojik soruları çeşitli eğitim için kullanılabilir. Örneğin, biz CHE 1 bağlı germ hücreli lin-53 karşı RNAi üzerine ASE nöronların içine yolu germ hücreli8yeniden programlama sürecinde sinyal çentik dolaylı çalışma için yeniden şekillendirmek için kullanılır. Lin-53 ve Histon demethylase kodlama co tüketmek için çift RNAi gerçekleştirerek bu yolu zıt PRC2-aracılı gen UTX-1'in ifadesinde germline8 etkinleştirerek susturmak sinyal çentik gösterdik gen utx-1 . Bu bulgu germ hücreli dönüşüm Bu protokol için açıklanan nöronlar için sağlam bir canlı ve bağlamında farklı gelişim ve çevresel hücresel yeniden programlama gibi karmaşık bir biyolojik süreç çalışma için kullanılan olabilir gösterir koşullar. Ayrıca, germ hücreleri aşırı farklı kader-inducing TFs sınırlama-in hücresel plastisite9içindeki rolü çalışma veya germ hücre için yeniden programlama inducing için potansiyellerini değerlendirmek için ifade ederek meydan okumak için bakış açısı sağlar diğer hücre içinde vivotürleri.
Memeli doku kültürleri de hücre kaderi yeniden şekillendirmek için farklı yönlerini eğitim izin verirken, hücre kültüründe yetiştirilen için sağlam bir organizma karşılaştırıldığında sinyal yol koşulları taklit kapasitesi sınırlıdır. Bu nedenle, C. elegans çentik vivo içindeyeniden programlama sırasında sinyal verme gibi çeşitli biyolojik süreçlerin rolleri incelenmesi için çok yönlü bir model. Ayrıca, o korumak ve genetik olarak değiştirmek için düşük maliyetleri nispeten kolay bir güçlü genetik ekranlar için modeldir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Roth</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone&amp;nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>Peptone Media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast extract&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&amp;nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Roth</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incubators&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific C24</td><td>M1247-0052</td><td>for heat-shock</td></tr><tr><td>Incubator&amp;nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>for maintenance of worm strains at 15 &amp;deg;C or 25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>M205 FA</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Imaging) + camera</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli HT115&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5&lt;br/&gt; promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse&lt;br/&gt; III minus).</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli OP50&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli strain</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Worm strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;BAT28:&lt;/strong&gt; &lt;em&gt;otIs305 (hsp16.2prom::che-1::&lt;br/&gt; 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi Clones&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>empty vetor: L4440</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Misc.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm pick&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>self-made using a pasteur pipette and a platinum wire</td></tr></tbody></table>

application of rnai and heat-shock-induced transcription factor expression to reprogram germ cells to neurons in c. elegans

Hücre biyolojik süreçlerin belirli hücre tiplerinin kimlikleri dönüştürme sırasında eğitim korumak ve hücresel kimlikleri korumak önemli anlayışlar içine mekanizması sağlar. Germ hücreleri dönüştürme nematodunun Caenorhabditis elegans (C. elegans) belirli nöronların içine kurulan hücre kimlikleri korumak yasal yolları incelemek için genetik ekranlar gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. ASE olarak adlandırdığı nöronların belli bir türe germ hücrelerinin yeniden programlama (TF) CHE-1 Zn-parmak transkripsiyon geniş aşırı ifade izin Transjenik hayvanlar faktör gerektirir. Endojen CHE-1 sadece iki baş nöronlarda ifade edilir ve kolayca gcy-5prom::gfp muhabiri tarafından görüntülendi glutamatergic ASE nöronlar kaderini belirlemek için gereklidir. Isı şok organizatörü tahrik che-1 gen ifade yapısı içeren bir trans gen ısı şok tedavisi üzerine tüm hayvan CHE-1'in geniş yanlış ifade sağlar. RNAi kombinasyonu faktör LIN-53 Kromatin düzenleyen ve che-1 ısı şok bağlı aşırı ifade karşı ASE nöron benzeri hücrelere germ hücre yeniden programlama için yol açar. Biz burada Transjenik hayvanlar ısı şok tedavisi için uygun koşul ve belirli RNAi yordamı başarıyla germ hücreli nöron dönüşüm için ikna etmek için açıklamak.

Şekil 1' de gösterildiği gibi pvul fenotip sergi F1 hayvanlar lin-53 RNAi başarılı uygulama gösterilmektedir. Bu hayvanlar onların germ hücreleri dönüştürme ısı şok indüksiyon che-1 aşırı ifade üzerine ASE nöron benzeri hücreye Şekil 2' de gösterildiği gibi izin yatkındır. Denetimde boş büyüdü solucan aksine RNAi lin-53 tedavi Ektopik GFP-sinyalleri ısı-şok ve 25 ° C kuluçka açıklanan önceki4, gece sonra orta gövde alanında görüntülemek hayvanlar verecek RNAi vektör 8. bu solucanları bir epifluorescence mikroskop altında daha yakından incelendiğinde ortaya koymaktadır GFP sinyalleri de gösteren hücreler nöronal hücre için tipik olan nöron benzeri projeksiyonlar (2B şekil, beyaz ok) görüntüler. Eğer RNAi lin-53 karşı başarısız oldu veya ısı şok koşulları uygunsuz GFP sinyalleri bu denetim RNAi tedavi hayvanlar (Şekil 2) benzer. Önemlisi, hayvanlar orta L3 sahne ulaşmadan önce ısı indüksiyon tarafından che-1 ' in aşırı ifade inducing kaçının. Che-1 overexpression indüksiyon anda çok gençtin hayvanlar Ektopik gcy-5prom::gfp ifade gelişmekte olan vulva gibi vücudun diğer bölgelerinde şekil 313' te gösterildii gibi görüntülenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
Şekil 1: Pvul fenotip RNAi tarafından lin-53 karşı neden. (Üst) L4/genç yetişkin sahne F1 döl Worms DIC resim denetimi veya lin-53 tedavi RNAi anne türetilmiş. Ölçek çubukları- lin-53 RNAi ekran çıkıntılı vulva (pvul) fenotip (siyah ok-uçları) tedavi 20 µm. (alt) hayvanlar =. Pvul fenotip RNAi lin-53 karşı başarılı olduğunu doğruluyor. Ölçek çubukları 20 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
Resim 2: Başarılı bir şekilde programlanmış germ hücreli Kurtlarla nöronların içine. (A)BAT28 zorlanma hayvanlar üzerinde boş vektör yetiştirilen gösterme GFP sinyalleri germline che-1 overexpression ısı-şok indüksiyon sonra. Kesikli beyaz çizgi solucan özetliyor. Ölçek çubukları = 20 µm. (B) BAT28 zorlanma hayvanlar üzerinde boş vektör kontrolü RNAi ekran gcy 5prom::gfp sinyalleri orta gövde alanında lin-53 üzerinde yetiştirilen RNAi hayvan yetiştirilen aksine. Orta gövde bölümü 63 X büyütme oranında alınan GFP sinyallerle resimlerini çıkıntılar (beyaz ok-uçları) gösterilen GFP pozitif hücreler ortaya koyuyor. Morfolojik bu özellik germ hücreleri dönüştürme ASE nöron benzeri hücrelere uygulanan gösterir. Beyaz Yıldız bağırsak kaynaklı auto-floresan işaretleyin. Tüm resimleri 20 X büyütme ve 63 X büyütme ile bir epifluorescence mikroskop kullanarak elde. Kesikli beyaz çizgi solucanlar özetliyor. Ölçek çubukları 20 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
Şekil 3: Erken sahne solucanı Ektopik GFP. Isı şok L2 gibi erken larva aşamalarında che-1 overexpression için indüklenen vardı boş vektör RNAi bakteri yetiştirilen BAT28 zorlanma hayvanlar GFP sinyalleri orta gövde alanında (beyaz yıldızlar) göster. Bu sinyaller germ hücre yeniden programlama nedeniyle değildir. Kesikli beyaz çizgi solucan özetliyor. Ölçek çubukları 20 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans at JoVE.com

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Bu iletişim kuralı, hücresel Caenorhabditis elegans içinde vivohücre kaderi dönüşüm sırasında çalışma açıklar. Transjenik hayvanlar, ısı-şok organizatörü tahrik overexpression nöron kader-inducing transkripsiyon faktörü CHE-1 ve Kromatin düzenleyen faktör LIN-53 mikrop nöron yeniden programlama için hücre RNAi aracılı tükenmesi izin kullanarak gözlenen vivo.

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

application-rnai-heat-shock-induced-transcription-factor-expression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

7.6K Görüntüleme.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. Bu iletişim kuralı, hücresel Caenorhabditis elegans içinde vivohücre kaderi dönüşüm sırasında çalışma açıklar. Transjenik hayvanlar, ısı-şok organizatörü tahrik overexpression nöron kader-inducing transkripsiyon faktörü CHE-1 ve Kromatin düzenleyen faktör LIN-53 mikrop nöron yeniden programlama için hücre RNAi aracılı tükenmesi izin kullanarak gözlenen vivo. 

Video: Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Caenorhabditis elegans Isı Şok Uyanımı İndüksiyon ölçme için Standart Yöntemler

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...

Çevre

Caenorhabditis elegans'ta Epigenetik Kalıtım ve ChIP

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through factors such as non-coding RNAs and chromatin modifications. The phenomenon of RNA interference (RNAi) inheritance in the nematode Caenorhabditis elegans is an effective model to investigate TEI that takes advantage of this model organism's short life cycle, self-propagation, and transparency. In RNAi inheritance, exposure of animals to RNAi leads to gene silencing and altered chromatin signatures at the target locus that persist for multiple generations in the absence of the initial trigger. This protocol describes the analysis of RNAi inheritance in C. elegans using a germline-expressed nuclear green fluorescent protein (GFP) reporter. Reporter silencing is initiated by feeding the animals bacteria expressing double-stranded RNA targeting GFP. At each generation, animals are passaged to maintain synchronized development, and reporter gene silencing is determined by microscopy. At select generations, populations are collected and processed for chromatin immunoprecipitation (ChIP)-quantitative polymerase chain reaction (qPCR) to measure histone modification enrichment at the GFP reporter locus. This protocol for studying RNAi inheritance can be easily modified and combined with other analyses to further investigate TEI factors in small RNA and chromatin pathways.

Yazar Spotlight: C. elegans'ta RNAi Kalıtım ve ChIP 

This protocol describes an RNA interference and ChIP assay to study the epigenetic inheritance of RNAi-induced silencing and associated chromatin modifications in C. elegans.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

Genetik

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Biyoloji

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Nörobilim

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Tissue-Specific RNAi Tools to Identify Components for Systemic Stress Signaling

Over the past decade there has been a transformative increase in knowledge surrounding the regulation of protein quality control processes, unveiling the importance of intercellular signaling processes in the regulation of cell-nonautonomous proteostasis. Recent studies are now beginning to uncover signaling components and pathways that coordinate protein quality control from one tissue to another. It is therefore important to identify mechanisms and components of the cell-nonautonomous proteostasis network (PN) and its relevance for aging, stress responses and protein misfolding diseases. In the laboratory, we use genetic knockdown by tissue-specific RNAi in combination with stress reporters and tissue-specific proteostasis sensors to study this. We describe methodologies to examine and to identify components of the cell-nonautonomous PN that can act in tissues perceiving a stress condition and in responding cells to activate a protective response. We first describe how to generate hairpin RNAi constructs for constitutive genetic knockdown in specific tissues and how to perform tissue-specific genetic knockdown by feeding RNAi at different life stages. Stress reporters&#160;and behavioral assays function as&#160;valuable readouts&#160;that enable&#160;the fast screening of genes and conditions modifying systemic stress signaling processes. Finally, proteostasis sensors expressed in different tissues are utilized to determine changes in the tissue-specific capacity of the PN at different stages of development and aging. Thus, these tools should help clarify and allow monitoring the capacity of PN in specific tissues, while helping to identify components that function in different tissues to mediate cell-nonautonomous PN in an organism.

Maintenance of organismal proteostasis requires the coordination of protein quality control responses such as chaperone expression from one tissue to another. Here, we provide tools used in C. elegans that allow monitoring of proteostasis capacity in specific tissues and determine intercellular signaling responses.

Over the past decade there has been a transformative increase in knowledge surrounding the regulation of protein quality control processes, unveiling the ...

RNAi in C. elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target gene. In the nematode, C. elegans, RNAi is particularly easy and effective because it can be delivered simply by feeding the worms bacteria that express double stranded RNA (dsRNA) that is complementary to a gene of interest. First, this video will introduce the concept of RNA interference and explain how it causes targeted gene knockdown. Then, we will demonstrate a protocol for using RNAi in C. elegans, which includes preparation of the bacteria and RNAi worm plates, culturing of the worms, and how to assess the effects of RNAi on the worms. RNAi is frequently used to perform reverse genetic screens in order to reveal which genes are important to carry out specific biological processes. Furthermore, automated reverse genetic screens allow for the efficient knockdown and analysis of a large collection of genes. Lastly, RNAi is often used to study the development of C. elegans. Since its discovery, scientists have used RNAi to make tremendous progress on the understanding of many biological phenomena.

RNA Interference RNAi in Caenorhabditis elegans

RNA interference (RNAi) is a widely used technique in which double stranded RNA is exogenously introduced into an organism, causing knockdown of a target ...

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Caenorhabditis elegans Isı Şok Uyanımı İndüksiyon ölçme için Standart Yöntemler

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans

Tissue-Specific RNAi Tools to Identify Components for Systemic Stress Signaling

RNAi in C. elegans