Yazarlar bu çalışma Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın (NSERC) hibe Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenen olduğunu kabul etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worming+secrets+from+the+C.+elegans+genome.">Worming secrets from the C. elegans genome.</a> Science. 282, 1972-1974 (1998).</li><li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rde-1+gene,+RNA+interference,+and+transposon+silencing+in+C.+elegans.">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99, 123-132 (1999).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).</li><li>Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphogenesis:+how+multiple+cells+cooperate+to+generate+a+tissue.">Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).</li><li>Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing:+the+power+of+the+purse+string.">Wound healing: the power of the purse string.</a> Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).</li><li>Ikegami, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+and+Eph+receptor+signaling+guide+a+series+of+cell+movements+for+ventral+enclosure+in+C.+elegans.">Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans.</a> Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).</li><li>Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ephrin+VAB-2/EFN-1+functions+in+neuronal+signaling+to+regulate+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans.">The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).</li><li>Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Ephrins+Control+Cell+Organization+in+C.+elegans+Using+Kinase-Dependent+and+-Independent+Functions+of+the+VAB-1+Eph.">Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph.</a> Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).</li><li>Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+divergent+C.+elegans+ephrin+EFN-4+functions+in+embryonic+morphogenesis+in+a+pathway+independent+of+the+VAB-1+Eph+receptor.">The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor.</a> Development. 129, 5499-5510 (2002).</li><li>Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VAB-1+Eph+receptor+tyrosine+kinase+and+SAX-3/Robo+neuronal+receptors+function+together+during+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Development. 132, 3679-3690 (2005).</li><li>Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNC-40/DCC,+SAX-3/Robo,+and+VAB-1/Eph+polarize+F-actin+during+embryonic+morphogenesis+by+regulating+the+WAVE/SCAR+actin+nucleation+complex.">UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex.</a> PLoS Genet. 8, (2012).</li><li>Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis:+welcome+to+the+Rho+zone.">Cytokinesis: welcome to the Rho zone.</a> Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).</li><li>Piekny, A. J., Maddox, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myriad+roles+of+Anillin+during+cytokinesis.">The myriad roles of Anillin during cytokinesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).</li><li>Zhao, W. M., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anillin+is+a+substrate+of+anaphase-promoting+complex/cyclosome+(APC/C)+that+controls+spatial+contractility+of+myosin+during+late+cytokinesis.">Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis.</a> J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).</li><li>Piekny, A. J., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anillin+is+a+scaffold+protein+that+links+RhoA,+actin+and+myosin+during+cytokinesis.">Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis.</a> Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).</li><li>Hickson, G. R., O&#8217;Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+control+of+anillin+behavior+during+cytokinesis.">Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).</li><li>Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference.">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi.">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).</li><li>Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+two+C.+elegans+anillins+in+the+gonad+and+early+embryo.">Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo.</a> Development. 132, 2837-2848 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+of+the+worm:+genetics+of+epidermal+morphogenesis+in+C.+elegans.">Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans.</a> Trends Genet. 16, 544-551 (2000).</li><li>Zhang, H., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+mechanical+inputs+&#8211;+a+coordinated+process.">Signaling through mechanical inputs &#8211; a coordinated process.</a> J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).</li><li>Guenther, C., Garriga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+distribution+of+the+C.+elegans+HAM-1+protein+in+neuroblasts+enables+daughter+cells+to+adopt+distinct+fates.">Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates.</a> Development. 122, 3509-3518 (1996).</li><li>Audhya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+the+Sm+protein+CAR-1+and+the+RNA+helicase+CGH-1+is+required+for+embryonic+cytokinesis+in+Caenorhabditis+elegans.">A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans.</a> J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).</li><li>Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anillin+and+the+septins+promote+asymmetric+ingression+of+the+cytokinetic+furrow.">Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow.</a> Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).</li><li>Dorn, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tube+formation+in+polar+body+cytokinesis+requires+Anillin+in+C.+elegans.">Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans.</a> Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).</li><li>Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1.">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, orta embriyojenez sırasında görüntü hücre bölünmesi için mikroskopla çeşitli kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol nasıl epidermal morfogenetiğine kolaylaştırabilir neuroblasts bölünme hücreleri görüntü vurguluyor. Hücre-hücre iletişimi metazoan gelişimi ve C. sırasında doku oluşumu için önemlidir elegans in vivo doku oluşumunu incelemek için mükemmel bir model. Güzel dokuların etkileşimi canlandıran bir olay epitel hücrelerinin bir tabakası içinde embriyo kapsayan, epidermal morfogenez olduğunu. Özellikle, ventral muhafaza ventral epidermal hücreler, embriyo ventral yüzeyi içine göç işlemi, ve altta yatan neuroblasts dayanır. Nöro-blastlar, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlamak ve neuroblasts konumu değiştirilmiş olması durumunda ventral muhafaza taviz verilmektedir. Ventral muhafaza düzgün gerçekleşmesi için neuroblasts sayısı (veya kutup) de gerekli olabilirve onların bölünme düzenleyen mekanizmaları anlamak önemlidir. Bu protokol nasıl görüntü hücre bölünmesi C. kullanarak yaşayan bir doku içinde açıklanır elegans iki flüoresan millerini (MCherry: PH plazma zarları ve HAM-1 anahat: neuroblast çekirdeklerini etiketlemek için GFP) coexpressing embriyolar. C canlı görüntüye en önemli adımlar elegans floresan probları ifade embriyolar: i) ii) doku oluşumu sırasında gen gereksinimleri çalışma için mutantlarının kullanımı ya da RNAi, 20-25 ° C de muhafaza arzu edilen flüoresan işaretçileri sentezleyen sağlıklı, genç, ergin hermafrodit bireyler () kullanın iii) en embriyolar toplamak mikroskopi için doğru aşama (örneğin. orta embriyogenezis), ve iv) düşük fototoksisite tutmak için optimize edilmiş ayarlar kullanılarak floresan mikroskopi gerçekleştirmek, ancak yüksek görüntü kalitesini korumak için. Belirli bir hücre ve / veya ilgi konusu bir dokuda hücre içi bölmelere belirlemek için, pro floresan ile etiketlenmiş işaretlerini ifade solucan kullanımıbes. Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc) birden fazla belirteci birlikte ifade suşları sunar. Ancak, iki suş (her ilgi tek bir işaretleyici ifade) stabil hem sondalar ifade bir yük oluşturmak için birkaç kuşak boyunca geçti ve bir floresan mikroskop ile taranarak gerekebilir. Neuroblast çekirdekleri görselleştirmek için bir işaretleyici ifade eden bir suşu ile çaprazlandı;: Örneğin, bu deney protokolü, hücre zarının (OP70 PH mCherry) görselleştirmek için bir işaretleyici ifade eden bir baskı yapmak için (HAM-1: GFP; OP102) oluşturmak için bir hem coexpressing süzün. Embriyonik gelişim sırasında gen gereksinimleri çalışma için en iyi yolu, gen ürünü devrilen ya da mutasyona uğramış fonksiyon deneyleri, kaybı yapmaktır. Bu deneysel protokol anillin (ani-1), embriyonik dokularda endojen ANI-1 seviyelerini azaltmak için karşı RNAi performans açıklar. Hiçbir iyi karakterize hypomorphic allelleri vardırani-1. Bu nedenle, RNAi fonksiyon fenotipleri ani-1 &#39;in kaybını incelemek ve embriyonik gelişim sırasında işlevini belirlemek için en iyi seçenektir. Tipik olarak, bu Nakavt verimliliği değişken olabilir gibi, yerine RNAİ&#39;nin mutantlar kullanmak daha iyidir ve nadiren null. RNAi protokolleri besleme ile karşılaşılan en yaygın sorunlardan biri RNAi verimliliğini azaltacak, kirliliktir. , Kontaminasyon riskini azaltmak aseptik koşullarda RNAi tabak ve yemek hazırlamak için. Kirlilik, kullanımdan önce, levhaların bir kaç tarama ile tespit edilebilir, ve sütlü / opak görünümlü bakterileri ile plakalar atılmalıdır. RNAi verimliliği azaltabilir başka bir sorun doğru gelişim aşamasında çift cinsiyetli seçerek değil gereğidir. Hiçbir / birkaç döllenmiş embriyo var L4-sahnelenen veya genç erişkin solucanlar (gelişmekte vulva solucanın ventral tarafında beyazımsı daire / delik gibi görünür), kullanmak en iyisidir. Ayrıca, RNAi koşulları ve tedavi mBugün, farklı gen ürünleri için değişir. RNAİ&#39;nin gücünü artırmak veya azaltmak için farklı yollar solucanlar üzerinde tutulur (Bölüm 1.2.2 bakınız) LB Amp medya farklı miktarlarda peletlendi HT115 bakteri resuspending ve RNAi tedavi (zamanın uzunluğu süresini değiştirerek gereğidir RNAi plakaları;) Protokolü 3 bkz. Bu protokol için uygun ani-1 RNAi fenotipleri elde etmek için, bakterileri LB Amp ortam ve solucanlar 500 ul içerisinde yeniden süspanse edildi (ani-1 RNAi önceden Maddox vd. 23 ile karakterize edilir), 2 gün boyunca RNAi plakalar üzerinde tutuldu. RNAi dirençli veya duyarlı suşlar (örn.. Rde-1 sid-1 veya rrf-3), aynı zamanda RNAi gücünü değiştirmek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu suşlar doku hassas suşları yaratmak için yabani tip genlerinin doku spesifik ifade ile akuple edilebilir. Örneğin, belirli bir neuroblast RNAi gerçekleştirmek için, tek bir wt ifade sid-1 mutant embriyolar (RNAi dirençli) kullanabilir <em&gt; Sid-1 unc-119 organizatörü (CGC TU3401 suşu ID) 31 altında. Bu protokol nasıl görüntü neuroblast hücre bölünmesi orta Embriyogenez sırasında açıklanır. Uygun Z-yığınlar toplama ve görüntü kalitesinden ödün vermeden fototoksisite en aza indirmek için görüntüleme koşulları optimize, bu tür embriyoların gelişimsel aşaması olarak, dikkatli bir değerlendirme gerektirir protokolün birçok yönleri vardır. Doğru gelişim aşamasında (örn. ventral muhafaza) de zaman noktalarını yakalamak için, embriyolar (; Şekil 1A6 embriyonun sırt tarafında epidermis bir tek tabaka oluşturmak için dorsal epidermal hücrelerin çiftleri interdigitate ve sigorta) dorsal birleşmesinden filme edilmelidir. Şu anda, nöro hızla bölünen. Embriyoların evreleme (örneğin mikroskop kullanılarak), düşük büyütme altında zor olabilir bu yana, en farklı aşamaları ve embriyoların birçok embriyolar toplamak için yardımcı olurDoğru kademe yüksek büyütme kullanılarak seçilebilir. Nöroblastomun nispeten küçük ve ince ve embriyo ortasında boyunca bulunur. Bu, tüm hücre bölünmesi sırasında yakalanan olduğundan emin olmak için Z-yığınlarının sayısını ve boyutunu optimize etmek için gereklidir. Örneğin, çok fazla görüntü toplama daha fazla ışığa maruz embriyolar ve fototoksisite onları eğilimli yapacaktır. Ancak, çok az sayıda Z-yığınlarının toplanması veya kalın Z bölümleri kullanarak zor bütün bir bölme neuroblast hücre düzgün görüntü için yapabilir. Bu protokol, görüntü neuroblast hücre bölünmesi için bir süpürüldü alan konfokal mikroskop ya da geniş açılı sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Daha önce tarif edildiği gibi, bir geniş açılı epifluorescent mikroskop kullanılarak ana sınırlamaları bir fototoksisite için potansiyeldir. Son derece görüntüleme C için dönen bir disk konfokal veya süpürüldü alan konfokal kullanılması tavsiye edilirken elegans embriyolar, bazı laboratuvarlar bu sistemlerin sınırlı erişimi olabilir. Bu potokol gibi,% 30 açıklığı kapatarak cıva ampul (veya tercihen LED&#39;leri kullanarak) gelen ışığın yoğunluğunu azaltan, EMCCD kamera kullanarak ve kazanç artan veya izin kutulamanın gibi widefield sistemlerini kullanırken fototoksisite sınırlamak için bazı öneriler verir Maruz kalma süresi bir azalma. Z-yığınları ve zaman noktalarının sayısı da bir widefield sistemi kullanılarak sınırlı olacaktır. Bu protokolde tarif edilmemiş olsa da, bir geniş açılı mikroskop ile karşılaştırıldığında daha düşük fototoksisite neden olarak, dönen disk konfokal mikroskop yaygın canlı görüntüleme için kullanılır. Süpürüldü alan sistemine benzer, katı hal lazer kullanan ve saçar (her ne kadar süpürüldü alanında vs farklı bir şekilde). CCD veya EMCCD Ya kameralar genellikle çift görüntüleme izin için birden fazla kamera portu vardır dönen disk sistemi ile kullanılabilir. Süpürüldü alan mikroskobu benzer görüntüler widefield sistemi vs pozlama süreleri% 50-90 daha düşük ile yakalanabilir. Bu protocol doku oluşumu sırasında mitoz düzenleyen çeşitli genlerin işlevini incelemek için kullanılabilir. Her görüntü arasındaki süre kısaltılmış olabilir (örneğin.. 2-3 dk vs her 15-30 sn) daha iyi mitotik fenotipleri görselleştirmek için. Farklı probları kullanılabilir (örneğin, yerine HAM-1 kullanarak:. GFP, floresan-etiketli DNA H2B görselleştirmek için kullanılabilir ve / veya floresan tübülin mitotik iğ görselleştirmek için kullanılabilir etiketli). Z-yığınları ve her bir yığını için kalınlığı sayısı da (daha küçük bir basamak boyutu, örneğin daha fazla yığınları) değiştirilebilir. Uygun ayarları seçimi, yukarıda tarif edildiği gibi, fototoksisite sınırlayan ve görüntü kalitesini optimize etmek için çok önemlidir. Olsa MCherry: PH ve HAM-1: GFP sondalar mümkün olmayabilir, bu protokolü açıklanan ne vs uzun süre Z-yığınlarının veya görüntüleme sayısını artırarak, daha hızlı puan toplayarak, nispeten yüksek seviyelerde ifade Bir widefield sistemi üzerinde. Java tabanlı imyaş işleme programı (İmageJ, NIH) farklı mikroskoplar ve görüntüleri ile toplanan görüntüleri işlemek için kullanılabilir TIFF olarak ihraç edilebilir. Ancak, satın alma için kullanılan yazılıma bağlı olarak, dosyalar zaten işleme yazılımı ile uyumlu olabilir. Meta özgün dosyaları ile tutulur, çünkü orijinal dosyaları vs ihraç görüntüleri (örn. TIFF) açmak için iyidir. Işleme yazılımı rakamlar veya film yapmak için görüntüleri işlemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, kantitatif analiz, aynı zamanda, seçilmiş bölgelerde piksel yoğunlukları ölçüm olarak, gerçekleştirilebilir. Optimal yazılım gibi Görüntü İşleme Toolbox (MathWorks, Matlab) veya 3D ve 4D Real-Time Etkileşimli veri görselleştirme (Imaris, Bitplane) gibi, analize bağlı olarak seçilmelidir. Bu protokolü kullanarak, ani-1 Bu erken embriyo sitokinez için gerekli olmasa da, neuroblast sitokinez için gerekli olduğu gösterilmiştir. İlginç bir şekilde, nu kontrol ederekNöro-blastlar örten epitel hücrelerine, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlamak için mber ve neuroblasts konumu, ani-1, ventral muhafazası için ventral epidermal hücrelerin göçünü düzenleyebilir. Ani-1 ara geç embriyojenez sırasında bölünme ya da diğer hücre tipleri şekil değişikliği için gerekli olan, ancak, bu bilinmemektedir. Bir doku genel bileşimi komşu dokuları nasıl etkilediğini gösteren metazoan gelişimi sırasında doku iletişimin önemini vurgulamaktadır.

Nasıl görüntü hücre bölünmesi için erken C. anlatan protokoller var olsa elegans embriyo, bu protokol nasıl görüntü hücre bölünmesi orta Embriyogenez sırasında bir doku içinde açıklanır. Gelişimi sırasında organizmaların görüntülenmesinde önemli zorluklardan biri fototoksisite onların duyarlılık olmuştur. Ancak, dönen bir disk konfokal mikroskoplar veya süpürüldü alan mikroskoplar artan erişilebilirlik daha yaygın görüntüleme uygulamaları izin verdi. Her iki sistem de organizmalar maruz kaldığı UV sınırlandırarak, katı hal lazerleri ve dağınık ışık kullanır. Ancak, Widefield standları hala yüksek duyarlılık (örn. EMCCD), diyafram denetimi ve ışık kontrolü (örneğin, LED&#39;ler veya ayarlanabilir cıva ampul) ile kameralar ile donatılmış olan, özellikle in vivo görüntüleme için kullanılabilir. Bu protokol, C, gelişmekte olan görüntü hücre bölünmesi için bir konfokal tabanlı bir sistem veya bir widefield sistemi ya nasıl kullanılacağını açıklar elegans &lt;/ Em&gt; embriyolar. Örnek olarak, biz nasıl resim neuroblast hücre bölünmesini açıklayınız. Nöro-blastlar örten epidermal hücrelere, kimyasal ya da mekanik ipuçları sağlayarak epidermal morfolojilerinden kolaylaştırmak ve dokuların oluşumunda arası iletişimin önemi mükemmel bir örnek sağlayabilir. Caenorhabditis elegans şeffaflığıyla ve basit doku organizasyonu 1 nedeniyle mikroskopi tabanlı çalışmalar için ideal bir model organizmadır. Ayrıca, C. elegans genetik yöntemler ve RNAi için uygun olan, ve genlerin çoğu insan homologlarını beri, bu doku oluşumu için 2-5 korunmuş mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir. C. In Embriyo&gt; 300 hücreleri olduğunda elegans, epidermis oluşumu, orta embriyojenez sırasında oluşur. Epidermal morfogenez embriyo büzülür epidermal hücrelerin bir tabaka içine ve embr dönüştürmek için uzanan bir süre boyunca birkaç büyük aşamadan oluşurBir solucan 6&#39;nın uzun oval bir şekil formundan yo. Ventral epidermal hücreler embriyonun ventral yüzeyi (Şekil 1) kapsayacak şekilde ventral orta hat doğru geçiş yaparken, ventral muhafaza, bu morfogenetik olaylardan birini açıklamaktadır. İlk olarak, anterior bulunan öncü hücrelerin iki çift kontralateral komşularıyla 6 ile ventral onlar uygun orta hat ve sigorta doğru göç. Bu, ventral cep 6-7 oluşturma şekiller gibi kama oluşturan merkezi bir arka cep hücrelerinin taşınması takip eder. Cebi kapatır mekanizması iyi anlaşılmamıştır. Bir olasılık, bir supracellular aktin miyozin kasılma yapısı 8 yara iyileştirici benzer, moda gibi bir çanta dize birlikte cep hücreleri bağlar olduğunu. İlginç bir şekilde, cep hücrelerin bazı göç epidermi altında bulunan temel neuroblasts 9 (nöronal ön-maddeleri arasında, belirli alt-aracılık eders, Şekil 1 B). Önceki çalışmalar nöro. VAB-1 (efrin reseptörü) ve VAB-2 (efrin ligand) yüksek neuroblasts olarak ifade edilmiştir ve birbirinden anterior ve posterior neuroblasts sıralama kolaylaştırmak edilir ventral epidermal hücre göçü ve ventral muhafaza düzenleyen gösterdi, ve VAB-1 veya VAB-2 neden ventral muhafaza mutasyonlar 10-13 fenotip. Bununla birlikte, promotör kurtarma deneyler VAB-1, aynı zamanda neuroblasts salgıladığı diğer rehberlik ipuçlarının için üstte ventral epidermal hücreleri ve reseptör olarak gerekli olduğunu göstermiştir ventral epidermal hücrelerinde 9 olarak ifade edilmiştir. Bu reseptörlerin herhangi mutasyonlar ventral muhafaza fenotiplerini neden olsa da kusurları nedeniyle neuroblast konumlandırma veya bağlı rehberlik yanıt ventral epidermal hücrelerin başarısızlık 14 istekalar Sorunlara ortaya çıkması durumunda, bu açık değildir. Nöroblastlar wi bölümü değiştirilmesirehberlik ipuçları salgılama yeteneğini etkileyen thout neuroblasts rolü ve epidermal morfolojilerinden sırasında mekanik girdi sağlama yeteneği ışık tutabilir. Son zamanlarda, bir hücre bölünmesi geni, ani-1 (anillin) yüksek neuroblasts (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir ve tükenme neuroblast bölme kusurlarına neden olduğu bulunmuştur. İlginçtir, bu embriyolar ventral muhafaza fenotipleri (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) gösterilecek. Anillin hücre bölünmesi için gerekli olan ve özellikle de, bir ana hücre fiziksel olarak iki yavru hücrelere bölündüğü işlemi tarif sitokinez, içindir. Sitokinler sıkıca düzgün kardeş kromatid ayrılması ile birlikte olduğundan emin olmak için mekan ve zaman olarak kontrol edilmesi gereken bir aktomizin kontraktil halka oluşumu ile tahrik edilir. Metazoan sitokinez ana düzenleyicisi RhoA (C. elegans RHO-1), bir küçük bir GTPaz olduğunuonun GTP-bağlı formda yönerge. GEF Ect2/ECT-2 RhoA-GTP kontraktil halka oluşturur ve girişini 15 aracılık eden alt baş efektörlerinin ile etkileşime sonra, RhoA etkinleştirir. Anillin C-terminalinde ile ve N-terminal ile aktin ve miyozin için RhoA bağlanan bir çok alan bir proteindir. Anillin memeli veya Drosophila S2 hücreleri 16 kontraktil halkanın konumunu stabilize etmek için gereklidir. Anillin tükenmesi yanal salınımlar geçmesi kasılma yüzük olur, ve sitokinez sonunda çok çekirdekli hücreler 17-19 oluşturulması başarısız. İlginç bir şekilde, her ne kadar C. elegans ani-1 it sitokinez için gerekli değildir, erken embriyo aktomizin kasılmasını koordine eder. Yukarıda açıklandığı gibi Ancak, ani-1 orta Embriyogenesis (Fotopoulos, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) sırasında neuroblast sitokinez için gereklidir. Sitokinez başarısızlık neuroblasts sayısını ve konumunu değiştirecek ve loc etkileyebilecekKimyasal rehberlik ipuçlarının tirme ya da doku mekanik özelliklerini değiştirebilir. Her iki model de ventral muhafaza için neuroblasts otonom olmayan rolünü, ve embriyonik gelişim sırasında doku doku iletişimin önemini vurgulamak. Bu deneysel protokol anlatıyor görüntü hücre bölünmesi sırasında C. elegans floresan mikroskopi kullanılarak orta embriyogenezis. Hücre bölünmesi mekanizmalar üzerinde çalışmaya Deneylerin çoğu hücre sınırlı sayıda (örneğin C. tek hücreli embriyo, Xenopus veya echinoderm elegans ile kültür tabaklarında (örn.. HeLa veya S2 hücreleri) tek hücre ya da erken embriyolar gerçekleştirilmiştir embriyo). Ancak, bu bölünme uçağın zamanlaması ve yerleştirme etkileyebilecek dış ipuçları olduğu gibi, aynı zamanda dokuların içinde hücre bölünmesi çalışma için önemlidir. Ayrıca, hücreler komşu doku gelişimini etkilemek için kimyasal veya mekanik ipuçları verebilirs, ve hücreler arası iletişim gelişimi sırasında meydana dokuların nasıl yardımcı anlamak önemlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1056">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Agar</td>
			<td style="width:247px;">BioShop Canada Inc.</td>
			<td style="width:185px;">#AGR001.1</td>
			<td style="width:335px;">For making C. elegans NGM and RNAi plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#9002-18-0</td>
			<td>For making bacteria LB agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#AGA001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse Alexa 488 antibody</td>
			<td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td>
			<td>#A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse anti-GFP antibody</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11814460001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-rabbit Alexa 568 antibody</td>
			<td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td>
			<td>#A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#AMP201.5</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C and dissolved ampicillin at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bactopetone&#160; (peptone-A)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#G213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 (calcium chloride)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#C302.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#CHL380.25</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>#D9542</td>
			<td>Use to stain nucleic acids (DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#GLY001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG (isopropylthio-&#946;-galactoside)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#367-93-1</td>
			<td>Store powder and dissolved IPTG at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#PPM666.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#PPD303.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L4440&#160; (feeding vector)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#1654</td>
			<td>Keep as glycerol stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;&#160; (magnesium sulfate)</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#MAG511.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (sodium chloride)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic)</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>#035-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#A10877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>#P8920</td>
			<td>For optimal results coat microscope slides three times&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#STP101.50</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C and dissolved streptomycin at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracyclin</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#TET701.10</td>
			<td>Store powder at 4 &#176;C and dissolved tetracycline at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>CAS#9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>#TRP402.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bio Basic Inc.</td>
			<td>#8013-01-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing neuroblast cytokinesis during c. elegans embryogenesis

Bu protokol, Caenorhabditis elegans, gelişmekte olan embriyo bölünen hücreleri görüntüye floresan mikroskobu kullanımını tarif eder. Özellikle, bu protokol epidermal hücrelerin altında bulunan ve epidermal morfogenezisi önemli olabilir neuroblasts, bölünmesi nasıl görüntü üzerinde duruluyor. Doku oluşumu metazoan gelişimi için çok önemlidir ve komşu dokuların dış işaretlere dayanmaktadır. C. elegans mikroskobu ile çalışmak için kendi dokuları kolay hale nedeniyle şeffaflık ve basit organizasyon in vivo doku morfogenetiğine incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Ventral muhafaza embriyonun ventral yüzey epitel hücrelerinin tek bir tabaka ile kaplanmıştır süreçtir. Bu olay örten epitel hücrelerinin göçüne aracılık kimyasal rehberlik ipuçları sağlamak temel neuroblasts, kolaylaştırılabilir düşünülmektedir. Bununla birlikte, son derece nöro-proliferatif ve aynı zamanda hareket edebilirventral epidermal hücreler için mekanik bir alt-tabaka olarak. Bu deney protokolü kullanılarak yapılan çalışmalar, doku oluşumu sırasında arası iletişimin önemini ortaya çıkarmak olabilir, ve gelişmekte olan dokular içinde hücre bölünmesi ile ilgili genlerin rollerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Bu deneysel protokol nasıl C. görüntü hücre bölünmesi açıklanmaktadır elegans ortalarında Embriyogenez sırasında embriyolar. Özellikle, epidermal morfolojilerinden kolaylaştırabilir ki ne resim neuroblasts için tarif etmektedir. Epidermal morfogenez nedeniyle epidermal hücre şekli değişiklikleri, göç ve yapışma, aynı zamanda altında yatan neuroblasts (Şekil 1 B) kimyasal ya da mekanik ipuçları dayanır bir arada oluşur. Nöro-blastlar göç 10,14,25 düzenleyen ventral epidermal hücrelerin yüzeyi üzerindeki reseptörler ile alınan yönlendirme ipuçları salgılar. Ayrıca, nöro-ventral epidermal hücrelerin 26 göç katkı mekanik kuvvetler sağlamak olabilir ki, yüksek proliferatif. Bu protokol, orta embriyojenez sırasında neuroblast hücre bölünmesi incelemek için kullanılabilir. Birincisi, neuroblasts görselleştirmek için belirteçleri coexpressing embriyolar: sitokineze geçiren (HAM-1 GFP) (mCherry: PH) oluşturulur. HAM-1: GFP GFP (yeşil floresan protein) çekirdek 27 neuroblast lokalize protein etiketli ifade eder ve orta embriyojenez sırasında mevcut bir çok diğer hücre tipleri (&gt; 300 hücre, Şekil 3) vardır çünkü kullanmak gereklidir. DNA, mitoz sırasında kromozomların yoğunlaşır, bu durum, aynı zamanda, hücre bölünmesi için iyi bir belirteci olarak işlev görür. MCherry: PH anne promoteri (pasta-1) ile ifade edilen bir mCherry-etiketli floresan protein ve hücre zarlarına lokalize PLC1 ∂ 1 ile 28 arasındaki lipid bağlama alanını içerir. Şekil 3;, Video 1) Bu protein, zar ve sitosol iki yavru hücrelere ana hücrenin ayrılması için tutam zaman, sitokinez görselleştirmek için gereklidir. , Diğer belirteçler diğer hücre tiplerini görselleştirmek için kullanılan olabilir: Bu protokol nasıl (GFP ifade HAM-1 ile gösterilen) görüntü neuroblast bölümü, açıklanır rağmen. Neuroblasts bölünmesi görselleştirmek için, embriyolar coexpsalamura HAM-1: GFP ve MCherry: PH (10 dakikalık bir toplam) her 2 dakikada bir görüntülü. Her neuroblast çapı sadece 1-4 ~ mikron ve 1 mikron kalınlığında &lt;olduğunu ve yüksek büyütme (örn.. 100X) ile bir objektif kullanmak en iyisidir. Ayrıca, çok sayıda Z-yığınları (~ 20) (şekil olarak küresel) her hücrenin çeşitli açıları görüntülü emin olmak için küçük bir adım boyutu (0.2 mikron) ile toplanır. Zaman noktaları ödün vermeden bu pek görüntüleri toplamak için, bir çok motorlu aşama (örneğin Piezo Z Aşama) tavsiye edilir. Görüntüler bir dizi toplama sonra, DNA, yoğunlaştınlır membran ingressed ve yeni kız hücreler (birleştirilmiş kanal öngörülen istifinin zaman noktaları oluşturan, bölünen birkaç Z-yığınları içinde hücreleri bulmak için analiz edilmektedir ) video 1, Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, ve birleştirilmiş kanallarının seçilmiş yığınları Şekil 3B&#39;de gösterilmiştir. Daha iyi hücreleri görselleştirmek için, önerilirGri tonlamalı her kanalı tutmak ve (Şekil 4) görüntüleri ters. Görüntü çözünürlüğü, yüksek çözünürlüklü CCD kamera (1344 x 1024 piksel) vs kullanarak widefield sistemi için farklıdır. yüksek hassasiyet (~ 35 kare / sn ve 512 x 512 piksel) ile yüksek hızlı EMCCD kamerayı kullanarak süpürüldü alan sistem. Her iki sistemde ile çekilen kontrol embriyolar neuroblasts bölen ters çevrilmiş görüntüleri karşılaştırılması (. Vs 5 Şekil 4) sunulmaktadır. Şekil 4A (Widefield sistemi; Video 2) gösterildiği gibi., Görüntüleri Şekil 5A vs daha net (süpürüldü alan sistem, Video 4). Widefield sistemini kullanarak Ancak, embriyolar fototoksisite duyarlıdır ve daha hızlı bir zaman noktaları yüksek çözünürlüklü kamera ile mümkün değildir. Örneğin, çeşitli proteinlerin lokalizasyonu (örneğin,. T değişiklikleri incelemeko) kendi dinamikleri değişiklikleri incelemek, zaman noktaları daha sık toplanan gerekebilir. Ayrıca, Z-yığınları ve zaman noktalarının sayısını azaltmadan daha uzun süre için görüntünün mümkün olmayabilir. Widefield sistemde bir EMCCD kamera kullanarak görüntüleme uygulamaları geniş bir yelpazede izin verebilir. Yüksek çözünürlük ve yüksek hız hem de sahip kameralar geliştirilmiştir, ancak sürücüleri kullanılan satın alma yazılıma bağlı olarak mevcut olmayabilir, ve hala EMCCD kameralar gibi hassas olmayabilir. Genel olarak görüntüleme C için kullanılan bir başka sistem elegans da alt fototoksisite vardır ve (Tartışma) EMCCD veya CCD ya kameralarla donatılmış olabilir dönen disk konfokal vardır. (, Bölüm 1.2 ve protokol 3 bakınız, örneğin ani-1) ve bunların contro embriyolar aynı şekilde görüntülenmiş hücre bölünmesi için gerekli olan genleri incelemek için, çift cinsiyetli ilgi konusu bir gene karşı RNAi ile muamele edilirl embriyolar. Embriyolar kontrol RNAi embriyolardan hücre karşılaştırmak için, (maç hücre şekilleri ve pozisyonları yardım) embriyonik gelişim benzer aşamalarında görüntünün en iyisidir. Örneğin, görüntüleme neuroblasts için iyi bir referans noktası olarak hareket (Şekil 4 ve 5) için ventral muhafaza sırasında embriyonun merkezinde görünür büyük bir hücre vardır. Gen burada çalışılan, ani-1 (anillin), aktomizin kasılma düzenler, fakat erken embriyo 23,29-30 in sitokinez için gerekli değildir. Anillin en homologları, ancak, daha yüksek ökaryotlarda 16 sitokinez için gerekli olan ve ani-1 neuroblast sitokinez (FOTOPOULOS, Wernike ve Piekny, yayınlanmamış gözlemler) için gereklidir. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, (Video 3) ve 5B (Video 5), çeşitli nöro-sitokinez başlatmak ve membranlar olarak tutam, ancak bunun yerine iki ayrı kızı oluşturabilenHücreler, bunların membranlar gerileme ve hücreler, (&gt; 1 çekirdek / hücre) çok çekirdekli hale gelir. Bu ani-1 Bu protokol ile ortaya değildir, diğer hücre türlerinin bölünme ya da şekil değişikliği için gerekli olabileceğini belirtmek gerekir. Ayrıca, bu protokol doku spesifik RNAi (Tartışma) sonuçlarını göstermek değildir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig1.jpg" /> Şekil 1. C. sırasında ventral muhafaza elegans epidermal morfogenez. Bir kontrol ajm-1 A) Z-yığın projeksiyonları (0.5 mikron kalınlığında 3 Z-yığınlarının): GFP (epidermal hücre sınırlarını görselleştirmek adherens kavşak işaretleyici; CGC SU159 suşu ID) embriyo geçiren dorsal ardalaması (sol, dorsal görünümü ) ve bir kontrol AJM-1: GFP embriyo geçiren ventral muhafaza (sağ, ventral görünüş). Görüntüler daha iyi vis döndürülürhücre sınırlarını ualize. B) Çizgi C ventral görünümleri göstermek ventral muhafaza geçiren elegans embriyolar. Öncelikle, öncü hücreler (mavi) iki çift ventral orta hat (solda embriyo) doğru göç aktin zengin filopodia (siyah çizgiler) kullanın. (; Siyah noktalı çizgi / daire, yara iyileşmesi anımsatan B &#39;) 25 Sonraki, posterior ventral cep hücreleri (kırmızı), bir mekanizma gibi bir çanta dize ile kapanabilir ventral yüzeyinde delik oluştururken orta hatta doğru göç ederler. Ayrıca (gri daire gibi) temel Nöroblastlar da gösterilmiştir. İkinci embriyo (B &quot;) epidermal hücrelerin spesifik alt kümelerinin göç PLX-2/plexin ve VAB-1/Ephrin reseptör ifade &#39;plexin bant&#39; hücreleri (yeşil düzenlemesiyle oluşan bir &#39;köprü&#39; tarafından yönlendirildiğini gösterir daireler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/51188fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın</a>. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig2.jpg" /> C. Şekil 2. ANI-1 lokalizasyonu elegans embriyolar. A) sabit bir C. HMR-1 ifade elegans embriyo: GFP; GFP (yeşil) ve ANI-1 (kırmızı) için costained (E-kaderin epidermal hücre sınırları marker). . Dış hücre katmanları (kalınlığı 0.2 um 4 Z-yığınlarının) konfokal görüntüleri N2 ve N2 Sabit örten epidermal hücreleri ve ANI-1 pozitif B, altta yatan neuroblasts) göstermek; ani-1 RNAi embriyolar için lekeli işbirliği vardır ANI-1. ANI-1 büyük ölçüde ani-1-tükenmiş embriyo azalır. Ölçek çubukları:. 10 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/51188fig2highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig3.jpg" /> Şekil 3,. Görselleştirme C. sırasında neuroblast bölünmesi elegans embriyogenezis. Ve MCherry GFP (yeşil neuroblast çekirdek görselleştirmek için): (A) Z-yığın uzantısı (kalınlığı 0,2 um ile 20 Z-yığınlarının) HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyodan gösterilmiştir PH (hücre zarları görselleştirmek için kırmızı) . Birçok Nöroblastlar ve diğer hücre tipleri projeksiyonlar görünür Z uçaklar daha küçük bir sayı kullanarak (B) Z-yığın projeksiyonlar coexpressing başka bir kontrol embriyo gösterilmiştir HAM-1:. GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Bir alan daha net bir bireysel bölme neuroblast göstermek için (beyaz kutu) büyütülür. Beyaz ok başları yeni mitoz sırasında yoğunlaştırılmış DNA vurgulamak ve bir bölme hücre ve yeşil çevrelerin ingressing plazma zarı işaretmitoz sonuna doğru kız çekirdekleri oluşturulur. Büyük hücreli embriyonun içinde gelişim aşamasını ve konumunu belirlemek için bir referans noktası (beyaz yıldız) olarak hizmet vermektedir. Ölçek çubukları:. 10 mikron (beyaz) ve 3.5 mikron (sarı) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/51188fig3highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig4.jpg" /> Şekil 4. C. sırasında neuroblast sitokineze görselleştirme elegans bir widefield sistemini kullanarak Embriyogenezis. A) Ters Z-yığın projeksiyonları (kalınlığı 0.2 mikron 2 Z-yığınlarının) coexpressing bir kontrol embriyo gösterilmiştir HAM-1: GFP ve mCherry: yüksek çözünürlüklü bir CCD kamera kullanarak widefield sisteminden toplanan PH. Kırmızı oklar i ile bölünmesi nöroblast işaretHücre zarları ngressing. Yeşil çevrelerinde mitoz erken aşamalarında özet DNA vurgulamak veya yeni mitoz / sitokinez sonuna doğru kızı çekirdek oluşturarak. Gösterilen büyük hücreli gelişim evresini belirlemek için bir referans noktası (sarı yıldız) olarak hizmet vermektedir. B) Images) A benzer, fakat ani-1 RNAi ile tedavi bir embriyo vardır. Hücre zarı hücre mitoz yoluyla ilerler ancak çok çekirdekli hücre bırakarak, kısa bir süre sonra rahatlatır olarak ingresses. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (siyah), 3.5 mikron (sarı) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/51188fig4highres.jpg" target="_blank">büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51188/51188fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51188/51188fig5.jpg" /> Şekil 5. C. sırasında neuroblast sitokineze görselleştirme<html> elegans süpürdü alan sistemi kullanılarak Embriyogenezis. 0.2 mikron (toplam 0.4 mikron 2 Z-yığınlarının) A) Ters Z-yığın projeksiyonları HAM-1 coexpressing bir embriyodan gösterilir: GFP ve MCherry: yüksek hassasiyet ile bir EMCCD kamera kullanarak süpürüldü alan sistem toplanan PH, ama düşük çözünürlük. Bir neuroblast geçiren sitokinez için kırmızı ok ucu noktaları. Yeşil çevrelerinde mitoz ve sitokinez sonra yeni oluşan kızı çekirdeklerin sırasında yoğunlaştırılmış DNA vurgulayın. Büyük hücreli gelişim evresini belirlemek için bir referans noktası (sarı yıldız) olarak hizmet vermektedir. Gösterilmiştir B) Images) A benzer, fakat ani-1 RNAi ile tedavi bir embriyo, ve 3 Z-yığınlarının (toplam 0.6 mikron kullanılmaktadır .) Yukarıda tarif edildiği gibi, daha sonra zar mitoz yoluyla hücre ilerledikçe olarak giriş yapan, fakat, hücre çok çekirdekli olmasına neden rahatlatır. Ölçek çubuğu: 10 mikron (siyah), 3.5 mikron (sarı).188/51188fig5highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. Video 1. C. sırasında bölünmesi neuroblasts görselleştirme elegans embriyogenezis. HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonlar: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Widefield mikroskop toplanan Görüntüler her iki kanal için gösterilmiştir. Video Şekil 3B üçüncü panelinde gösterilen embriyo gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/Video1.mov" target="_blank">Videoyu izlemek için tıklayın.</a> Video 2. C. sırasında bölünmesi neuroblasts görselleştirme elegans embriyogenezis. HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonlar: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video mCherry için widefield mikroskop toplanan ters görüntülere karşılık: PH kanal only (Şekil 4A embriyo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/Video2.mov" target="_blank">Videoyu izlemek için tıklayın.</a> Video 3. C. sırasında bölünmesi neuroblasts görselleştirme elegans embriyogenezis. Bir ani-1 RNAi tedavi edilen embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonları coexpressing HAM-1: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video mCherry için widefield mikroskop toplanan ters görüntülere karşılık gelir:. PH kanal sadece (Şekil 4B embriyo) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/Video3.mov" target="_blank">video izlemek için tıklayınız.</a> Video 4. C. sırasında neuroblast bölünmesi görselleştirme elegans embriyogenezis. HAM-1 coexpressing bir kontrol embriyo iki Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonlar: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video ters tekabülmCherry için süpürüldü alan konfokal mikroskop toplanan görüntüleri ed:. PH kanal sadece (Şekil 5A embriyo) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/Video4.mov" target="_blank">video izlemek için tıklayınız.</a> Video 5. C. sırasında neuroblast bölünmesi görselleştirme elegans embriyogenezis. Bir ani-1 RNAi tedavi edilen embriyo üç Z düzlemleri (0.4 mikron / uçak) Z-yığın projeksiyonları HAM-1 coexpressing: GFP (yeşil) ve MCherry: PH (kırmızı). Video mCherry için süpürüldü alan konfokal mikroskop toplanan ters görüntülere karşılık gelir:. PH kanal sadece (Şekil 5B embriyo) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51188/Video5.mov" target="_blank">video izlemek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis at JoVE.com

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

visualizing-neuroblast-cytokinesis-during-c-elegans-embryogenesis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

11.8K Görüntüleme.  Concordia University.  Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken. 

Video: Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Nörobilim

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Uzun vadeli Olfaktör İntibak A Moleküler Saati<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Locomotion Speed ​​Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...