Marie Persson Vejgården teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma New York kök hücre Vakfı, Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı altında fon aldı: FP/2007-2013 nöro kök hücre tamir (no. 602278) ve ERC hibe sözleşmesi yok. 30971, İsveçli Araştırma Konseyi (hibe sözleşmesi 521-2012-5624, 2016-00873 ve 70862601 / Bagadilico), İsveçli Parkinson Vakfı (Parkinsonfonden) ve Lund Üniversitesi Multipark (çok disiplinli araştırma, stratejik araştırma alanı Parkinson hastalığı). Janelle Drouin-Ouellet, arayan sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) Bursu (#358492) tarafından desteklenmektedir ve Roger Barker desteklenmektedir University of Cambridge/Addenbrooke'nın hastaneye bir NIHR Biyomedikal Araştırma Merkezi hibe. Malin Parmar bir New York kök hücre Vakfı Robertson dedektif olduğunu. Shelby Shrigley Marie Skłodowska-Curie yenilikçi eğitim ağı ve hibe sözleşmesi No 676408 altında Avrupa Birliği ufuk 2020 program (H2020-MSCA-ITN-2015) tarafından finanse edilmektedir.

Yetişkin dermal fibroblastlar ve Parkinson hastalığı araştırma ve Huntington hastalığı klinikler John van Geest Merkezi beyin tamir (Cambridge, Birleşik Krallık) için elde edilen ve yerel etik onayı (REC 09/H0311/88) altında. Cilt biyopsisi örnekleme yordamı hakkında ayrıntılar için bkz: başvuru8.
1. yeniden programlama için hazırlanması cilt fibroblastlar
<ol><li>Sistem veya 37 ° C su banyosu çözdürme otomatik bir hücre kullanarak, yetişkin insan dermal fibroblastlar (aHDFs) çözülme ve 200.000 T75 şişeye (olan bir otomatik hücre sayaç sayısı) fibroblast orta 10 mL başına plakası (bkz. Tablo 1) 37 ° c % 5 CO2.</li>
	<li>Tam bir orta değişim fibroblast orta ile ertesi gün gerçekleştirmek.</li>
	<li>Fibroblast orta her 3-4 hücreleri % 95 confluency ulaşana kadar gün değiştirin. Not: Bir Konfluent şişesi yaklaşık 1.000.000 hücreler içerir. AHDFs bir hücre kültürünü (Bölüm 2) hisse senedi veya doğrudan yeniden kaplama hazır (Bölüm 3) yeniden programlama için inşa etmek için donmuş olabilir.</li>
</ol>2. cilt fibroblastlar dondurulması
<ol><li>Buz ile bir kutu veya buzdolabı 4 ° C'de kontrollü oranlı dondurma konteyner yerleştirin</li>
	<li>3-5 dk 37 ° C'de % 0.05 tripsin (T75 şişe başına 1,5 mL) hücrelerle ayırmak.</li>
	<li>Fibroblast orta (tripsin (T75 şişe başına her temizlemedeki 3 mL) etkisiz hale getirmek ve iki kez dışarı şişeye hücrelerde temizlenerek 15 mL tüp içinde müstakil hücreleri toplamak için fetal sığır serum (FBS) içeren) ekleyin.</li>
	<li>Otomatik hücre sayaç hücreleri saymak; (önerilen) donma şişe başına yaklaşık 500.000 aHDFs.</li>
	<li>Spin aşağı hücreleri 400 x g 5 min için de.</li>
	<li>Hücre Pelet dondurucu orta 1 mL resuspend (bkz. Tablo 1) ve transfer kriyojenik tüp içine. Tüpler doğrudan kontrol oranı dondurma konteyner yerleştirin.</li>
	<li>-80 ° C'de cihaz gecede buz gibi kontrollü oranı saklayın. Ertesi gün, tüpler-140 ° C dondurucu aktarın ve ihtiyaç kadar depolayın.</li>
</ol>3. (gün 1) yeniden programlama için kaplama
Not: Bu bir jelatin kaplama için kısa vadeli deneyleri (30 gün); kullanma için tavsiye edilir Alternatif olarak, uzun vadeli deneyler için bu bir Poli-L-Ornitin, fibronektin ve laminin (PFL) kaplama başlatmak için tavsiye edilir.
<ol><li>yeniden programlama için aHDFs kaplama önce 60 dk % 0,1 jelatin (250 µL/de) 24-şey plakalı ceket ve 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>AHDFs fibroblast medyada Aspire edin. Bir kez DPBS ile yıkayın. 3-5 dk 37 ° C'de % 0.05 tripsin (T75 şişe başına 1,5 mL) hücrelerle ayırmak.</li>
	<li>Tripsin (T75 şişe başına her temizlemedeki 3 mL) etkisiz hale getirmek ve iki kez dışarı şişeye hücrelerde temizlenerek 15 mL tüp içinde müstakil hücreleri toplamak için fibroblast orta ekleyin.</li>
	<li>Spin aşağı vasıl 400 x g 5 dk. atma süpernatant için hücreleri ve hücre Pelet 1 mL fibroblast orta resuspend.</li>
	<li>(Hücre canlılığı trypan mavi ile % 90 üzerinde boyama kaliteli dönüşüm onay) sağlamak için bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Tam bir 24-şey plaka için orta 100.000 hücre/mL süspansiyon (veya 55.000 hücreler/kuyuda gerekli kuyu sayısı ile çarpımına fibroblast orta 550 µL) elde etmek için fibroblast Orta 13.2 mL 1,320,000 hücrelerinin bir süspansiyon hazırlamak.</li>
	<li>Jelatin plaka Aspire edin ve iki kez DPBS ile yıkayın. Her şey için hücre süspansiyon 500 µL ekleyin ve gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>4. viral iletim (0 gün)
Not: Kategori 2 ekipman ve virüsü nötralize etmek için bir ajan kullanımı lentiviral parçacıkları ile çalışma gerektirir. Çift Kişilik Çift eldiven giyiyor da önemle önerilir.
<ol><li>13.2 mL fibroblast orta 37 ° C'ye kadar sıcak</li>
	<li>Ascl1 ve geri kalan oda sıcaklığında hedefleme Brn2 iki kısa saç tokası RNA'ların (shRNA) ile transkripsiyon faktörleri içeren bir lentiviral vektör yaz. Not:8başvurmak için bakın; yapı bir plazmid depoda mevcut olduğunu. Lentiviruses üretmek için yordamı hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen9referans bakın.</li>
	<li>Lentivirus enfeksiyonu (MOI) çokluğu, aHDFs bulaştırmak için gerekli hacmi olmadan herhangi bir iletim arttırıcılar orta 20 ekleyin. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56904/56904eq1v2.jpg">
</li>
	<li>24-şey plaka ortamda lentiviral vektör (500 µL/de) içeren fibroblast orta ile değiştirin ve gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, lentiviral vektör olmadan fibroblast taze orta Wells orta yerine. Not: Orta 7 gün boyunca bulaşıcı olarak kabul edilir ve bu nedenle, yeterli koruma ve işleme yordamlarını viral iletim takip ilk haftasında kullanılmalıdır.</li>
</ol>5. bakım dönüştürme hücre
Not: dönüşüm başladıktan sonra hücre kaldırma için duyarlı; plaka uç ve önlemek için medya kaldırma hücreleri ayırma 1.000 µL pipet kullanın için dikkat ediniz.
<ol><li>Gün 3, fibroblast orta kaldırın ve erken nöronal dönüşüm orta 500 µL ekleyin (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Haftada 2-3 kez, 225 µL kuyudan eski orta ve eklemek-içinde 250 µL taze erken nöronal dönüşüm orta al.</li>
	<li>Gün 18, tüm Orta her kuyudan kaldırmak ve geç nöronal dönüşüm orta 500 µL ile değiştirin (bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Geç nöronal dönüşüm orta ile orta yarısı 2-3 günde 25 gün veya deneme bitiş noktası (şekil 1A) kadar değiştirmek için devam edin. Not: hücreler her iyi deney için kaplama değil, boş wells orta açık buharlaşma önlemek ve kuyular arasında varyasyon en aza indirmek için PBS veya su ile doldurun.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Hisse senedi toplama</td>
			<td>Çalışma konsantrasyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Fibroblast orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bazal orta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penisilin/streptomisin</td>
			<td>10.000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>% 10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Dondurucu orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fibroblast orta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>% 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>N/A</td>
			<td>% 45</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMSO</td>
			<td>N/A</td>
			<td>% 10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Erken nöronal dönüşüm orta (ENM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sinirsel farklılaşma orta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penisilin/streptomisin</td>
			<td>10.000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB-431542</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kafa</td>
			<td>100 µg/mL</td>
			<td>0,5 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDN-1931189</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>VPA</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LM-22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF</td>
			<td>20 µg/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NT3</td>
			<td>10 µg/mL</td>
			<td>10 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>DB-kampı</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Geç nöronal dönüşüm orta (LUH)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sinirsel farklılaşma orta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penisilin/streptomisin</td>
			<td>10.000 U/mL</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>LM-22A4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>2 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>GDNF</td>
			<td>20 µg/mL</td>
			<td>2 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NT3</td>
			<td>10 µg/mL</td>
			<td>10 ng/µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>DB-kampı</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">FACS arabellek</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS 1 x [- kalsiyum, magnezyum, - fenol red]</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>% 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNAase</td>
			<td>N/A</td>
			<td>% 0.05</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: kullanılan farklı medya bileşimi. Fibroblast orta de dahil olmak üzere, orta, erken nöronal dönüşüm orta, geç nöronal dönüşüm orta ve FACS arabellek buz gibi bu protokol için gerekli tüm medya için kompozisyon tam açıklaması.
6. cam Coverslips Elektrofizyolojik kayıtlar için
Not: Bu bir laboratuar önlüğü, gözlük takmak, eldiven çift ve tüm duman başlıklı çalışmaları tamamlamak için tavsiye edilir. Bu 10' dan adapte iletişim kuralıdır.
<ol><li>Cam coverslips alt çakışma olmadan bir cam tabak koyun.</li>
	<li>Genel laboratuvar deterjan tüm riski taşma olmadan coverslips (yaklaşık 30 mL) sallayarak sırasında daldırın temizlik ekleyin. Yavaş hızda bir orbital Çalkalayıcı 2s için üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Altı kez (30 dk her) autoclaved deiyonize su ile yıkayın.</li>
	<li>% 95 etanol 2s için ekleyin.</li>
	<li>Etanol kaldırmak ve coverslips kuru kadar bekleyin.</li>
	<li>Bir kez kuru, coverslips bir cam kabı aktarmak ve coverslips batık kadar % 70 nitrik asit ekleyin.</li>
	<li>60 dk sonicator banyo cam kabı yerleştirin.</li>
	<li>Nitrik asit kaldırmak ve üç kez autoclaved deiyonize su ile yıkayın. Dikkat: Bu şiddetli bir tepki neden olabilir gibi her zaman asit su, asla başka bir yol ekleyin.</li>
	<li>Kadar su kabı mümkün olduğunca kaldırın ve coverslips batık kadar konsantre hidroklorik asit (HCI) ekleyin; kabı ve parafin film ile kapak girdap.</li>
	<li>60 dk için solüsyon içeren temizleyicide (50-60 Hz, 30 W).</li>
	<li>Kadar HCI coverslips mümkün ve yer olarak uygun bir atık depo gözüne kaldırın. İki kez autoclaved deiyonize suyla durulayın.</li>
	<li>Coverslips başlık dışarı almak ve tüm HCI kaldırılıncaya kadar 20 kez (veya daha fazla) autoclaved deiyonize suyla durulayın.</li>
	<li>Bir kez kuru, coverslips steril 24-şey kalıplara yerleştirin.</li>
	<li>Ultraviyole (UV) altında tabak koyun gecede ışık. Ertesi gün coverslips kullanmaya hazırsınız. Not: cam coverslips kullanılıyorsa, PFL kaplama kullanmak için önerilir. Sadece bir coverslip (steril forseps kullanarak) bir 24-şey plaka her kuyunun içine yerleştirin ve iletişim kuralı aşağıdaki gibi izleyin.</li>
</ol>7. PFL kaplama için uzun süreli kültür
<ol><li>Poli-L-Ornitin (500 µL/de) 24-şey plakalı ceket ve 37 ° c % 5 CO2gece bırakın.</li>
	<li>Poli-L-Ornitin Aspire edin ve form damla üstüne kuru olana kadar bekleyin.</li>
	<li>İyi ve coverslip tüm yüzey kapsayacak şekilde yayılmış bir damla (yaklaşık 60 µL) her Center'da laminin olun. 2 saat 45 dk 37 ° c % 5 CO2için bırakın.</li>
	<li>Üç kez DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Fibronektin (500 µL/de) ekleyin ve 37 ° c % 5 CO2gece bırakın.</li>
	<li>Bir kez DPBS ile hücreleri eklemeden önce yıkayın. Not: 30 günden itibaren beklenen ilerici hücre ölümü olmasına rağmen PFL kaplama bileşenleri (100 gün ve üzeri), uzun dönem kültürleri için kullanılabilir.</li>
</ol>8. FACS
Not: hücreleri yeniden FACS sonra plaka için sıralama hazırlamak PFL kaplı plaka 48 saat önceden. Hücreler nöral hücre adezyon molekülü (NCAM) antikor 20 günden itibaren iletim ardından kullanarak sıralayabilirsiniz.
<ol><li>1000 µL pipet ile medyayı çıkarın (hücreleri ayırma önlemek için yıkama yok).</li>
	<li>Ajan (250 µL/de) dissociating ekleyin, 10-20 dk için hücreleri Asansör ve kayan nokta kadar tek hücreler olarak bırakın.</li>
	<li>Bu süre zarfında FACS arabellek hazırlayın.</li>
	<li>Yavaşça 1.000 µL pipet ile triturate. Bazı kümeleri kalırsa, biraz daha kuluçkaya.</li>
	<li>Bir tek hücre süspansiyon alındıktan sonra kuyudan çıkarın ve 1,5 mL tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Evet iki kez dışarı ile yıkayın geç nöronal dönüşüm orta ve yer aynı 1,5 mL tüp içine.</li>
	<li>Spin aşağı vasıl 400 x g 5 min için ve süpernatant atın.</li>
	<li>Hücre Pelet FACS arabellek 200 µL içinde resuspend.</li>
	<li>Spin aşağı vasıl 400 x g 5 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
	<li>8.8 ve 8,9 adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücre Pelet 50 µL FACS arabelleği at 1:50 15 dakika bir konsantrasyon buz üzerinde insan CD56 (NCAM) antikor içeren resuspend. Işıktan korumak.</li>
	<li>Spin aşağı hücreleri 400 x g 5 min için de.</li>
	<li>200 µL FACS arabelleği yıkamak ve spin 400 x g 5 min için de hücreleri aşağı resuspend.</li>
	<li>8.13 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>FACS arabellek propidium iyodür (PI; 10 µg/mL) içeren 200 µL içinde resuspend. NCAM pozitif (Ins) ve PI negatif (canlı) hücreleri FACS NCAM antikor veya PI ile lekeli değil kontrol örnekleri Floresans yoğunluk düzeyini dayalı geçişi kullanarak sıralayın.</li>
	<li>Geç nöronal dönüşüm orta içeren bir tüp NCAM pozitif hücrelerinin toplamak.</li>
	<li>Geç nöronal dönüşüm orta kaplı PFL tabak içinde bir otomatik hücre sayaç ve yeniden plakası hücreleri bir yüksek yoğunluklu (50.000 hücreleri/cm2) kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Orta yarısı deney bitiş noktası (şekil 1A) kadar 2-3 kez bir hafta geç nöronal dönüşüm orta ile değiştirmek için devam edin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+Reprogrammed+Human+Neurons+Retain+Aging-Associated+Transcriptomic+Signatures+and+Reveal+Age-Related+Nucleocytoplasmic+Defects.">Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects.</a> Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).</li><li>Hashizume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+the+nuclear-coded+GCAT+and+SHMT2+genes+confers+human+age-associated+mitochondrial+respiration+defects.">Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects.</a> Sci Rep. 5, 10434 (2015).</li><li>Lapasset, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejuvenating+senescent+and+centenarian+human+cells+by+reprogramming+through+the+pluripotent+state.">Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state.</a> Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).</li><li>Huh, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+age+in+human+neurons+generated+by+microRNA-based+neuronal+conversion+of+fibroblasts.">Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Drouin-Ouellet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REST+suppression+mediates+neural+conversion+of+adult+human+fibroblasts+via+microRNA-dependent+and+-independent+pathways.">REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways.</a> EMBO Mol Med. , (2017).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-based+conversion+of+human+fibroblasts+into+striatal+medium+spiny+neurons.">MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons.</a> Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).</li><li>Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neural+conversion+from+human+fibroblasts+using+self-regulating+and+nonintegrating+viral+vectors.">Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors.</a> Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).</li><li>Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+functional+neurons+from+adult+human+fibroblasts.">Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts.</a> Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).</li><li>Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Masserdotti, G., Gasc&#243;n, S., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+learning+from+and+for+development.">Direct neuronal reprogramming: learning from and for development.</a> Development. 143, 2494-2510 (2016).</li><li>Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+induced+neurons+from+human+fibroblasts+that+transplantation+into+the+adult+rat+brain.">Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain.</a> Sci Rep. 4, 6330 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu tek-adım/bir vektör yöntemi yeniden programlama iNs insan yetişkin fibroblastlar elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. İnsan yetişkin fibroblastlar önceden verimliliği yaklaşık 5-%1012,13raporlama sınırlı çalışmaları ile fetal fibroblastlar gizli normalde çok daha zordur. Ancak, bu yeni iletişim kuralı ile yaklaşık %508(MAP2 + hücreler olarak ölçülür) nöronal bir verim elde etmek mümkündür. Ayrıca, bizim iletişim kuralı birden çok kez dönüşüm verimliliği kaybetmeden pasajlı bu dermal fibroblastlar kullanılabilir. Şimdiye kadar 14 kez dönüşüm verimliliği herhangi bir azalma tespit olmadan pasajlı hücreleri kullandık. Ayrıca, Kendi ellerimizle fibroblastlar yaş 52 ve 87 arasında bağışçılardan verimliliği yeniden programlama içinde hiçbir fark yoktur. Yaş ve diğer hücre hatları ile bu yapıyı test hastalık hakkında daha fazla bilgi için bkz: başvuru8. Diğer çalışmalarda da 0 ile 89 yaşında4arasında bağış ile bir lentiviral tabanlı ve küçük molekül gelişmiş protokolünü kullanarak dönüşüm verimliliği arasında fark yoktur bildirdi. Ayrıca, miRNA tabanlı nöronal yeniden programlama ile tutarlı uygulanabilirliği ile bağış 0 ile 86 yaş7arasında her yaştan fibroblastlar bildirilmiştir. Bu yönlendirme yolu olgun nöronlar yaklaşık 12-15 hafta vitro veya nakli vivo içinde8takip yaklaşık 8 hafta içinde elde edilebilir. Bu avantajlı çünkü hastalığı ve hasta için erişim sağlar kolayca erişilebilir dokusundan belirli insan iNs. Bu iletişim kuralı verimli olmasına rağmen bir % 100 nöronal verim oluşturmaz ve bu nedenle FACS örneğin kullanarak bir arıtma adım gereklidir.
En kritik bu iletişim kuralına viral iletim (iletişim kuralı Bölüm 4) adımdır. Virüs titresi kesin, aHDFs dönüşüm için doğru bir dizi kaplama ek olarak çok önemlidir. Bu iletişim kuralı ile kullanmak için önerilen titresi 4 x 108 4 x 109arasındadır. Bir şey 1 x 108 aşağıda titresi kullanarak virüs geniş hacimli hücrelere toksik ekleme gibi tavsiye edilir değil. Ayrıca, onlar fibroblastlar iNs gizli başladığınızda daha kırılgan ve kaldırma duyarlı olacak. Hücreleri çok fazla rahatsız etmemek için medya değiştirirken nazik olmak esastır. Bu 1.000 µL pipet yavaşça sıvıyla kaldırarak yapılabilir. Son olarak, ne zaman (iletişim kuralı Bölüm 3) yeniden programlama için kaplama bir deney başlamadan önce sağlıklı fibroblast nüfus sağlamak önemlidir; Bu bir hücre canlılığı trypan mavi boyama ile % 90 üzerinde gösterilir. AHDFs her zaman % 95'i confluency ulaşmadan önce passaged.
Viral iletim önce göze çarpan hücre ölümü ise, dönüştürme başlamayan: çift kontrol hücre canlılığı üzerinde % 90 olduğunu ve kaplama plaka ile herhangi bir sorun vardı. Bu viral iletim takip hücre ölümü küçük bir miktar var bekleniyor, ancak, bu önemli olmamalı. Bu durumda, doğru 50.000 aHDFs/kuyu tohum onaylamak ve virüs titresi kontrol edin. Dönüştürme sırasında kuyular arasında göze çarpan tutarsızlık varsa önce her şey medya eşit miktarda içerir ve aleni buharlaşma kenarlarında gerçekleşmiyor (gerekli ilave medya kenar wells eklenebilir eğer) kontrol edin. Alternatif olarak, adım 4.4 denetleyin ve uygun homojen bir süspansiyon için karıştırma ne zaman transducing emin olun. Lentivirus Orta olarak ilk, bu kuyu eklemeden önce eklemek çok önemlidir. Doğrudan lentivirus kuyu ekleyerek iyi-iyi değişkenlik artıracak ve aynı zamanda hücrelere zehirli olması muhtemeldir. Son olarak, her zaman orta 37 ° C-hücrelere eklemeden önce ısındı kontrol edin.
Bu iletişim kuralı iNs ve nöronal saflık artırmak için sıralama FACS uzun vadeli kültür için kaplama koşulları için isteğe bağlı bölümleri içerir. İşlevsel bileşenlerin karakterizasyonu araştırmak isteyen deneyler için Elektrofizyoloji cam coverslips hazırlanması için bir iletişim kuralı da dahil edilmiştir. Dönüştürme iletişim kuralı burada 24-şey plaka ile kullanmak için ayarlanır; Bu değiştirilebilir bir 6 - 12, 48-, için istenirse 96-şey plaka veya şişeler. Bu durumda, tüm birimlere plaka veya kullanılan flask yüzey alanı ayarlayın lütfen.
Bu iletişim kuralı birlikte Ascl1 ve Brn2 ifade zorla bir pan-nöronal fenotip iNs oluşturmak için tüm paket içinde bir tek vektör8 ile dinlenme köşenize kullanır. Bu yöntemle gliyal herhangi bir alt türlerinden nesil ancak, tespit değil. Bu yöntem bu nedenle alt türü belirli sinir hücreleri elde etmek için programlama diğer faktörler ile kullanmak için değiştirilmesi gerekir. Doğrudan yeniden programlama daha önce motor nöronlar, duyusal sinir hücreleri, photoreceptors, striatal orta dikenli nöronlar ve dopaminerjik nöron10,14oluşturmak için olasılık göstermiştir. Bu nörolojik hastalıklar hangi belirli nöronal alt türü tercihen etkilenen, örnek Parkinson hastalığı ve dopaminerjik nöron için soruşturma yararlı olacaktır.
Çok yakın zamana kadar doğrudan sinirsel programlama teknoloji iNs üretimi için standart ve verimli bir şekilde izin vermedi — bir seviyeye toksikoloji ve ilaç deneyleri büyük ölçüde eleme için gereklidir. Bu yeni yöntem çok verimli ve öyle ki şimdi bu kısıtlamalar ortadan kaldırır ve insan sinir sistemi değil sadece, aynı zamanda hasta belirli olabilir bir sistemi çalışmaları, geniş bir dizi için açılır bu çoğu zaman, pasajlı fibroblastlar kullanılabilir. Bu yaklaşım ve sadeliği içinde teknoloji benzer çalışmalar kurum içi gerçekleştirmek isteyen herhangi bir grup için erişilebilir oluşturur ve kolayca uyuşturucu tarama ve toksikoloji deneyleri, gibi büyük ölçekli Biyomedikal uygulamalar için sadece ama aynı zamanda desteklemek için kullanılabilir veri hayvan modelleri ve insan post mortem doku örnekleri elde.

Nörolojik bozukluklar için etkili tedaviler gelişimi sınırlı erişim ile yaşayan insan beyin hücrelerin mekanik çalışmaları ve işlevsel testleri gerçekleştirmek için engel. Yaklaşık on yıl önce bu durum İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSCs) teknolojisi1,2gelişimi ile kökten değişti. Bu, birlikte daha iyi normal insan gelişimi sırasında meydana gelen sinir farklılaşma mekanizmaları anlamak ile tanımlanmış ve farklı nöronal alt türlerinden gelen hasta ve hastalık belirli malzeme üretimi için izin verdi. Bu malzeme ile Şimdi hücre içi mekanizmalar nörolojik hastalıklar ve farklı bileşikler potansiyel o patolojik özellikler3hafifletmek için temel eğitim mümkündür.
İPSCs nörolojik alana devrimci olmuştur, önemli bir dezavantajı bu hücrelerin yaşlanma imzalarını gençleşmek nöron ile ilişkili güvenlik açığı korumaz şekilde programlama işlemi sırasında silinir iken 4,5,6yaşlanma. Bu özellik üretilen nöron hücre içi patojenik cascade, özellikle yaşlılık önemli bir risk faktörü olduğu hastalıklar söz konusu olduğunda, bir çok yönünü recapitulating için kritik olmuyor olabilir.
Sinirsel yeniden programlama bir teknoloji nerede somatik hücre doğrudan dönüştürülür içine doğrudan bir sahne orta pluripotent gitmeden içinde. Bu için hasta ve hastalık belirli olabilir insan nöronlar vitro olarak hızlı oluşturulmasını sağlar. Doğrudan yeniden programlama, bir olağanüstü donör hücre başlangıç yaşı korunur ve, oksidatif stres4,7' nin üretim süreçleri gibi yaşlanma onun güvenlik arttı özelliğidir. Alzheimer ve Parkinson hastalığı, gibi Biyomedikal uygulamalar modelleme, ilaç deneyleri ve toksikoloji çalışmalar eleme hastalığı da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesi için uygun sonucu olarak, nörolojik hastalıkları olan hastalar INS'den yaşlanma ile ilişkili .
İNs hastalardan yaygın olarak kullanılan nörodejeneratif hastalıklar ile engelledi ana bilmeniz gereken onlar yeniden programlamak kolay değildir ve bu fibroblastlar bir genişlemesi ile daha da zor hale gelir. Sonuç olarak, bu tür uygulamalar için gerekli miktarda hücrelerdeki nesil sadece son8kadar elde edilmiştir değil. Biz şimdi fibroblastlar bağış her yaştan çok verimli bir şekilde yeniden programlamak için basit bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem tek bir vektör kullanarak önleyici protein RE1 susturmak transkripsiyon faktörü (REST) bir nakavt ile zorla ifade Ascl1 ve Brn2 nöronal transkripsiyon faktörlerin birleştirir. Burada, Cilt fibroblastlar yaşlı bağışçılardan biyopsi gelen dönüştürülür iNs nesil önde gelen farklı adımları açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1603">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;width:1603px;">Cell Lines</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adult human dermal fibroblasts&#160;</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:756px;">[C2 passage #7] Donor was a 67 year old male. Cells obtained from the Parkinson&#8217;s Disease Research and Huntington&#8217;s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;">Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA [0.5%]</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute to 0.05% in DPBS.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon (agent used to neutralize virus)</td>
			<td>Viroderm</td>
			<td>7511&#160;</td>
			<td>Dilute to 1% solution with warm water.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Milli-Q Water</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Basal medium - Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL]</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CryoMACS&#174;&#160;dimethyl sulfoxide (DMSO) 10</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>170-076-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neural differentiation medium - NDiff 227</td>
			<td>Takara-Clontech</td>
			<td>Y40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LM-22A4&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4607</td>
			<td style="width:756px;">Dilute 10 mg in 1450 &#181;L DMSO. Stock concentration: 20 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human]</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>212-GD-010</td>
			<td style="width:756px;">Dilute 10 ug in 500 &#181;L 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 &#181;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NT3 [recombinant human]</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>267-N3-025</td>
			<td>Dilute 25 &#181;g in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 &#181;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">db-cAMP&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0627</td>
			<td>Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 &#181;L aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CHIR99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>Dilute 2 &#181;g in 429,8 &#181;L DMSO. Stock concentration: 10 mM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SB-431542</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1661</td>
			<td>Dilute 5 mg in 595 &#181;L DMSO. Stock concentration: 20 mM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Noggin [recombinant human]</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-103-456</td>
			<td>Dilute 100 &#181;g in 100 &#181;L of Milli-Q water + 900 &#181;L 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 &#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LDN-193189</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1509</td>
			<td>Dilute 2 mg in 360 &#181;L DMSO. Stock concentration: 10 mM.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Valproic acid sodium salt (VPA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>676380</td>
			<td style="width:756px;">Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;">Reagents for Coatings</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gelatin&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td>Dilute to 0.1% in Milli-Q water.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Dissolve in Milli-Q water. Use at 15&#181;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">33010-018</td>
			<td style="width:756px;">2 mL of Milli-Q water + 70 &#181;L 0,25 M NaOH. Use at 5 &#181;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">23017-015</td>
			<td style="width:756px;">Store at -80&#176;C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 &#181;L. Use at 5 &#181;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;">Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red]</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14175-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNAase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>Use at 0.05% concentration.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse]</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555518</td>
			<td>Use at 1 : 50.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10&#181;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;">Reagents for Glass Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclaved deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alconox detergent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z273228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol 95%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nitric Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>438073-M</td>
			<td>CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Concentrated hydrochloric acid (HCI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;">Reagents for Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td>Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10254640</td>
			<td>Use at a concentration of 0.1%.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum [Donkey]</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-MAP2 Antibody [Chicken]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>Use at a concentration of 1 : 5,000.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:469px;">Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse]</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MN1000</td>
			<td>Use at a concentration of 1 : 500.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey]</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-165-155</td>
			<td>Use at a concentration of 1 : 400.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey]</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-545-150</td>
			<td>Use at a concentration of 1 : 400.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:469px;">4&#8242;,6-Diamidine-2&#8242;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20&#176;C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T75 flask [Nunclon Delta Surface]</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">24-well plate [Nunc]</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>142485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.5 mL polypropylene tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z336769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15 mL falcon tube&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50 mL falcon tube&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CryoPure tube 1.6 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pippette controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For pipetting volumes 1-25 mL.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:159px;">86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 &#181;L&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass coverslips</td>
			<td>NeuVitro</td>
			<td>GG-12-1.5-oz</td>
			<td>#1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Approximately 150mm diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:756px;">Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ThawSTAR Automated Cell Thawing System</td>
			<td>BioCision</td>
			<td>BCS-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:469px;">Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%]</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>For use with Countess II Automated Cell Counter.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>BCS-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Humidified 5% CO2 37 &#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z305359</td>
			<td>Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FACS Aria III cell sorter</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple generation of a high yield culture of induced neurons from human adult skin fibroblasts

İndüklenen nöronlar (Ins), ürün somatik hücre doğrudan nöronlar için dönüştürülmüş hasta kaynaklı nöronlar kolayca erişilebilir dokudan elde etmek için bir yoldur. Bu yönlendirme yolu olgun nöronlar birkaç birkaç hafta içinde elde edilebilir. Burada, dermal fibroblastlar biyopsi örnekleri yetişkin insan bağış elde bileşenleri almak için basit ve hızlı tek adımlı Protokolü açıklar. Biz dermal fibroblastlar, hisse senedi hücre kültürünü oluşturmak için dondurucu yordamı bakım da dahil olmak üzere işleminin her adımı açıklamak hücreleri yeniden programlama için hem de kültür koşulları dönüştürme işlemi sırasında tohum. Ayrıca, cam coverslips hazırlanması Elektrofizyolojik kayıtlar, uzun vadeli kaplama koşulları ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama açıklamaktadır. Biz de örnekler beklenen sonuçları göstermektedir. Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek kolay ve uygulanabilir insan fibroblast insan deri biyopsi hastaların çeşitli farklı tanı ve yaş ile üzerinden elde edilebilir. Bu iletişim kuralı Biyomedikal uygulamaları, hastalık modelleme, uyuşturucu tarama ve hedef doğrulama dahil olmak üzere geniş bir dizi için kullanılan bileşenler yeterli miktarda oluşturur.

Hücre morfolojisi açık bir değişiklik günden itibaren 5 (şekil 1B) görünür olmalıdır. Bazı hücre ölümü viral iletim sonra beklenen değil açıktan açığa rağmen bir şey. Her şey bir 24-şey plaka üzerinden toplam hücre verim 20,000-40,000 hücre gün 25, bunların yaklaşık yarısı sinir hücreleri haline beklenmelidir. Verim ve saflık hücre çizginin yanı sıra hastalık durumu ve virüs toplu işlemleri ile değişebilir unutmamak gerekir.
Hücreleri MAP2 ve TAU (şekil 1 c) de dahil olmak üzere çoğu standart nöronal işaretleri olgun nöronal Morfoloji sergilenmesi ek olarak günde 25 ifade edecek. Saf bir nüfus içinde marker NCAM dayalı FACS yaparak elde etmek mümkündür (bkz: başvuran8,11). Hücreler bundan sonra da yeniden kaplama PFL üçlü kaplama üzerine (referans10bakın) veya doğrudan biyomoleküler analizleri için dondurulmuş.
Hücreleri sıralanır değil Eğer MAP2 ya da TAU ile ayirt etiketleme olmalı başarıyla dönüştürülen hücrelerini tanımlamak için gerçekleştirilen ve faiz protein ile birlikte etiketli.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56904/56904fig1.jpg"> Şekil 1: zaman içinde dönüşüm evrimi. (A)zaman çizelgesi deney ve yetişkin insan dermal fibroblastlar yeniden programlamak için kullanılan bir lentivirus paketlenmiş yapı Haritası. Her siyah oku orta bir değişiklik gösterir. (B) temsilcisi faz kontrast görüntüler günden güne (her panelin sağ üst köşesinde belirtildiği gibi) 22 0 arasında dönüştürme işlemi sırasında hücre morfolojisi değişimler gösteren. Görüntüleri faz kontrast 10 X amacı istimal mikroskop alındı. (C) bir TAU ve MAP2 çift gün 35 sonrası iletim boyama ayirt görüntü. Hücreleri % 4 paraformaldehyde sabit ve permeabilized ile % 0,1 Triton DPBS 10 dk. hücrelerin içinde 30 dk içinde DPBS %5 serum çözümde için bloke edildi. Antikorlar çözüm engelleme seyreltilmiş ve gecede 4 ° C'de uygulanan İkincil antikorlar Fluorophore Birleşik çözüm engelleme seyreltilmiş ve 2 h. hücreleri DAPI ile 15 dakika DPBS ile 3 yıkar ve ardından counterstained için uygulanan vardı. Görüntüleri 20 X amacı istimal bir ters Floresans mikroskobu alındı. Ölçek çubukları 100 µm (B, C) =. Kısaltmalar: ENM: erken nöronal orta; LUH: geç nöronal orta. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56904/56904fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts at JoVE.com

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

simple-generation-high-yield-culture-induced-neurons-from-human-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Görüntüleme.  Lund University. Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.

Video: Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler