Anthony olan slaytlar ikinci insan yan yana karşılaştırma olarak kullanılan Bowen hem de Sabrina olan slaytlar bir üçüncü insan-yan yana ve ikinci mikroskop karşılaştırma olarak kullanılan Nolan kabul etmek istiyoruz.

1. çini mürekkebi slayt hazırlanması
<ol><li>Cryptococcal örnek bir slayda 10 µL pipet. Bu deneme için kullanılan tek zorlanma H99 oldu ama herhangi bir dairesel Maya zorlanma çalışacaktır. Not: doğrudan kültür ortamından örneğiyse, 1:2 PBS veya su ile sulandrarak çini mürekkebi topaklanma üzerinden önlemeye yardımcı olabilir.</li>
	<li>Hindistan mürekkep lekesi örnek üzerine 2 µL pipet ve fiziksel olarak pipet ucu örnek için bastırıyor ve çini mürekkebi düzgün dağıtılmış görünene kadar dairesel hareketlerle hareket ettirerek karıştırın.</li>
	<li>Bir coverslip örnek üzerinde coverslip sonra yavaşça ve eşit olarak örnek üzerinde coverslip karşı tarafına düşürücü slayt, yüzeye karşı sol kenarına basılı tutarak yerleştirin.</li>
	<li>Slayt hava kuru 5 min için izin.</li>
	<li>Yavaşça oje ışık tabakası bir mühür formu ve çini mürekkebi leke korumak için coverslip kenarlık uygulayın.</li>
</ol>2. görüntüleme slayt
<ol><li>Slaytlar bir fotoğraf makinesi eki ve bilinen piksel mikron dönüşüm parlak alan mikroskopla yerleştirin. Filtreler, amaçları ve kontrast hücre kapsül ve hücre organlarıdır odaklanmış, karanlık bantları net şekilde ayarlayın. Not: Çeşitli filtreler, amaçları ve kontrast ayarlarıyla çalışacaktır ancak bir 20 x amaç, Ph1 filtre ve 2 x 2 binning önerilir.</li>
	<li>Görüş alanı yoğun ama değil hücre kapsül arka plan arasında açık kontrastlı cryptococcal hücrelerle nüfuslu ve karanlık bir grup görüntülenmiştir hücre gövdeli düzgün odaklanmış olduğundan emin olun. Not: En iyi görüntü için tam sayısı örnek ve kullanılan objektif bağlı olarak değişir. Kümelenmiş veya örtüşen hücrelerdir değil emin olmak için önemli yönleridir, hücre odak uçaklar önemli ölçüde değişir değil ve önemli çini mürekkebi olduğunu açıkça (en az % 25 alanın) arka planda görünür leke.</li>
	<li>Ölçüm algoritması görüntüleri tek bir dizin içinde çalışır ve çıkış veri görüntü dosyalarının adlarını göre düzenlenecek açık başlıklar içeren tek bir dizin için görüntüleri kaydetmek.</li>
</ol>3. algoritması kurulumu
<ol><li>Python sürüm 2,7 üzerinden yüklemek</li>
	<li>Ek python kütüphaneleri "pip yüklemek yastık" komutlarını çalıştırarak ve "pip yükleyin openpyxl".</li>
	<li>MATLAB şu sayfadaki talimatları izleyerek yükleyin</li>
	<li>Yapı https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html sağlanan yönergeleri izleyerek MATLAB python Kütüphane.</li>
	<li>Bu el yazması'nın takıma giren malzemeler ("QCA.py", "Analysis2.m" ve "TestRun.m") üç gerekli dosyaları indirmek. Not: Bu dosyaları herhangi bir yere elde edilebilir, ama her üç aynı dizinde olması gerekir.</li>
</ol>4. algoritma kullanımı
<ol><li>Uygulamayı QCA.py üzerinde çift tıklayarak çalıştırın. Not: Uygulama başlatmak için birkaç dakika sürebilir. "QCA.py" dosyası gerçek algoritma çalıştırmak için "anladım" dosyaları çağıran program yapısı içerir.</li>
	<li>Programda anlatılan adımları izleyin.<ol>
<li>Görüntü dosyalarının uzantısı türü başına bir nokta koyarak ve noktalı virgüllerle ayrılmış Giriş (örn. ". TIF;. JPEG") sonra Enter düğmesini tıklatın.</li>
		<li>İçinde görüntü dosyaları Dizin Seç düğmesini tıklatarak ve görüntüleri içeren klasörü seçerek bulunduğu dizini seçin.</li>
		<li>Görüntü dosyaları listesini dizinde Resim listesi oluştur düğmesini tıklatarak oluşturun. Görüntüleri sağa metin kutusunda listelenir. Gözden geçirin ve listeden doğru ve eksiksiz olduğundan emin olun.</li>
		<li>Rasgele görüntü Seç düğmesini tıklatarak bir önizleme olarak kullanmak için listeden rastgele bir görüntü seçin. Not: bir "yanlış görüntü modu hata nedeniyle" açamıyor görüntüyse, algoritma hala görüntü görüntülenmiyor rağmen düzgün. 4.2.7 adımdan sonra sınama yansıması görüntülenmeye devam eder.</li>
		<li>Giriş mikroskop objektif ve ayarları binning. Varsayılan ayarları kullanılan mikroskop eşleşmiyorsa, "Özel piksel dönüşüm" seçin ve görüntü dosyaları için piksel-için-um dönüşüm giriş. Bir kez seçme, Dönüşüm hesapla düğmesini tıklatın ve dönüştürme metin kutusunun sağ göre doğru olduğundan emin olun. Not: şekil 1 ' de gösterilen temsili resim 40 x büyütme ve 2 x 2 seçili binning ile hesaplanır.</li>
		<li>Giriş daire algılama için algoritma parametreleri.<ol>
<li>Minimum ve maksimum yarıçapı tespit Min ve Max kapsül RADIUS giriş dış kapsül algılama için giriş. Küçük bir aralığı daha doğru sonuçlar sağlayacaktır.</li>
			<li>Minimum ve maksimum yarıçapı tespit hücre vücut algılama Min ve Max hücre vücut RADIUS giriş için giriş. Not: Bu girdilerin dört göre kaynak görüntüler ilgili değerlerini piksel cinsinden temsil eden sayılar olmalıdır.</li>
			<li>Duyarlılık eşik algoritma ayarlamak için kapsül ve hücre cisim hassasiyeti kaydırıcılarını hareket ettirin. Düşük duyarlılık sıkı olacak ve yanlış pozitif daire algılama azaltmaz, ama daha az gerçek daireler Ayrıca algılayabilir. Tersine, yüksek bir hassasiyet tespit oranı artacak ama yanlış pozitif çevrelerde de neden olabilir. Not: Temsilcisi sonuçları bir kapsül yarıçapında en az 7, 45 kapsül maksimum yarıçapı, en az vücut RADIUS 4, en fazla vücut RADIUS 30, 87 kapsül duyarlılık ve cisim hassasiyeti 87 ile elde edilmiştir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Parametreleri rasgele seçilen görüntü üzerinde Test çalışması düğmesini tıklatarak sınayın. Programın orijinal görüntü yerine, üst ortasında görüntülenir. Sonuçları doğru bakarsanız, bu da tüm seçilen görüntüler seçilen parametrelere uygun emin olmak denemek için ek rasgele görüntü seçmek için önerilir.<ol>
<li>Ceset sayısını en üst düzeye çıkarmak ve kapsül algılanır ve daireler doğru sığdırmak için görünür olup olmadığını kontrol edin. Tespit kapsül içinde ceset sayısı sağa metin kutusunda görüntülenir. Aksi takdirde, sonuçları doğru olana algoritma parametreleri değiştirmek. Not: Yalnızca görselleştirme ile yardımcı olmak için kalın renkli daireler vardır. Ölçüm için üretilen gerçek daireler HCT algoritması tarafından hesaplanan bir matematiksel eğrisi var.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Algılama algoritması Başlar Analysis düğmesini tıklatarak görüntü dosyaları tüm dizin üzerinde çalıştırın. Her görüntü analiz edilecek ve tüm görüntüleri analiz programı "bitmiş" sağındaki metin kutusuna görüntülenir.</li>
		<li>Maç ve Temizleme düğmesini tıklatın. Bu tespit edilen hücre organları içinde bulundukları tespit edilen kapsül için maç ve gerçek kapsül RADIUS kapsül vücudundan çıkararak hesaplar. Not: algoritma Floresans algılamak için kullanılan veya bu adımı başka bir durum sadece bir daire olduğu tespit gereksizdir. Bunun yerine sırasıyla sadece mavi ya da sadece yeşil daireler için veri toplamak için Sadece çek organları veya Yalnızca çek kapsül düğmesini tıklatın. Kapsül veri alınır eğer sadece hücre vücut RADIUS değil düşülen gibi RADIUS hücre toplam RADIUS ile sevk edecektir olduğunu unutmamak gerekir.</li>
		<li>Tamamlanan Veri görüntü dizinindeki "CleanedOuput.csv" dosyasını bulun. Eğer sadece bir parça veri seçildi, dosyayı "CleanedBodies.csv" veya "CleanedCapsules.csv" etiketi olur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu tekniğin önemli adımlar çini mürekkebi slayt hazırlama ve mikroskop görüntüleri elde etme. Algoritma başarıyla çeşitli slayt ve görüntü teknikleri ile test ederken önerilen bir protokoldür bu el yazması açıklanmıştır. Polisakkarit kapsülü bu parçacıklar polisakkarit Fibriller ağ nüfuz için çok büyük olduğundan mürekkep parçacıklar dışlama kapsül etki alanından göre tespit edilmiştir. Çini Mürekkebi dışlama koyu arka plan üzerine bir daire sonuçlanır. Algoritma dairele...

Cryptococcus neoformans ubiquitously insan hastalığında öncelikle baskılanmış nüfus ile ilişkili tüm dünyada bulunan patojen bir mayaymış. C. neoformans özellikle Sahra Güneyi Afrika bulaşıcı hastalık1nedeniyle toplam yıllık ölümlerin önemli bir çünkü hesapları. Önemli klinik cryptococcal enfeksiyon olarak enfekte makrofajlar (Truva atı şekilde) Ulaştırma merkezi sinir sistemi işgali aşağıdaki meningoensefalit tezahürüdür veya kan - beyin bariyerini doğrudan geçiş. C. neoformans insan vücudunun sıcaklığı, üreaz aktivitesi, melanization ve bir polisakkarit kapsül2oluşumu çoğaltmak için yeteneği dahil olmak üzere birkaç virülans faktörleri ifade eder. Polisakkarit kapsülü yinelenen glucuronoxylomannan ve glucoronoxylomannangalactan Polimerler ve işlevleri olarak çevresel stres ve ana makine bağışıklık yanıtı2gibi etkenlere karşı koruyucu bir bariyer oluşur.
Her ne kadar cryptococcal polisakkarit kapsül boyutunu sürekli virülans ile ilişkili olduğu değil, ortada bir kanıt Patogenez2,3,4,5bir faktör olduğunu, 6,7. Kapsül boyutu menenjit patoloji6ile ilişkilidir, makrofaj Cryptococcus enfeksiyon5kontrol yeteneğini etkileyebilir ve8Eğer yok virülans kaybına neden olabilir. Bu nedenle, kapsül boyutu ölçüm cryptococcal araştırmada yaygındır, ancak kapsül ölçüm yöntemi için standart yok fieldwide.
Şu anda, C. neoformans polisakkarit kapsül ölçüm mikroskobu görüntüleri manuel ölçüm üzerinde temel alır ve görüntü ve ölçüm satın alma tam yöntemleri laboratuar9,10değişir, 11. Bir anında bu yöntemin bazı çalışmalar Bakımı doğruluk ve güvenilirlik zorlaştırır binlerce bireysel ölçümlerin edinimi gerektiren konusudur. Ayrıca, hatta sonuçları yayımlandığında, orada kez yetersiz ölçüm yönteminin açıklaması olduğunu. Birçok yayın nasıl onların ölçümler elde edilmiştir, açıklamak değil ne odak düzlemi kullanıldı, nasıl onlar belirlediğini eşik kapsül kimlik için bir ölçüm kullanılan veya birkaç veya diğer ortalama RADIUS veya çapı, kullanılan Ayrıntılar. Onların yöntemi hangi programı olarak kullanıldı, bazı yayınlar tek devlet Örneğin, "Adobe Photoshop CS3 hücreleri ölçmek için kullanılan"11. Standardizasyon ve ayrıntılı raporlama bu eksikliği tekrarlanabilirlik imkansız olmasa zorlaştırabilir. İnsan görme, bilgisayar parlaklık, mikroskop ayarları, farklılıkları slayt aydınlatma ve pixel yoğunluk değerleri oranları üzerinde dayanan hesaplamalar sabit kalır, ancak diğer faktörler sadece bireyler arasında ama örnek arasında değişebilir ve örnek arasında uygulanabilir. Bu teknik içinde yoktu önce bir alan için kapsül boyutları ölçmek için bir standart, doğru hızlı ve basit teknik sağlama bağlamında oluşturuldu.
Daha önce belirtildiği gibi CHT algoritmasıdır köklü ve daireler otomatik olarak algılamak üzere komut dosyaları önce yazdım. Bu yöntem diğer komut dosyaları nerede kısa düşeceği iki alanda geliştirir. Cryptococcal hücreleri ile iki ayrı daire birbirimizi ile ilgili olarak algılanması gerekir çünkü ilk, sadece daireler algılama, yetmez. Bu yöntem özellikle hücre organları kapsül içinde algılar, ikisi arasında ayrımcılık ve yalnızca ilgili vücut-kapsül çiftleri üzerinde hesaplamalar gerçekleştirir. İkinci olarak, hatta ne zaman takip aynı iletişim kuralını, farklı araştırmacılar farklı sona erecek görüntüleri elde. Her algoritma parametresini araştırmacı denetime olanak sağlayarak, bu araç edinme yöntemleri çok çeşitli eşleşecek şekilde ayarlanabilir. Standart kapsamı, amaç, filtre ve benzeri için gerek yoktur.
Bu teknik, araştırmacı daireler bir görüntü içinde onların arka plan ile bu kontrast tespit gereken herhangi bir durum için kolayca uygulanabilir. Her iki daire açık ve koyu arka plan tespit edilebilir daha sayılır ve bu teknik kullanılarak ölçülür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Bu teknik amacı polisakkarit kapsül ölçümleri çok sayıda için tutarlı, doğru ve yönetilebilir bir süreç sağlamaktır.
İlk olarak, bir eşik görüntü benzersiz olarak her görüntü için hesaplanan yoğunluk değerleri temel alınarak oluşturulur. Sonra daire nesne ve köklü daire Hough dönüştürme (CHT) algoritması ile arka plan arasındaki kontrast göre tespit edilir. Son olarak, tespit edilen hücre kapsül ve organları Merkezi koordinatları ve RADIUS boyutu göre eşleştirilir ve veri yönetilebilir elektronik tabloda kullanıcıya verilir.
Bu teknik avantajları basit ama önemli. İlk, çünkü bu hesaplamalar bir insan yerine bir algoritma tarafından gerçekleştirilir doğruluk ve güvenilirlik arttı. Doğruluğu veya güvenilirliği kaç örnekleri analiz edilir ne olursa olsun hiçbir düşüş vardır. İkinci olarak, bu yaklaşım potansiyel Standart prosedür Cryptococcus alanı yerine nerede kapsül ölçüm lab tarafından değişir mevcut durum için kurar. Üçüncü olarak, el ile kapsül ölçümler yavaş ve monoton göz önüne alındığında olduğuna göre otomasyon sırayla yüksek üretilen iş veri analizi ve giderek güçlü istatistik kolaylaştıran çok sayıda Maya hücreleri üzerinde hızlı ölçümler sağlar.
Bu tekniğin önemli sınırlamaları nasıl gelir algoritması işlevleri. İlk olarak, algoritma yalnızca daireler oluşturur. Cryptococcus hücreleri ve onların kapsül üzerinde dairesel bir Morfoloji alırken, Sigara-daire nesne algılama için bu tekniği uygulamak için zor olurdu. İkinci olarak, daire nasıl algılanır nedeniyle CHT algoritması büyük sözde çevrelerin birkaç kümelenmiş daire dış kenarlarına dayalı algılayabilir. Ancak, yanlış tanıtılmış hücre cesetler sahte daire içinde yakalanan kolayca algılanabilir ve elde edilen veri kümelerinden kaldırıldı.
Bu tekniği, çini mürekkebi parlak alan mikroskobu üzerinde dayalı Cryptococcus türlerin döngüsel polisakkarit kapsül ölçmek için içindir; için uygulanan olabilir rağmen diğer kontrast dairesel nesne ölçümleri dayalı.

Görüntüleri ilk mikroskobu çini mürekkebi slayt bir kamera (şekil 1A) ile birleştiğinde bir parlak alan mikroskop kullanarak elde edilir. Hücreler ayrılmış ve görünümü, alan de hücreleri ve arka plan arasındaki kontrast oluşturmak için yeterli leke kullanın olarak bastırmak değil için yeterince düşük yoğunluklu olması önemlidir. İletişim kuralında belirtildiği gibi en iyi görüntü için tam sayısı örnek,...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

Bu teknik polisakkarit kapsülü ve vücut yarıçaplarını ölçmek için tasarlanmış bir otomatik batch Image processor açıklar. Başlangıçta Cryptococcus neoformans kapsül ölçümleri için tasarlanmış iken otomatik görüntü işlemci dairesel nesneler diğer dayalı kontrast tespiti için de uygulanabilir.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K Görüntüleme.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Bu teknik polisakkarit kapsülü ve vücut yarıçaplarını ölçmek için tasarlanmış bir otomatik batch Image processor açıklar. Başlangıçta Cryptococcus neoformans kapsül ölçümleri için tasarlanmış iken otomatik görüntü işlemci dairesel nesneler diğer dayalı kontrast tespiti için de uygulanabilir.

Video: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Farelerde γHV68 Enfeksiyon ölçümü

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Kızılötesi termometre pasif sistemik anafilaksi ve gıda Anti değerlendirme sırasında kullanarak fare vücut sıcaklık ölçümü

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

Vivo Reaktif oksijen türleri içinde bir fare görüntüleme modeli yara

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...