Biz moleküler Biosciences (MOBI) doktora programı ve Biyoloji bölümü Middle Tennessee Devlet Üniversitesi (MTSU) adlı bu çalışma için finansman sağlamak için teşekkür ederiz. Proje aynı zamanda kısmen D.E.N. için MTSU Vakfı tarafından verilen bir özel projeler hibe tarafından finanse edildi.

Not: C. neoformans seviye 2 (BSL-2) patojen ve bu modülle çalışmanın araştırmacılar gerekli önlemleri almalıdır. Ayrıntılı yordamlar nasıl için güvenli bir şekilde BSL-2 patojenler ile İş Merkezi hastalık kontrolü için (CDC) bulunabilir üzerinde web sitesi, ama tüm kişiler C. neoformans temas geliyor düzgün işlemede eğitimli unutmayın patojenik ajanlar ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE), genellikle lateks veya nitril eldiven giymek gerekir. Ayrıca, santrifüjler rotorları Kloroformu örnekleri ve hemen bir % 10 çamaşır suyu çözüm28kullanarak temizleyelim herhangi bir sızıntıları önlemek için kapalı olmalıdır.
1. kapsül indüksiyon
Not: Tüm adımları oda sıcaklığında aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilmesi gerekiyor.
<ol><li>C. neoformans Maya pepton dekstroz (YPD) suyu (pH 6,5 +/-0.2) içinde kültür ve 37 ° C'de log fazı (yaklaşık 18-36 h) onlar kadar sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>870 x g 21 ° C'de 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri saymak ve 2 x 105 hücreleri/2 mL Dulbecco'nın en az temel medya (DMEM), resuspend için bir hemasitometre (veya bir otomatik hücre sayaç) kullanın.</li>
	<li>Kapsül ikna etmek için 37 ° C ve % 5 CO2 18 h için kuluçkaya. Not: Medya besin yokluğu ve CO2 varlığı ile birlikte C. neoformans kapsül büyüme uyarır.</li>
	<li>Sonrası kuluçka, hasat hücreleri (yukarıdaki gibi) centrifuging ve tüm ama 5-10 µL süpernatant kaldırma. Aynı zamanda, karşılık gelen bir un indüklenen hücre örneği ölçülecek her zorlanma için hasat. Bunlar negatif denetimleri kullanın. Not: Hücre topakları çok küçük olacaktır ve görmek zor olabilir. Süpernatant alıyorum dikkatli olun.</li>
	<li>Hindistan mürekkep (Kısım 2.1) veya floresan boyalar (Bölüm 2.2) ile leke.</li>
</ol>2. boyama
<ol><li>
Sadece çini mürekkebi ile boyama
	<ol>
<li>Çini Mürekkebi ile Maya leke için Pelet kalan süpernatant içinde resuspend ve 4μL ekleyin (yaklaşık yarısı) hücre süspansiyon ve çini mürekkebi bir cam mikroskop slayt üzerine 4μL. Yavaşça karıştırın ve köpük önlemek.</li>
		<li>13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve kenarları örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) ile mühür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sadece floresan boyalar ile boyama
	<ol>
<li>Maya ile floresan bir boya lekesi için 50 µL PBS % 1 sığır serum albumin (BSA) ile hücre Pelet resuspend.</li>
		<li>Kültür Calcofluor beyaz (CFW) eşit bir birimdeki kuluçkaya (1 µg/mL) ve kapsül mAb 18B7 AlexaFluor488 için Birleşik ( Tablo malzemelerigörmek) (AF488) (10 µg/mL) 37 ° C'de 30 dk</li>
		<li>870 x g 21 ° C sonrası kuluçka, 5 min için hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.</li>
		<li>Hücre Pelet 10 µL PBS % 1 sığır serum albumin (BSA) ile resuspend.</li>
		<li>Hücre süspansiyon üzerine cam mikroskop kaymak 8 µL pipet.</li>
		<li>13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve kenarları örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) ile mühür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çini Mürekkebi ve floresan boyalar ile boyama
	<ol>
<li>Daha doğrudan bu floresan boyalar boyama çini mürekkebi etkinliğini karşılaştırmak için her iki tür leke ile aynı hücre nüfus co leke. Bunu yapmak için önce hücreleri floresan kapsül ve hücre duvar boyası, adımları 2.2.1 - 2.2.3 göre kuluçkaya.</li>
		<li>Ardından, eşit miktarlarda (4 µL) fluorescently lekeli hücre süspansiyon ve çini mürekkebi bir cam slayt üzerine pipet. Hafifçe karıştırın.</li>
		<li>13-mm cam coverslip (#1.5 kalınlık) uygulamak ve örnek kurumasını önlemek için bir non-toksik mastik (açık oje) kenarları mühür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. görüntü edinme/mikroskobu
<ol><li>
Hücreleri Imaging çini mürekkebi ile lekeli.
	<ol>
<li>Standart bir ışık mikroskobu (100 X büyütme) kullanarak görüntüleri elde etmek.</li>
		<li>Koşul başına 50 hücreleri en az görüntü. Not: Alan başına hücre sayısı değişiklik gösterir, bu da kabul edilebilir. Bu önemli, ancak, bu örtüşen hücreleri en azından bu (el ile ve otomatik yazılım ile) ölçmek zor olarak tutulur. Bu deneyler için görüntüleri 16 bit bir derinlikte hücreleri küçük hareketlerle kaynaklanan bulanıklık en aza indirerek görüntü kontrastı en üst düzeye çıkarmak için optimize pozlama süreleri ile elde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreleri Imaging ile floresan boyalar lekeli
	<ol>
<li>Hücreleri tarafından floresan mikroskopi olabilir görüntü için düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop açın ve kullanılan fluorophores için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarında seçin (CFW ve AF488 heyecan 405nm ve 488 nm ışık, sırasıyla kullanarak). Floresan mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek.</li>
		<li>Koşul başına 50 hücreleri en az görüntü. Not: Alan başına hücre sayısı değişiklik gösterir, bu da kabul edilebilir. Bu önemli, ancak, bu örtüşen hücreleri en azından bu (el ile ve otomatik yazılım ile) ölçmek zor olarak tutulur.</li>
		<li>Bir z-yığın görüntü serisi hücrelerin belirli bir alan içindeki her hücre için maksimum kapsül çapı elde emin olmak için kazanmak.<ol>
<li>Mikroskop kontrol yazılımı "z-yığın" çubuğunda "z-yığın" Denetim Masası'nı açın ve sonra panelin sol üst köşesine "İlk/son" seçeneğini tıklatın.</li>
			<li>Mikroskop odak fine-odak denetimde bir tek Maya hücre ve kapsüller için tüm geçerli görüş alanı içinde en geniş amacı aşağıda ve "İlk ayarla"'ı tıklatın bir seviyede kullanın.</li>
			<li>Yukarıda aynı hücreyi ve kapsül hücre vücudun en geniş noktası odak fine-odak denetime tüm geçerli görüş alanı içindeki hücreleri ve "Son Set"'ı tıklatın.</li>
			<li>Sonra "Deney başlamak" z-yığın geçerli pozisyon için elde etmek için "Satın alma" sekmesinde tıklatın. Z-yığın görüntüleri en az 50 hücre elde kadar birden fazla pozisyonlarda işlemi yineleyin. Not: Bu deneyler için 1.0 için confocal iğne deliği kuruldu AU ve çakışan bir z-serisi 0.7 µM kapsayan 10-20 dilim seçili konumlarda elde. AU = havadar adet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ardından, her z fiş serisi uygun görüntü analiz yazılımı kullanarak maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) dönüştürün. Not: MIPs her uçak yığılmış resim29en büyük yoğunlukta proje. MIPS oluşturma bir en fazla hücre ve kapsül çapı yakalanan 3-b yığın içinde karşılık gelen resimleri bir 2-B temsil üretmek izin verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreleri Imaging çini mürekkebi ve floresan boyalar ile lekeli
	<ol>
<li>Widefield (40 X büyütme) veya confocal mikroskop kullanarak görüntüleri (63 X veya 100 X büyütme). Çini Mürekkebi ve floresan boyalar ile lekeli hücreler için bir bilgisayar kontrollü sahne ve yağı daldırma amacı ile donatılmış bir widefield mikroskop kullanarak çekim. Not: Mikroskop kullanımda bir görüntüleme yazılımı CFW kullanarak kontrol edilmelidir. 340-380 nm uyarma filtreden heyecanlı ve ışık yayılan Floresans 400 nm dikroik ayna dan yansıyan bir 435-485 nm bariyer filtresi ile tespit edilmelidir. AF488 floresan 465-495 nm uyarma filtreden heyecanlı ve verilmiş ışık 505-nm dikroik ayna dan yansıyan bir 515-555 nm bariyer filtresi ile tespit edilebilir.</li>
		<li>Resim Boyama her yöntem için koşul başına 50 hücreleri en az.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. el ile ölçüm-in kapsül
<ol><li>Çini Mürekkebi veya floresan lekeleri ile lekeli hücre için bir hücre ölçüm yazılımı el ile ölçü kapsül ve hücre çapı için kullanın (bkz. Tablo malzeme). Bunu yapmak için "Dosya" gidin > "Görüntü aç" > "Ölçü" ve tüm cep telefonu (Toplam çap) en geniş anlamı ile düz bir çizgi çizmek için kullanabilirsiniz imleç.</li>
	<li>Ardından, "Ölçü" yeniden tıklatın ve hücre vücut (hücre gövde çapı) düz bir çizgi çizin. Not: Ölçüler otomatik kaydedilen-hücreleri.</li>
	<li>Tüm hücreleri (en az 50/grup) için bu işlemi yineleyin.</li>
	<li>Bir kez onlar ölçülür görüntüleri kaydetmek için "Dosya"'ı tıklatın > "Farklı Kaydet" ve görüntüleri uygun şekilde adlandırın.</li>
	<li>Yeni ölçülen dosyaları seçin ve verileri bir elektronik tablo yazılımı için verin.</li>
	<li>Ortalama kapsül çap eşitliği kullanarak hesaplar: ([Toplam çapı] - [hücre gövde çapı]).</li>
</ol>5. otomatik ölçüm kapsül
Not: başarılı otomatik ölçüm için 16-bit görüntüleri yüksek karşıtlık kullanın ve bir uygun görüntü analiz yazılımı ile birlikte düzgün odaklı ( Tablo malzemelerigörmek). C. neoformans kapsül ölçüm için Imaging zaman, hücre duvarı ve kapsül arasında sınır karanlık yüzüğe odaklanmak önemlidir. Bu doğru hücre ve kapsül betimlemek için yazılım sağlar.
<ol><li>Ters çevir ve tüm çini mürekkebi hücre görüntüleri uygun bir görüntü düzenleme yazılımı kullanarak lekeli bir kopyasını oluşturun (bkz. Tablo malzeme). Bunu yapmak için "Dosya" tıklayın > Hindistan mürekkep lekeli görüntüleri açın ve sonra "kontrol" için "açık" + "I" görüntü ters çevirmek için. "Dosya" > "Ters görüntü kaydetmek için farklı kaydet".</li>
	<li>Hem özgün ve ters almak için "Dosya" görüntü içine belgili tanımlık bilgisayar yazılımı tıklatın > "Alma sırası" > "Yük görüntü" > "Tanımla sıra (el ile)" > "Boyutlar (kanal)" > "Al" > "Uygula". Not: C. neoformans hücre organları ve kapsül belirlenebilir ve özel algoritmalar 'yemek tarifleri' yazılımı dahil - olarak anılacaktır - kullanarak maskeli.</li>
	<li>Algılamak ve hücre vücut maske ters görüntü 'Koloni Analyzer (floresan)' tarifi kullanın, sonra "Uygula"'ı tıklatın. Ters görüntü C. neoformans Hücre kenarlığını tanımlama karanlık halka çevreleyen kapsül parlak olur.</li>
	<li>'Koloni Analyzer (floresan)' tarifi ters görüntü onların kapsül C. neoformans hücre vücutlarından segmentlere ayırmak, o zaman tıkırtı "Uygula" için kullanın. Bu sayım maskesi oluşturur. Bu sayım maskesi "Hücre beden" yeniden adlandırın "sayım maskesi" etiketli sekmesini sağ tıklatarak. Not: Tarifi birden fazla görüntü adımları işleme oluşur: arka plan kaldırma, nesne algılama, nesne ayırma ve alt filtreleme.</li>
	<li>Ardından, 'Hücre çoğalması' tarifi üzerinde orijinal görüntü tespit ve kapsül maske kullanmak ve "Uygula"'ı tıklatın. Bu sayım maskesi oluşturur. Bu sayım maskesi "Kapsül" yeniden adlandırın "sayım maskesi" etiketli sekmesini sağ tıklatarak.</li>
	<li>Tarifi, 'Kapsülü Bölüm' kullanarak oluşturmak birbirinden bitişik kapsül bölümlemek için orijinal görüntü üzerine yeni bir maske. Bunu yapmak için tarifi açılan menüden "Kapsül bölümü"'yi tıklatın. Kapsül bölüm kutusunda kapsül bölge için şimdi yeniden adlandırılan sayım maskesi "Kapsül" (5.5) seçin. Şimdi yeniden adlandırılan sayım maskesi "Hücre beden" Kripto hücreleri (5,4) seçin. Giriş kanalı ve "Partitioned Kapsül oluşturma maskesi. için"Orijinal"seçin "Uygula'yı tıklatın Not: Tarifi hücre ve hücre ve kapsül ve alan ölçüleri Merkezi algılama maskeler geçerken en uzun ve en kısa eksen ortalama olarak tanımlanan kapsül çapı oluşturur. Bu yazılım elektronik tablo sekmesinde altında bulunan çıkış bulmak. Tüm resimler (en az 50 hücreler/grubu) için bu işlemi yineleyin. Tarifi'nın parametreleri algılama bireysel görüntülerin optimize etmek için ayarlanmış veya birden fazla görüntü toplu tespiti için en iyi duruma getirilmiş olabilir. Ek ölçümler hücre ve kapsül'ın Morfoloji kapsamlı karakterizasyonu için reçete tarafından hesaplanır.</li>
	<li>Verileri daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo yazılım için verin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+life+of+Cryptococcus+neoformans.">The intracellular life of Cryptococcus neoformans.</a> Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).</li><li>Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+infections+in+HIV/AIDS.">Fungal infections in HIV/AIDS.</a> Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisis+in+Infectious+Diseases:+2+Decades+Later.">Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later.</a> Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).</li><li>McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).</li><li>Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+versus+alternative+macrophage+activation:+the+Ying+and+the+Yang+in+host+defense+against+pulmonary+fungal+infections.">Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+melanin+formation+as+indicators+of+virulence+in+Cryptococcus+neoformans.">Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans.</a> Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).</li><li>Vecchiarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+immunological+function+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).</li><li>Murphy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cryptococcal+antigens+on+cell-mediated+immunity.">Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity.</a> Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).</li><li>Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+structure+of+glucuronoxylomannan+in+isolates+from+patients+with+recurrent+cryptococcal+meningitis.">Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis.</a> Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).</li><li>Collins, H. L., Bancroft, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cryptococcus+neoformans+impairs+antigen-specific+T-cell+responses.">Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses.</a> Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).</li><li>Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+sizes+of+Cryptococcus+neoformans+capsular+polysaccharide+on+phagocytosis.">Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis.</a> Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+ex+vivo+capsule+size+is+associated+with+intracranial+pressure+and+host+immune+response+in+HIV-associated+cryptococcal+meningitis.">Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+behavior+of+capsule+enlargement+by+Cryptococcus+neoformans.">Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).</li><li>O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+a+sword+and+a+shield.">The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield.</a> Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).</li><li>McClelland, E. E., Smith, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+specific+differences+in+the+immune+response+to+infection.">Gender specific differences in the immune response to infection.</a> Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).</li><li>McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+virulence+factor+expression+to+evolved+virulence+in+mouse-passaged+Cryptococcus+neoformans+lines.">Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.</a> Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+capsule+growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+mammalian+serum+and+CO(2).">Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2).</a> Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).</li><li>Vartivarian, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cryptococcal+capsular+polysaccharide+by+iron.">Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron.</a> J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).</li><li>McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule+structural+heterogeneity+and+antigenic+variation+in+Cryptococcus+neoformans.">Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).</li><li>Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+capsule+structure+evolution+in+vitro+and+during+murine+infection.">Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.</a> Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).</li><li>Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).</li><li>Pontes, B., Frases, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+lessons+from+the+use+of+optical+tweezers+and+other+biophysical+tools.">The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools.</a> Front Microbiol. 6, 640 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+gene+expression+in+individual+cells+and+cell+compartments.">Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments.</a> J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).</li><li>Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+processing+and+analysis+of+dynamic+fluorescence+image+data.">Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data.</a> Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).</li><li>Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+live+cell+images:+Methods,+tools+and+opportunities.">Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities.</a> Methods. , 65-79 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).</li><li>Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

Yazar, Hoyin Lai, otomatik görüntü analiz yazılımı, Aivia yayımladığı DRVision, ürün yöneticisidir.

On yıl için kapsül mycologists ve klinisyenler C. neoformans ve Kriptokokkoz patojen büyük virülans faktörü olarak rolü nedeniyle ilgi için araştırma önemli bir odak noktası olmuştur. Mikroskopi için kullanılması kapsül boyutu suşları arasında farklılıklar ölçmek ve farklı gelişim altında koşullar patojen ve yanıtları (örneğin, farklı çevre koşulları, çeşitli uyaranlara hakkında önemli bilgiler sağlar potansiyel ilaç tedavileri, vb) burada, biz C....

Çeyrek milyon insan her yıl etkileyen ve her yıl daha fazla 180.000 ölümle sonuçlanan, Cryptococcus neoformans patojen, hücre içi mantar ve Kriptokokkoz1,2, hastalığının olduğunu 3. zor hit antiretroviral tedavi, hazır erişim onları akut hastalık4,5,6duyarlı hale sahip olmayan HIV pozitif hastaların yoksul ülkelerde vardır. CDC verileri alt ve Sahra Afrika, C. neoformans tüberküloz daha fazla insan her yıl ve daha fazla her ay herhangi bir Ebola salgını kayıt1daha öldürdüğünü gösteriyor. Maruz kalma en yaygın yol çevre7olağan hale kabuktan sporlar teneffüs edilmesi oluşur. Akciğerlere girdikten sonra C. neoformans başarı enfekte bireylerin içinde katkıda birkaç virülans faktörleri vardır. Acapsular suşları öldürücü8değildir olarak polisakkarit kapsülü mikrop'ın birincil virülans faktörü olarak kabul edilir.
Cryptococcal kapsül üç ilke bileşenlerini yapılır: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) ve mannoproteins (MPs)9. MPs kapsül görece küçük bir hücre duvarı ilişkili bileşeni olmakla birlikte, bunlar immunojenik ve çoğunlukla pro-inflamatuar yanıt9,10yükseltebilirsiniz. Buna ek olarak, kapsül toplu GXM ve GalXM yapmak (> ağırlıkça % 90'ı) ve immünsupresif etkileri11var. İmmunomodulatory etkileri yanı sıra, kapsül vivo içinde hızlı genişleme ana bilgisayar Fagositik hücreleri (Yani, nötrofiller ve makrofajlar)12tarafından yenmesi için mekanik bir engel oluşturur. C. neoformans kapsül ve onun sentez karmaşık olmakla birlikte, genel olarak, artan kapsül çapı artan virülans6,13,14ile ilişkilidir. Bu göz önüne alındığında, hızlı ve doğru kapsül ölçümleri ölçmek muktedir C. neoformans araştırmacılar için önemlidir.
C. neoformans hücre ve onun polisakkarit kapsülü dinamik yapıları ve zaman15üzerinde değişiklikler göstermektedir. Kapsül yoğunluğu, boyutu ve derleme değişiklikler ana bilgisayar ortamı16,17,18değiştirebilirsiniz. Düşük demir veya besin düzeyleri, serum, insan fizyolojik pH ve artan CO2 kapsül büyüme16,18,19,20başlatmak için bilinir. Ayrıca, araştırmacılar21,22ana bilgisayar üzerinde bir avantaj- C. neoformans için kredi immunoreactivity önemli farklılıkların kaynaklanan enfeksiyon sırasında yapısal değişiklikler göstermiştir. C. neoformans kapsül mimarisini çeşitli şekillerde analiz etti çünkü bu bilinir. Elektron mikroskobu, örneğin, kapsül bir dış, daha geçirgen katman23altında iç bir elektron yoğun tabaka ile heterojen bir matris olduğunu ortaya koymuştur. Işık saçılma ve optik cımbız kullanımını daha da onun makromoleküllerin özellikleri24aydınlatmak araştırmacılar sağladı. Her iki statik ve dinamik ışık saçılma ölçüm sonuçlarını analiz, polisakkarit kapsülü karmaşık bir dallanma yapısı23olduğunu biliyoruz. Optik cımbız yapısına Sertlik test gibi onun antikor reaktivitesi24değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, şimdiye kadar en sık istihdam C. neoformans kapsül boyutu ölçüm analizidir.
Kapsül boyutu ölçmek için araştırmacılar ne-meli var olmak basit bir ölçüm kullanın: kapsül doğrusal çapını. Digital mikroskoplar birden fazla C. neoformans hücre (genellikle yüzlerce) çini mürekkebi veya floresan boyalar ile lekeli görüntülerini yakalamak için kullanılır. Her hücre vücut ve çevresindeki kapsül boyutu ölçülür. Veriler derlenmektedir ve kapsül ortalama çapı tüm cep telefonu çapı (hücre vücut + kapsül) üzerinden cep gövde çapı çıkarılarak hesaplanır. Şu ana kadar bu ölçümler el ile yapılmıştır. Genel olarak doğru olsa da, bu yöntem araştırmacılar için dezavantajları vardır. Büyük veri kümeleri gün almak ya da el ile çözümlemek için hafta. Ve bu ölçümler el ile yapılır çünkü, öznellik ve insan hatası sonucu etkileyebilir.
Otomatik hesaplama görüntü analizi biyolojik görüntüleri 25,26,27daha hızlı ve daha güvenilir analizini sağlayan moleküler hücre biyolojisi, birçok alanda araştırmacılar için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Kesin görüntü analizi teknikleri ne çoğu zaman karmaşık ve büyük veri kümeleri üzerinden nicel bilgi benim gereklidir. Ancak, bazı ölçümler, C. neoformans kapsül, özellikle ölçüm otomatikleştirmek zor olmuştur. Doğru bir şekilde hücre duvarı ve genellikle tarafından faz kontrast mikroskobu görüntüsü zaman karanlık bir halka olarak görünen, kapsül, arasındaki arabirimi tanımlayan basit bir eşik kullanarak çözmek zahmetli olabilir. Ayrıca, C. neoformans hücre kültüründe birlikte yığın eğilimindedir ve hücrelerinin doğru segmentasyon doğru ölçümler için gereklidir.
Bu projenin amacı (i) C. neoformans, (ii) karşılaştırın ve kontrast çini mürekkebi kapsül indüksiyon için standart iletişim kuralları göstermek için yapıldı ve floresan boyama çapı ölçümleri, kapsül ilgilidir (III) geliştirmek basit, Hindistan mürekkep lekeli bir görüntü analiz yazılımı ve (iv) kullanarak hücreleri görüntülerini kullanarak kapsül çapı ölçmek için hesaplama yöntemleri faydaları ve kısıtlamaları el ile kapsül Çap ölçüm ve yazılım Otomasyon kullanarak değerlendirmek. Biz bu iki boyama yöntemleri, hücre duvarı ve kapsül etiketleme floresan bulmak, daha uzun sürmesine iken, sağlanan deneyler arasında en tutarlı sonuçlar. Ancak, her iki yöntem başarılı bir şekilde ayırt etmek için bize etkin laboratuar ve klinik C. neoformans arasında farklı sergilenmesi suşları boyutları kapsül. Ayrıca, Hindistan mürekkep lekeli görüntüler üzerinden kapsül çap ölçümü otomatikleştirmek ve bu kapsül manuel ölçüm bir alternatif bulundu ki başardık.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans polisakkarit kapsülü birincil virülans faktörü olduğunu ve en sık bu patojenik Maya yönlerini okudu. Kapsül boyutu çok suşları arasında değişebilir, stresli ya da düşük besin koşulları tanıttığında hızla büyümeye yeteneğine sahiptir ve olumlu zorlanma virülans ile ilişkili. Bu nedenlerden dolayı kapsül C. neoformans araştırmacılar büyük ilgi boyutudur. C. neoformans kapsül büyüme fenotipik test sırasında farklı tedaviler suşları Maya veya boyutu farklılıkları üzerinde etkileri anlamak için indüklenen olduğu. Burada biz boyama ve kapsül Çap ölçüm kapsül indüksiyon ve karşılaştırma iki yöntemden kabul edilen standart yöntemlerden birini tarif: (i) çini mürekkebi, konvansiyonel ışık mikroskobu ile birlikte ve (ii) ile birlikte boyama kullanılan negatif bir leke kapsül confocal mikroskobu tarafından takip ve hücre duvarı floresan boyalar. Son olarak, biz nasıl Hindistan mürekkep lekeli örneklerinden kapsül çap ölçümü-ebilmek var olmak göstermek sayısal görüntü analizi kullanarak otomatik.

Kapsül: indüksiyon, hücre boyama, görüntü ve ölçüm teknikleri, biz üç soy-in çizgisiyle C. neoformans: ortak, iyi karakterize laboratuvar zorlanma, H99S30ve iki klinik olarak izole soyu daha önce Bilinmeyen kapsül çapı, B18 ve B5231.
İş akışı kapsül indüksiyon, boyama ve çini mürekkebi kullanarak resim alma şekil 1Ail...

Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

Polisakkarit kapsülü Cryptococcus neoformans, birincil virülans faktörü olduğunu ve onun büyüklüğü zorlanma virülans ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kapsül çapı ölçümleri fenotipik test ve tedavi edici etkinliği ölçmek için kullanılır. Burada kapsül indüksiyon için standart bir yol sunulmaktadır ve boyama ve çapı ölçmek için iki yöntem karşılaştırılır.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K Görüntüleme.  Middle Tennessee State University. Polisakkarit kapsülü Cryptococcus neoformans, birincil virülans faktörü olduğunu ve onun büyüklüğü zorlanma virülans ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kapsül çapı ölçümleri fenotipik test ve tedavi edici etkinliği ölçmek için kullanılır. Burada kapsül indüksiyon için standart bir yol sunulmaktadır ve boyama ve çapı ölçmek için iki yöntem karşılaştırılır.

Video: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Kapsül tutarı kesintili yoğunluk Gradient kullanarak bakterilerin ayıran

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Genetik

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Sigara litik Ekzositoz görselleştirme<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dijital Işık mikroskopi ile Makrofagların gelen

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Otomatik ölçüm Cryptococcal türler polisakkarit kapsülü ve hücre vücut

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Biyomühendislik

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Suyu Microdilution Vitro tarama: yeni mantar önleyici bileşikler algılamak için kolay ve hızlı bir yöntem

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biyoloji

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Canlı Mikroskopi ve Açık Kaynaklı Yazılım Kullanılarak Aspergillus nidulans Büyüme Hızının Nicel Analizi

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

Yumuşakçalardan Ham ve Berraklaştırılmış Özlerin Tahmini Antikriptokok Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Size Matters: Cryptococcus neoformans kapsül çap ölçümü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler