Biz Ralph Nelson ve Daniel Possin geliştirilmesi istikrarlı transgenik Zebra balığı satırları oluşturmak için bu iletişim kuralı ve Eva Ma, Ashley George ve Gail Stanton ise düşünceli rehberlik için teşekkür ederiz. İş M.G., NIH NEI 5T32EY007031 W.C. ve M.G. için NSF GRFP 2013158531 ve EY026020 J.H. ve SB tarafından desteklenmiştir

Tüm hayvan deneyleri Üniversitesi Washington kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlanması hayvanlar ve donanımları
Not: Retina pigment epiteli (RPE) olan pigmentasyon retina özellikleri karanlık ve confocal zaman ex vivoImaging dokusuna zarar retinanın dış çevreleyen doku karanlık bir sayfadır. Karanlıkta, Zebra balığı RPE retina uzak geri çekildi; karanlık uyum RPE retina üzerinden gelecek kaldırma önce dilimleme ve görüntüleme kolaylaştırmak için balık.
<ol><li>Balık su ile dolu bir yumurtlama tank balık aktarmak ve yumurtlama tank ile koyu kumaş sarma veya karanlık bir dolapta yerleştirin.<ol>
<li>Karanlık Zebra balığı ötenazi tam RPE ayrılması retina yakınındaki izin vermek için önce en az 1 h için uyum. 30 dk karanlık adaptasyon çoğu RPE, kaldırmak için yeterli olsa da parçaları arasında photoreceptors intercalated kalabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eritmek ~ 15 mL petrol jöle bir 50 mL ölçek sıcak tabakta ve 3 mL sıvı 3 mL kayma uç enjektör çizin. Şırınga ters çevir'i, bir tüp rafa yerleştirin ve Vazelin soğumasını sağlar.</li>
	<li>Yeniden kullanılabilir bir Dilimleme odası düz 7 cm X 2,5 cm mikroskop Slayt üzerindeki olun.<ol>
<li>Açık tırnak cilası, slayt, ortasında 3 cm X 2,5 cm dikdörtgen oluşturmak için boya dar çizgiler kullanarak kurumasını bekleyin ve ardından tırnak cilası başka bir katman ekleme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüleme merdivenler kapak dilimleri görüntüleme sırasında tutmak için paket fişi üzerinde hazırlamak. Dilimleri merdiveni "basamakları" oluşturacak.<ol>
<li>Statik görüntüleme veya en az düzeyde çözüm akışı ile enjeksiyon deneyler için vazelin 18 mm kare cam kapak paket fişi üzerinde iki düz geniş paralel şeritler oluşan vazelin merdivenler olun. İki basık uygulamak için şırınga kullanın ~ soğutmalı vazelin 0.5 cm kapak fişinde apart 1 cm uzun yayma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku dilimleyici hazır.<ol>
<li>Çift kenar jilet etanol ile temiz ve kuru hava sağlar. Dört eşit parçaya makasla, önce uzunlamasına yarıya içine sonra her'bıçak arasında kes.</li>
		<li>Dilimleme odası doku dilimleyici sahnesinde yerini, Sahne Alanı'nda yatay olarak ortalayın ve uzun kenar hizalama kalıcı marker ile işaretlemek.</li>
		<li>Bir bıçak bölüm doku dilimleyici kol üzerine yüklemek, bıçak slayt üzerinde tırnak cilası dokunmadan düz ve ortalanmış yatıyor emin olduktan sonra bıçağı aparat hafifçe sıkın. Daha düşük topuzu ¼ ayarlayarak bıçak kol açmak, sonra yer filtre kağıdı görüntüleme odası ve test merkezinde bir parça kes. Eğer kağıt tamamen aracılığıyla kesme değil, bıçak yeniden bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 cm kabında koyun soğutmalı vazelin tek bir küçük nokta Ģırınga kullanarak ~ sağdaki merkezinin 1,5 cm. Görüntüleme bir merdiven yukarı dönük olacak şekilde vazelin ile forseps kullanarak basın. Başka bir küçük vazelin nokta olun ~ görüntüleme odasının giriş kenarından 1 cm.</li>
	<li>Vazelin şırınga 20 g iğne ile uygun ve o çıkarın. İğne şırınga üzerine tutun ve iki 1 cm uzun ince paralel şeritler vazelin Dilimleme odası merkezinde boyuna yapmak için kullanabilirsiniz. Şeritler uzay ~ 1 cm arayla.</li>
	<li>Merkezi sarma tarafından yeniden kullanılabilir tel göz döngü aracı yapmak bir ~ 4 cm kesimi 30 g tungsten tel çifti etrafında bir kez sıkıca forseps kapalı. Döngünün çapı genellikle bir Zebra balığı göz, biraz daha büyük olana tel forseps aşağı ve yukarı kaydırarak ayarlayın ~ 2-3 mm. tel biter büküm ve onları laboratuvar bant kullanarak 6cm ahşap sopanın ucuna güvenli.</li>
	<li>Zil'ın çözüm hazırlamak.<ol>
<li>50 ek hisse senedi çözüm (Tablo 1) X çözülme ve sabah deneme HEPES tampon, bikarbonat zil'ın çözüm (Tablo 2) taze ekleyin; her 10 mL konik santrifüj tüpü veya steril cam şişe zil'ın çözeltisi içinde ek hisse senedi çözümün 200 µL sulandırmak. Statik görüntüleme deneyler için en az 30 mL deneme başına zil'ın çözeltisi hazırlamak. Perfüzyon deneyler için gerekli zil'ın çözüm hacmi toplam deneme saat ve akış hızı üzerinde bağlıdır.</li>
		<li>İlave çözüm pH 7.4 bir dijital pH probu veya pH kağıdı kullanarak olduğunu ve ayarlamak onay buna göre ile seyreltik NaOH veya HCl.</li>
		<li>İsteğe bağlı gaz bubbler manifold perfüzyon için kullanılan veya bir standart tıbbi oksijen tankı ve bir hortum ile donatılmış regülatör kullanarak en az 5 min için % 100 oksijen gazı ile köpüren tarafından desteklenmiştir zil'ın çözüm buz üzerinde oksijen. Mağaza kapalı konik santrifüj tüpü veya steril cam şişe diseksiyon mikroskop yakınındaki buzda zil'ın çözüm oksijenli; Bu çözüm için Imaging, diseksiyon ve boyalar veya farmakolojik sulandırmak için kullanın.</li>
		<li>Diğer çözümler deneyinde, Na+gibi kullanılıyorsa,-zil'ın çözüm (Tablo 3) ücretsiz, tekrarlamak merdiven 1.9.1.-1.9.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Petri yemekler, forseps, mikro-makas ve diğer araçları diseksiyon mikroskop yakınındaki toplamak ve bir balık su buz banyosu Zebra balığı ötenazi için hazırlanın.</li>
</ol>2. retina dilimleri (bkz. şekil 1) hazırlanması
<ol><li>Çalışma ışık adaptasyon, (hangi-ebilmek RPE sopa daha sıkı yapmak için retina) en aza indirmek için kırmızı ortam ışığı altında ötenazi Zebra balığı buz banyosu daldırma tarafından dokunmatik yanıt kaybolur kadar genellikle 1-2 dk. balık bir petri Transfer edecek ve bir neşter cervically yerinden çıkar ama balık başını kesmek değil.</li>
	<li>Tel döngünün bir göz etrafında bağ dokusu gevşetin için kullanın ve sonra bir yandan göz ileri döngü ile yavaşça çekin. Mikro-makas diğer elinde kullanılarak, gözün arka kesmemeye dikkat çekici ve göz altında beyaz optik sinir kesme.</li>
	<li>Forseps bir petri soğuk zil'ın çözüm için buza kullanarak göz aktarmak ve ikinci göz için yineleyin. RPE retina kaldırılana kadar gözleri karanlıkta veya kırmızı ışık altında tutun.</li>
	<li>Eyecups içinde bir damla soğuk zil'ın çözüm bir petri içinde düz cam slayt üzerindeki bir düşük güç diseksiyon mikroskop altında incelemek.<ol>
<li>Kornea ile iyi forseps pierce, sonra yavaşça çıkarın parçalarını temiz, kırılgan kornea ve forseps veya makas ile gümüş sklera. Kaldırmak ve objektif ve sklera çoğunu atmak ( şekil 1A' ya bakınız) ve izole kadeh en az.</li>
		<li>Yağ, sklera ve siyah RPE küçük bit parçalar için kadeh bağlı kalır ve retina daha sonra kaldırıldı. 2.4.1. adımda RPE retina ayıran, hassas izole retina zarar vermemesi için ekstra dikkatli kullanarak aynı adımlarla devam edin.</li>
		<li>Kadeh açık yan (RPE kadar) aşağı slayt üzerinde konumlandırın ve thirds veya taze tek uçlu jilet bir hareket ile üç aylık dönemler halinde kesilmiş (bkz. şekil 1B). Yüksek kavisli doku parçaları atmak.</li>
	</ol></li>
	<li>Düz montaj retina filtre kağıt üzerinde.<ol>
<li>Filtre kağıt zil'ın çözüm ile ıslak ve slayt yanındaki kadeh parçalar yerleştirin. Düz forseps sağlam ıslak filtre kağıdı işlerken bu delinme önlemek için kullanın. Filtre kağıdı ve doku kapsayacak şekilde soğuk zil'ın çözüm ekleyin.</li>
		<li>Her elinde forseps kullanarak dikkatle filtre kağıdı her kadeh parça RPE ve Yani , yukarı dönük olacak şekilde göz arkası ile karşı karşıya photoreceptors altına sürükleyin. Kadeh parçaları tek bir hat boyunca filtre kağıdı ortasına yerleştirin (bkz. şekil 1 c). Kadeh parçalar sadece bir kenar veya köşe yakınlarında iyi Forseps ile yavaşça ele.</li>
		<li>Filtre kağıdı bağlı retina yardımcı olmak için bir kuru kağıt havlu 3 için ıslak filtre kağıdı yerleştirin s aşağı doğru nem fitil, ancak kuru haline doku izin. Kadeh adet düz filtre kağıt üzerinde yalan kadar yineleyin. Nazik emiş filtre kağıdı alt uygulama retina dümdüz yardımcı olur, ama bu adım gerekli değildir.</li>
	</ol></li>
	<li>RPE siyah yaprak kadeh parçalar üzerinde kalır, iyi forseps yavaşça o uzakta--dan bir-başlangıç soyma için kullanın (bkz. şekil 1 d) doku zil'ın çözüm bir düşüş oturuyor iken köşe. Retina filtre kağıdı, tekrar 2.5.3 wicking adımda kaldırmak. Retina nedeniyle Ryslampa görsel pigmentler pembe görünebilir.</li>
	<li>Retina diseksiyon ve düz merdiven 2,4-2,6 ikinci göz, isterseniz, soğuk zil'ın çözümde dalmış ilk düz monte retina tutmak montaj yineleyin. Dilimleme işlemi kolaylaştırmak için her iki retina parçalarını bir filtre kağıt üzerinde yerleştirilebilir. RPE kaldırıldıktan sonra deneyler karanlık gerektiren sürece protokol normal oda ışık altında yürütülen olabilir.</li>
	<li>Bir slayt üzerinde filtre kağıdı yerleştirin ve içine bırakarak bir tek uçlu tıraş bıçağı olan bir dikdörtgen döşeme ~ filtre kağıt retina hattın iki tarafında 0.5 cm. Filtre kağıdı hazır Dilimleme odasına götürün uzun filtre kağıdı kenarları forseps kullanarak ince vazelin satırları itmek ve retina soğuk zil'ın çözüm 3-4 damla içinde bırakın. Not: Bazı boya, lipofilik boya gibi en iyi bu aşamada Dilimleme önce düz bağlar yüklenir. Bu yüklü, uzak bir doku ile kötü ve dilimleme odasında yıkanmış. Örneğin, 558/568 BODIPY yoğun lekeleri retina C12 hücre membranları ve photoreceptor dış segmentleri (bkz. şekil 4A), yüklendiğinde ~ 5 µg/aşırı zil'ın çözüm bir makinaya ardından mL 15 dakika oda sıcaklığında (genellikle 23-27 ° C), .</li>
	<li>Dilimleme odası doku dilimleyici Sahne Alanı'na transfer işaretli hat boyunca uzun kenarına getirin ve güvenli odası sahneye laboratuvar bant ile sona erer. Bir uçta başlayarak, retina ve filtre kağıdı Dilimleme kolunda firma, hafif basınç kullanarak kesmek. İlk dilim tam, kesilmiş onay sonra kesmek için mikrometre kullanmak ~ 400 µm dilimleri.</li>
	<li>Görüntüleme merdiven bir araya getirin.<ol>
<li>Yer Petri kabına adım 1.7 görüntüleme için bitişik dilimlenmiş retina bölümleri ile dilimleme odası merdiven ( 1E anlamayagörmek). Çanak soğuk zil'ın çözüm ile içeriğini daldırın için doldurun.</li>
		<li>Forseps kullanmak ve dilimleri sular altında tutmak, yavaşça transfer filtre kağıdı ve retina merdivene Petri kabına soldan sağa doğru kaydırarak şeritler. Retina doğrudan dokunma için dikkat ediniz. Dilimlerini döndürme 90° ve filtre kağıdı kenarları vazelin içinde gömmek.</li>
		<li>İnce merdiveni Forseps ile retina katmanları diseksiyon mikroskop altında açıkça görünecek şekilde retina dilimleri yerleştirin (bkz. şekil 1G). Merdivenin her ucunda dilimler için doku içe doğru hareket doku enjeksiyonu veya akış sırasında en aza indirmek için diğer dilimleri doğru dönük olduğundan emin olun. İyi olmayan retina dilimleri silmek için filtre kağıdı yapıştırılır (bkz. şekil 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>İstenirse, boyalar retina dilimler halinde bu aşamada yük ve aşırı zil'ın çözüm görüntüleme önce yıkayın. Not: Propidium iyodür (PI) ve Höchst 33342 sağlam ölü ve tüm hücreleri, çekirdekleri sırasıyla leke (bkz. şekil 2B), oda sıcaklığında 20 dakika 5 µg/mL, retina dilimleri ile inkübe zaman. Tetramethylrhodamine (TMRM) biriken retina 1 inkübe boyunca aktif respiring mitokondri nM, oda sıcaklığında 30 dakika.</li>
	<li>Dilimleri boyama iken, görüntüleme odası ve enjeksiyon aparatı hazırlayın. Şırınga zil'ın çözüm ile boru Temizleme ve kabarcıklar tasfiye, görüntüleme odası giriş hortumunun açık ucunu takın ve stopcock kapatmak için kullanın. Şırınga kaldırın ve enjeksiyon için reagent(s) ile doldurun, sonra boru için yeniden bağlayın.</li>
	<li>Forseps vazelin görüntüleme odası giriş kenarına yakın nokta içine coverslip basarak görüntüleme odasına coverslip retina dilimleri ile aktarmak için kullanın (bkz. şekil 1 H). Görüntüleme odası dilimleri kapsayacak şekilde zil'ın çözüm ile doldurun.</li>
</ol>3. görüntüleme retina dilimleri
<ol><li>Sahne Alanı'ndaki bir dik confocal mikroskop objektif daldırma 20 veya 40 X su ile donatılmış bağlı enjeksiyon aparatı ile doldurulmuş görüntüleme odası yerleştirin. Görüntüleme odası sahne klipler ile güvenli.</li>
	<li>Merdiven üzerinde daldırma objektifin alt ve trans-ışıklı loş ışık altında merdivenin bir ucunda bir dilim odaklanmak. Her dilimin enine yönlendirme, photoreceptor dış segmentleri ve filtre kağıdı için güvenli yapışma varlığı için inceleyin.</li>
	<li>Zaman atlamalı görüntüleme için en iyi dilimi seçin ve mikroskop bilgisayar yazılımı zaman atlamalı resim alma için yapılandırın. Tablo 4 çeşitli floresan işaretleri ve boyalar tipik görüntüleme ayarları özetlenmektedir. Not: Resim alma oranı mikroskop, floresan marker(s) ve biyolojik süreci okudu bağlı olarak değişir. Örneğin, 800 x 800 piksel çözünürlük, 2 µs/pixel inceden inceye gözden geçirmek hız ve 10-s kare hızı photoreceptors GCaMP3 ve kırmızı boya ile kalsiyum dinamiklerini görüntüleme için kullanın.<ol>
<li>Varsa, yazılımı dilim (photoreceptor dış segmentleri, hücre gövdeleri, çekirdeği) zaman atlamalı sırasında olası hale gelmesini yardımcı olmak için fiziksel simge yapılar izlemek için kullanır. Ayrıca gerçek zamanlı Floresans dilim izlemek için yazılımı kurar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüleme başlar ve temel Floresans izleme. Floresans dilimi arasında (tipik olarak 2-5 dk içinde) stabilize, deney ile devam. Enjeksiyon, şırınga stopcock açın, sonra yavaş yavaş düşürmek ve geri iki kez karıştırma yardım için pistonu üzerinde çizin. Not: Örneğin, protonophore CCCP görüntüleme odasında 1 µM son bir konsantrasyon ulaşmak için konsantre çözeltisi enjekte edilerek mitokondriyal işlev ortadan kaldırmak. Bu GCaMP tarafından bildirilen photoreceptor sitozol patlama bir sağlam Ca2 + , sonra TMRM tarafından bildirilen mitokondri zar potansiyel sürekli bir düşüş neden olmaktadır.</li>
	<li>Yakından dilimleri drift için deneme sırasında izleyebilir ve mikro-ayarlamalar göre fiziksel yerler için yazılımı kullanın. Z yönünde enjeksiyon sırasında genellikle kayması ya da perfüzyon < 5 µm.</li>
</ol>4. nerede çözümler değişen veya sürekli akan perfüzyon deneyler sırasında retina dilimleri görüntüleme
Not: Retina görüntüleme çözümleri değişti nerede perfüzyon deneyler sırasında dilimler veya sürekli akan Kur aşağıdaki değişiklikler ile statik görüntüleme veya enjeksiyon deneyler için benzer.
<ol><li>1.4. adımda anlatılan vazelin merdivenler yerine daha dayanıklı balmumu merdivenler retina dilimleri çözüm akışı sırasında sabit tutmak için kullanın.<ol>
<li>İki küçük paralel silindir unflavored diş balmumu yer ~ 0.5 cm bir coverslip ayrı. Düz bir yüzeye bir her ikisine coverslip kenarına paralel doğru aşağı ve dışarı yaparken. Her ikisi de Puan edinildi düzleştirilmiş silindir #1 coverslip ile yatay olarak ( 1E rakam, sağ tarafta görmek) sonra smear vazelin mum şeritler bir spatula ile arasında ince bir tabaka.</li>
		<li>2.10.2. adımda görüntüleme merdiven montajı, dilimlenmiş filtre kağıdı kenarları ince forseps (şekil 1G) kullanarak balmumu puanları basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfüzyon adım 2.12 için ayarlamak için şırınga rezervuar preoxygenated çözümleri ile doldurun veya isteğe bağlı gaz manifold her rezervuar çözümlerinde oksijen kullanın. Floş tüm boru ile zil'ın çözüm, tüm satırları açıldığında akışı ve büyük kabarcıklar tasfiye emin olun.</li>
	<li>Adım 2,13 görüntüleme odasında doldurmadan önce şırınga yanal akışı sırasında kayan önlemek için coverslip maruz kalan her köşesinde üzerinde vazelin başka bir nokta eklemenizi sağlar.</li>
	<li>Görüntüleme odası girdikten ve mikroskop sahnede monte sonra Aspiratörü üzerinde açın ve Aspiratörü boru bağlayın. Zil'ın çözüm akışını sınamak ve micropositioner odası taşmaları önce az miktarda sıvı çizilir böylece çıkış odası aspiratör tüp yerleştirmek için kullanın (genellikle ~ 2 mL/dk akış hızı için çözüm yüzey yukarıda 1 mm). Zil'ın çözüm adım 3.4 dilimleri seçerken akan tutun.</li>
	<li>3.4. adımda perfüzyon deney yapmak için ilk çözüm stopcock bu ikinci çözüm açılırken kapatarak çözümleri akışının geçiş yapın.<ol>
<li>Örneğin, hücre dışı Na+ görüntüleme odası üzerinden tüketmek için zil'ın çözüm veya Na+ile dolu iki şırınga rezervuarlar kullanın-ücretsiz çözüm (Tablo 3). Taban çizgisi oluşturun, sonra+Na geçmek için zil'ın çözüm akış-ücretsiz çözüm. Bu büyük sitozolik Ca2 + photoreceptor dış kesimlerinde artırır ve hücre (bkz. şekil 4) organları ile sonuçlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış hızı görüntüleme sırasında sürekli bu yüzden yerçekimi beslenen perfüzyon sistemleri için çözüm her Reservoir düzeyini izlemeniz. Oksijenli çözümleri ile gerektiği gibi rezervuar kontör veya sürekli oksijen gazı manifoldu ile köpüren korumak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Ma, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Pde6+reduces+cell+body+Ca2++transients+within+photoreceptors.">Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors.</a> Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).</li><li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish.">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li><li>Andrews, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+apoptosis+in+live+zebrafish+using+fluorescence+lifetime+imaging+with+optical+projection+tomography+to+map+FRET+biosensor+activity+in+space+and+time.">Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.</a> J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).</li><li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0/G1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation.">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li><li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Visualizationof+Neuronal+Activity+during+Perception.">Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception.</a> Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li><li>Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+translational+neuroscience+research:+from+tank+to+bedside.">Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside.</a> Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).</li><li>Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish.">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).</li><li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish.">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li><li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish.">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li><li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans.">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li><li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration.">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li><li>Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina.">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li><li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation.">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).</li><li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+retinal+slice+preparation.">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li><li>Kennedy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+cone+photoreceptor-specific+promoter+and+genetic+rescue+of+achromatopsia+in+the+nof+mutant.">Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li><li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments.">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).</li><li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases.">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li><li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Real-time+Glucose+Uptake+Reveals+Distinct+Transport+Among+Cell+Types.">Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).</li><li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2++Pools+in+Cone+Photoreceptors.">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li><li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+by+vital+dyes+of+M&#252;ller+glial+cells+in+retinal+wholemounts.">Selective staining by vital dyes of M&#252;ller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li><li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy.">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , (2012).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina.">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Ex vivo görüntüleme taze Zebra balığı retina dilim photoreceptor Biyoloji20,21,22eğitim için çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır ve çözümleme olgun, tek hücre tam sağlar benzersizdir farklılaştırılmış retina. Uygulama ile hatta retina aynı kısmından seri dilimleri kullanarak tek bir balık dokudan ile birden çok deney mümkündür. Sorunlar ve öneriler Elektrofizyoloji çalışmalar...

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın tıbbi ve temel bilimsel araştırma1, küçük boyutu, hızlı bir gelişme ve omurgalı organ sistemleri sayesinde kullanılan olmak. Zebra balığı larva transgenesis için kurulan yöntemleri ile birlikte doğal şeffaflık yaşayan hayvan hücresel süreçler ayrıntılı görselleştirme etkin. Bir dizi genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler Ca2 + 2, hidrojen peroksit3, apoptotik harekete geçirmek4 ve ATP5algılamak için belirli Zebra balığı hücrelere hedef almış.
Zebra balığı larva vivo içinde görüntüleme devrimler neuroscience eşleme beyin devresi6 dahil olmak üzere, alanında yol açmıştır ve ilaç geliştirme merkezi sinir sistemi için7bozuklukları. Zebra balığı vizyon araştırma için uygundur çünkü onların retina Laminer yapısı ve yüksek omurgalılarda nöron tipleri bulunmaktadır ve bunlar sağlam görsel davranışları8,9görüntüler. Retina dejenerasyonlar insan hastalığına benzer çeşitli başarıyla modellenmiş ve Zebra balığı10,11bireysel photoreceptors bir retina2içindeoluşan bozucu canlı görüntüleme dahil olmak üzere, okudu, 12.
Vivo larva Zebra balığı görüntüleme değerli bir araçtır, Balık büyüme ve gelişme pigmentasyon ve bazı farmakolojik tedaviler tüm hayvan nüfuz edemez gibi daha zor olur. Ayrıca, belirli hücresel süreçler daha sonraki zaman Puan anlayış fonksiyonu ve hastalık ilerleme için kritik yetişkin hayvanlarda yapmak geliştirme ve yaş ile değiştirme. Biyokimyasal immunoblot, quantitiative PCR, O2 tüketimi ve metabolomic analizleri gibi yöntemleri Biyoloji bir bütün olarak retina hakkında önemli ipuçları sağlayabilir, ancak katkıları etkilenen tek tek hücre tiplerinin ayırt etmek zordur hastalık. İzole retina doku ex vivo Imaging bu sorunlar atlar ve düz Imaging bağlı retina affords dış retina13bir görünümünü, daha derin iç retina özellikleri gizlenmiş. Bu içinde sunulan tüm katmanları ve hücre tipleri açık bir görünümünü etkinleştirmek immunohistokimyasal analizleri, sabit ama sadece tek bir anlık görüntü normal fonksiyon ve hastalık dahil dinamik süreçlerin teklif gibi enine retina dilimler.
Burada, görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden ex vivo enine retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Elektrofizyolojik ve morfolojik araştırmalar14,15, zaman atlamalı ex vivo confocal kullanarak görüntüleme için önemli değişiklikler ile amfibi ve Zebra balığı retina dilimleri hazırlama yöntemleri benzer mikroskobu. Floresans yanıt biyosensörler veya boya dilimleri içinde gerçek zamanlı olarak farmakolojik ajanlar perfüzyon kullanarak teslim ederken confocal mikroskop ile izlenir. Yöntem photoreceptors görüntüleme için geliştirilmiş olsa da, Müller hücre, iki kutuplu hücreler, yatay hücreler, amacrine hücreleri veya retina ganglion hücrelerinin uygun floresan işaretleri ile görüntülenmesi için kullanmak için uygun olabilir. Ayrıca, dilimleri rapor hücre canlılığı, veziküler ulaşım, mitokondri işlev veya Redoks devlet hücre geçirgen floresan boyalar ile yüklenebilir. Bu çok yönlü hazırlık Ca2 + dinamikleri, sinyal iletimi ve metabolik durumu da dahil olmak üzere retina hücre altı işlemleri geniş bir görselleştirme sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1153">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">zebrafish</td>
			<td style="width:239px;">Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:401px;">stocks maintained in-house as stable transgenic lines</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">petroleum jelly</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">19-090-843</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">3-mL slip tip syringe</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-823-436</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">20g 3.8 cm slip tip needle</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">14-826-5B</td>
			<td style="width:401px;">for petroleum jelly syringe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection, slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Seche Vite clear nail polish</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B00150LT40</td>
			<td style="width:401px;">for slicing chamber</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">18 mm X 18 mm #1 glass coverslips</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">unflavored dental wax</td>
			<td style="width:239px;">Amazon</td>
			<td style="width:181px;">B01K8WNL5A</td>
			<td style="width:401px;">for imaging ladders</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">double edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51427</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue slicer with digital micrometer</td>
			<td style="width:239px;">Stoelting</td>
			<td style="width:181px;">51415</td>
			<td style="width:401px;">for tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 &#181;m pore size</td>
			<td style="width:239px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:181px;">HAWG01300</td>
			<td style="width:401px;">filter paper for mounting retinas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">FB0875712</td>
			<td style="width:401px;">for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">15 cm plain-tipped wood applicator stick</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">23-400-112</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">30g (0.25 mm diameter) tungsten wire</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">AA10408G6</td>
			<td style="width:401px;">for wire eye loop tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-glucose</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G8270</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium L-lactate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">L7022</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sodium pyruvate</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P2256</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G3126</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;L-glutathione, reduced</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">G4251</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">A5960</td>
			<td style="width:401px;">component of supplement stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S7653</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P9333</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2 &#183; 2H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C3881</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">S8282</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2 &#183; 6H2O</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">M0250</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">H3375</td>
			<td style="width:401px;">component of Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris base</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">BP152</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 N HCl</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">02-003-063</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P5655</td>
			<td style="width:401px;">component of Na+-free Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:239px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C1062-P</td>
			<td style="width:401px;">container for Ringer&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm blades</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">501790</td>
			<td style="width:401px;">micro-scissors for eyecup dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips</td>
			<td style="width:239px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:181px;">504510</td>
			<td style="width:401px;">fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">single edge razor blades</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">12-640</td>
			<td style="width:401px;">for eyecup dissection and trimming filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">EMD Millipore filter forceps</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">XX6200006P</td>
			<td style="width:401px;">flat forceps for handling wet filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">C12 558/568 BODIPY</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">D3835</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 15 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">propidium iodide (PI)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">P3566</td>
			<td style="width:401px;">stains dead cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">62249</td>
			<td style="width:401px;">stains live cell nuclei; incubate 5 &#181;g/mL for 20 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">T668</td>
			<td style="width:401px;">stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">tissue perfusion chamber</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td>
			<td style="width:401px;">imaging chamber for injection or perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:332px;">2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)</td>
			<td style="width:239px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">N13195</td>
			<td style="width:401px;">fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Olympus laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:239px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">FV1000</td>
			<td style="width:401px;">confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">C2759</td>
			<td style="width:401px;">experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">miniature aspirator positioner</td>
			<td style="width:239px;">Cell MicroControls</td>
			<td style="width:181px;">FL-1</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:332px;">perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder</td>
			<td style="width:239px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:181px;">various</td>
			<td style="width:401px;">for perfusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing fresh retinal slices from adult zebrafish for ex vivo imaging experiments

Retina, başlatır ve vizyon ilk adımları entegre karmaşık bir dokudur. Retina hücrelerinin disfonksiyon birçok kör edici hastalıklar özelliğidir ve gelecekteki tedaviler hücreleri normal çalışmasını temel anlayış üzerinde ne kadar farklı retina hakkında doğru katlayın. Katkıları belirli hücre tiplerinin retina hücre ortamda azalır çünkü bu tür bilgileri biyokimyasal yöntemlerle kazanıyor zor kanıtlamıştır. Canlı retina görüntüleme genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler, giderek artan sayıda sayesinde bir hücre altı düzeyde çok sayıda biyolojik süreçlerin bir görünümünü sağlar. Ancak, bu teknik şimdiye Kurbağa yavrularını ve Zebra balığı larva, izole retina en dıştaki retina katmanları veya retina Canlı hayvanlarda daha düşük çözünürlükte görüntüleme için sınırlı olmuştur. Burada confocal mikroskobu ile canlı görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden canlı ex vivo retina dilimler oluşturmak için bir yöntem mevcut. Bu hazırlık tüm retina katmanları ve çoğu hücre tipleri confocal görüntüleme deneyler perfüzyon kullanarak gerçekleştirmek için görünür enine dilimlerle verir. Transgenik Zebra balığı ifade floresan proteinler veya belirli retina hücre tipleri veya organelleri biyosensörler sağlam bir retina tek hücreli bilgi ayıklamak için kullanılır. Ayrıca, retina dilimleri floresan göstergesi boya, yöntemin çok yönlülük için ekleme ile yüklenebilir. Bu protokol Ca2 + Zebra balığı koni photoreceptors içinde görüntüleme için geliştirilmiş, ancak uygun işaretleri ile bu Ca2 + veya metabolitleri Müller hücreleri, bipolar ve yatay hücreler, microglia, amacrine hücreleri veya retina ölçmek için adapte ganglion hücrelerinin. Bu yöntem o hücre tipi eğitim için uygun değildir bu yüzden retina pigment epiteli dilimleri kaldırılır. Uygulama ile birden çok deneyler için bir hayvan seri dilimler oluşturmak mümkündür. Bu uyarlanabilir teknik retinal hücre biyolojisi, Ca2 +ve enerji homeostazı hakkında birçok soru cevap için güçlü bir araç sağlar.

Sabit konumlandırma ve dilimleri enine yönlendirme enjeksiyon veya perfüzyon farmakolojik ajanların başarılı görüntüleme anahtarıdır. Dikkatle inceleyin ve dilimler confocal görüntüleme önce tüm retina katmanlar görünür (şekil 2A, dilim II) emin olmak için gerektiği gibi yeniden konumlandırmak. Bir dilim döndürülürse biraz ileri (şekil 2A, dilim III), dış segmentleri demetleri görünür hale gelir ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments at JoVE.com

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Ex Vivo deneyler görüntüleme için yetişkin Zebra balığı üzerinden hazırlanması taze retina dilimleri

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

preparing-fresh-retinal-slices-from-adult-zebrafish-for-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

9.1K Görüntüleme.  University of Washington. Retina doku Imaging geleneksel biyokimyasal yöntemlerle toplanan tek hücreli bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı üzerinden Zebra balığı retina dilimleri hazırlanması için confocal düşsel açıklar. Floresan genetik olarak kodlanmış sensörler ve göstergesi boyalar görselleştirme çok sayıda biyolojik süreçlerin ayrı retina hücre türlerinde izin vermeyin.

Video: Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Nörobilim

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular characterization. Fluorescence-activated nuclei sorting (FANS) can be used to successfully isolate and study human neuronal nuclei (NeuN+) populations from frozen archival tissue, thereby avoiding problems associated with handling&#160;fresh tissue. However, efforts to similarly isolate astroglia from the non-neuronal (NeuN-) element are lacking. A recently developed and validated immunotagging strategy uses three transcription factor antibodies to simultaneously isolate enriched neuronal (NeuN+), astrocyte (paired box protein 6 (PAX6)+NeuN-), and oligodendrocyte progenitor (OLIG2+NeuN-) nuclei populations from non-diseased, fresh (unfixed) snap-frozen&#160;postmortem human temporal neocortex tissue.
This technique was shown to be useful for the characterization of cell type-specific transcriptome alterations in primary pathological epilepsy neocortex. Transcriptomic analyses confirmed that PAX6+NeuN- sorted populations are robustly enriched for pan-astrocyte markers and capture astrocytes in both resting and reactive conditions. This paper describes the FANS methodology for the isolation of astrocyte-enriched nuclei populations from fresh-frozen human cortex, including tissue dissociation into single-nucleus (sn) suspension; immunotagging of nuclei with anti-NeuN and anti-PAX6 fluorescently conjugated antibodies; FANS gating strategies and quality control metrics for optimizing sensitivity and specificity during sorting and for confirming astrocyte enrichment; and recommended procurement for downstream transcriptome and chromatin accessibility sequencing at bulk or sn resolution. This protocol is applicable for non-necrotic, fresh-frozen, human cortical specimens with various pathologies and recommended postmortem tissue collection within 24 h.

We have developed a method that enriches for and isolates human astrocyte populations from fresh-frozen tissue for use in downstream molecular analyses.