Protokolümüz, kültürlü zebra balığı nöronlarında ve larvalarında hidrojen peroksit biyosensörü kullanımını açıklar. Bu protokol, araştırmacıların reaktif oksijen türlerinin normal fizyoloji ve patofizyolojideki rolünü incelemelerine yardımcı olacaktır. Bu tekniğin ana avantajı, canlı hayvanlarda ve kültürlü hücrelerde hidrojen peroksitin gerçek zamanlı olarak tespit edilmesidir.
Bu yöntem kemirgen modeli sistemi gibi diğer hayvanlara uygulanabilir. Kapakları hazırlamak için% 100 etanolde depolanan asitle temizlenmiş kapaklar kullanın. Depolama kabından bir kapak kapağını çıkarmak için asaları kullanın ve artık etanol kaldırmak için alevlendirın.
Kapak kapağını 35 milimetrelik bir kültür çanağının içine bir açıyla yerleştirerek tamamen kurulayın. Poly-D-Lizin veya PDL veya çalışma çözümü hazırlayın. PDL'yi her kapak ucunun ortasına uygulayın, çözeltinin kenarlara yayılmasını önleyin ve PDL'yi oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika kuluçkaya bırakın.
PDL'nin kurumadığını unutmayın. PDL'yi 0,5 mililitre steril suyla yıkayın ve plakaların tamamen kurumasına izin verin. Laminin çalışma çözümünü hazırlayın.
Ve her kapak ucunun ortasına uygulayın, çözeltinin kenarlara yayılmasını önleyin. Plakaları 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde iki ila altı saat boyunca kuluçkaya yatırın, laminin çözeltisinin kurumasını önlayın. Plaka retinal ganglion hücrelerinde veya RGC'lerde embriyo diseksiyonu yapmak için, dört adet 35 milimetre doku kültürü yemeği hazırlayıp etiketlenin ve dört mililitre %70 etanol ile doldurun.
E2 medya bir. E2 medya iki. Ve E2 medya 3, diseksiyon gününde.
Bulaşıkları buzdolabında saklayın. Zebra balığı embriyoları döllenmeden 34 saat sonra olduğunda, laminin ile kaplanmış kültür yemeklerini inkübatörden alın. Ve kapak kaymalarını 0,5 mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, her kültür yemeğine dört mililitre ZFCM + ortam ekleyin. Plakayı kurutmaktan kaçının. Hazırlanan soğutmalı kültür yemeklerini alın ve oda sıcaklığına denk hale getirsinler.
Dört ila altı PCR tüpünü 15 mikrolitre ZFCM + ortamla doldurun. Zebra balığı embriyolarını inkübatörden alın ve embriyoları sterilize etmek için 5-10 saniye boyunca% 70 etanol içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına daldırın. Pipet transferi kullanarak, embriyoları aşırı etanolden yıkamak için steril E2 ortamı içeren bir tabak E2 ortamına aktarın.
Daha sonra embriyoları E2 ortam iki çanağa aktarın ve keskin tokmaklarla korozyonlarını çıkarın. Son olarak, embriyoları diseksiyon yapmak için E2 ortama üç çanağa aktarın. Bir çift ince önseçim kullanarak, embriyoları ön taraftaki asalardan biriyle sarısına yerleştirin ve tutun.
Ve kuyruk arkasını diğer kanatçıklarla birlikte yumurta sarısı kesesine çıkarın. Boynu asalarla tutun ve beyni ve gözleri E2 ortamına maruz bırakmak için başını koparın. İnce tokmakla, kraniyal dokuyu ikinci bir tokmakla tutarken gözleri yavaşça kafadan yuvarlayın.
Dört gözü ZFCM+Gently içeren daha önce hazırlanmış tüplerden birine aktarın, hücreleri ayrıştırmak için yaklaşık 45 kez bir p20 pipetle yukarı ve aşağı üçleme. ZFCM+'ı ayrışmış hücrelerle kapak altlıklarının ortasına aktarın. Titreşimleri emmek için bir polistiren köpük raf üzerinde 22 santigrat derecede tezgah üstü kültürleri koruyun.
Görüntüleme gününde, RGC aksonlarının büyümesini doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Canlı hücre görüntüleme için, kapakları kültür çanaktan canlı hücre görüntüleme odasına aktarın. DIC objektif OG-590 Longpass kırmızı filtre ve EMCCD kamera ile donatılmış ters bir mikroskop kullanın.
Görüntülemeden önce, ZFCM+medium'u ZFCM ile değiştirin-Hücreleri 10X hedefiyle konumlandırdıktan sonra, bir yağ daldırma hedefi kullanarak 60X büyütmede görüntüler elde edin. Ek bir 1,5X büyütme kullanın. İlk olarak DIC görüntülerini alın.
Ardından, uygun filtre kümesini kullanarak roGFP2-Orp1 görüntüsünü görüntüleyin. İlk görüntü setini aldıktan sonra, farklı tedavi çözümleri içeren medya ile medya alışverişi. pH ve ozmolarite değişikliklerini önlemek için medya her 30 dakikada bir değiştirilmelidir.
In vivo görüntüleme için, metilen mavisi olmadan% 0.003 fenil tiyotirea içeren 22 ila 24 saatlik döllenme sonrası embriyoları E3 medyasında tutun. Medya alışverişi ve ölü embriyoları günlük olarak çıkarın. İstenilen yaşta, 35 milimetre cam dip kültürü yemeklerinde embriyoları %1 agarose'da uyuşturun ve monte edin.
Embriyolar, görüntüleme için ilgi alanına bağlı olarak dorsally, ventral veya yanal olarak yönlendirilebilir. Agarose katılaştıktan sonra, yemekleri metilen mavisi olmadan E3 ortamı ile doldurun, ancak% 0.016 trikain ile doldurun. Mikroskobu görüntüleme için ayarlayın.
Agarose damlasının altına monte edilmiş embriyoları görüntülemek için ters lazer tarama konfokal mikroskobu kullanın. RoGFP2-Orp1'i heyecanlandırın ve istediğiniz emisyon filtreleriyle ilgili görüntüleri elde edin. Embriyoların istenen kısmından beş mikro metre kesit kalınlığında z-yığınları elde edin.
Görüntülemeden sonra, embriyoları Agarose'dan ince forsepslerle çıkarın ve istenen yaşa kadar fenil tiyotirea ile inkübatör ve metilen mavisi serbest medyada tutun. Hidrojen peroksit biyosensörü ve kültürlü zebra balığı RGC genişletilmiş aksonlarının temsili bir görüntüsü burada gösterilmiştir. Hücre gövdesi, akson ve büyüme konileri bireysel nöronlarda açıkça görülebilir.
Hidrojen peroksitin kültür ortamına eklenmesi oran değerlerini artırarak bu sistemle gerçek zamanlı değişikliklerin tespit edilebileceğini gösteriyor. Hidrojen peroksit seviyelerinin nicelleştirilmesi, tüm zebra balığı embriyolarındaki hidrojen peroksit seviyelerini belirlemek B.To panelde gösterilmiştir, mRNA tek hücre aşamasında enjekte edildi ve tüm dokuların roGFP2-Orp1 biyosensörini ifade etmesine neden oldu. Zebra balığı larvalarının baş bölgesi, retinadaki hidrojen peroksit seviyelerine odaklanan iki farklı zaman noktasında gösterilir.
Zebra balığı embriyolarında döllenme sonrası iki gün ve döllenme sonrası beş gün hidrojen peroksit bazal düzeyleri ölçüldü. Döllenme sonrası iki günde, oran değerleri döllenme sonrası beş güne göre önemli ölçüde daha düşüktü. Ayrıca, her hayvan retina hidrojen peroksit içeriğinde farklı bir artış gösterdi.
Gözleri çıkarmak için ince forseps kullanmak ve gözlerin pipetle hafifçe ayrışması bu prosedürdeki en kritik adımlardır. Bu protokol, ROS sinyalinde yer alan faktörleri araştırmak için ilaç tedavileri ile takip edilebilir.
