Bu eser diyabet Kanada tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).</li>
<li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue%3A+structural+and+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/246759856_RNA_Isolation_from_Adipose_Tissue_An_Optimized_Procedure_for_High_RNA_Yield_and_Integrity">RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity.</a> Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).</li>
<li>Cirera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+isolation+of+total+RNA+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue.</a> BMC Res Notes. 6, 472(2013).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Aşağıdaki HF-diyet, beslenme obez fareler vücut ve beyaz yağ dokusu ağırlık N diyet beslenen fareler için karşılaştırıldığında artmıştır bulunmuştur. Fenol çözüm kullanarak çıkarılan RNA iyi saflığı ile örnekleri vermiştir. Leptin öncelikle yağ dokusu tarafından üretilen bir adipokine ve olumlu fat kitle16ile ilişkilendirmek için bilinir. Beklendiği gibi leptin mRNA ifade obez farelerde concomitance onların yağ kitlesi ile artmıştır.
Bu yöntem birkaç önemli adımlar vardır. Farklı yağ dokusu depoları farklı işlevleri2,5var bilinen büyük kirlenme bir beyaz yağ dokusu depo başka bir ile olanıdır. Kirlenme downstream uygulamalarında yanıltıcı sonuçlar getirebilir. Şişman fareler arasında düzenli ve tutarlı bir hızda beyaz yağ dokusu toplama hava ile temas halinde bir kez kuru eğilimi gibi Ayrıca, kilo alınması gerekip gerekmediğini önerilir. Aksi takdirde, bir yağ yastığı toplam ağırlığı yanlış olabilir. Kısa bir süre önce MIQE takip RNA iyi kalite ve verim, almak için kurallar olduğunu kesin kıymet17. Özellikle, taşlama sırasında çok iyi örnek toz verme verimi en üst düzeye çıkarmak yardımcı olabilir. Bu RNA izolasyon sırasında doku toz ve fenol çözüm arasında temas en üst düzeye çıkarır. Son ama en az değil RNA içeren katman yalıtım sırasında RNA izolasyon (Adım 3.12) olduğunu. Yağ daha az su daha yoğun olduğu için faiz faz üzerine yerleştirilir. Yağ etkilenmişimdir en aza indirme aşağı akım uygulamaları ile girişim azaltmak gereklidir.
Bu yöntemin bir sınırlama yordamı hem de RNA izolasyon sırasında zararlı Kimyasalları ile çalışmak için gereken birkaç adımları gerçekleştirmek için gerekli beceri olduğunu. Ayrıca, tüm emek yoğun bir süreçtir.
Yağ dokusu toplama ve RNA izolasyon genellikle her kullanıcı tarafından ayarlanır küçük ayrıntılar dışında önce işleme örnek yöntemine çok alternatif değildir. RNA izolasyon söz konusu olduğunda, fenol/kloroform ayıklama veya RNA izolasyon kitleri gibi birçok seçenek mevcuttur. Orada avantajları ve dezavantajları her seçenek ve aşağı akım uygulamaları esaslı en iyi yöntemi seçmesini kalmıştır. Fenol/kloroform ayıklama daha ucuz ama zararlı Kimyasalları kullanımı gerektirir ve zahmetli. RNA izolasyon kitleri genellikle daha pahalıdır ama prosedür daha hızlıdır ve genellikle iyi bir kalite ve saflık örnekler verir. Malzeme beyaz yağ çoğunlukla oluşan dokusunda yağ sınırlı olması nedeniyle verim ve RNA saflığı dikkate almak önemlidir. Fenol çözüm için yalıtım (fenol/kloroform çıkarma) kullanarak önemli yararı RNA, DNA ve protein bir tek örnek18ayırma imkanı vardır. Bu maliyet ve zaman etkili gibidir yeterli malzeme almak için gerekli fare sayısını azaltır. Daha önce de belirtildiği gibi yağ kitlesi bazı fare modellerinde sınırlıdır. Bu aşağı akım uygulamalar için yetersiz malzeme neden gibi yere yağ dokusu ayrı ayrı RNA, DNA ve protein elde etmek için üç parçaya bölerek bu fareler için önerilmez. Bu sorunu aşmak için birlikte gerekli hayvan sayısının bir artmasına yol benzer yağ dokusu perondan kullanıcı tanımlı kriterlere göre birkaç fare havuzu mümkündür.

Obezite tip 2 diyabet1gibi komplikasyonlara yol açabilir bir dünya çapında salgın var. Obezite ve onun ilişkili komplikasyonlar diyet kaynaklı obez ve genetiği değiştirilmiş hayvan modelleri araştırma için sık kullanılır. Geleneksel olarak, beyaz yağ dokuları aşırı enerji için bir saklama bölmesi olarak bilinir ve kahverengi yağ dokusu enerji ısı2,3içine dönüştürünceye çoğunlukla lipidler oluşur. Yağ dokusu dinamiktir ve genişletilir ve gıda alımı ve fiziksel aktivite gibi birçok faktöre bağlı olarak küçültme. Bu nedenle, bu değişiklikler için katkıda bulunan etkenleri belirlemek için yeterli yağ dokusu toplama ve işleme gerekli4vardır.
Beyaz yağ dokular arasında subkutan ve viseral yağ depoları anatomik Lokalizasyon gibi farklı özelliklere sahip ve2,5işlev genel olarak kabul. Bu nedenle, çelişkili sonuçlar veya büyük değişkenlik önlemek için dikkat yağ yastıkları toplarken farklı bu yağ depoları arasında çapraz bulaşma önlemek için alınması gerekir.
Dahası, RNA veya protein fareler beyaz Yağ dokusundan izole zaman üç önemli sorunlar vardır. Farklı beyaz yağ depoları birbirinden ayıran sınır her zaman açık, diğer organlar böbrekler ve kalp6gibi aksine değildir gibi ilk olarak, obez farelerde yağ yastıkları toplama kolay bir iş değil. İkinci olarak, protein veya RNA izolasyon sırasında yağ dokusu yüksek lipid içeriği nedeniyle lipidler tabakası üst yüzen ve örnek için doğrudan erişimi engeller. Üçüncü olarak, kahverengi yağ dokusu veya diğer dokularda aksine, beyaz yağ dokusu önemli ölçüde daha düşük RNA ve protein içeriğe sahip ve bu genç fare kullanırken büyük endişe kaynağıdır, fareler bir normal (N) diyet beslenen ve için beklenen fareler var düşük yağ kütlesi (Yani KO modelleri, ilaçlar, tedavi egzersiz eğitim, vb.) 7 , 8.
Bu nedenle, RNA Yağ dokusundan izole etmek için uygun olan yöntemi seçimi önemlidir. Fenol/kloroform ayıklama için alternatif yöntemler ticari kitleri vardır. Onlar genellikle RNA arıtma tarafından takip sütun9tarihinde bir ilk fenol ayıklama adım temel alır. Ancak, bu kitleri normalde daha pahalı olduğunu ve RNA kalitesi değişken olabilir ise daha düşük verim, örnekleri vermek ama daha az zaman alıcı. Ancak, burada açıklanan fenol çözüm/kloroform çıkarma için en büyük avantajlarından biri RNA, DNA ve protein bir tek örnek10izole imkanı vardır. Çünkü fareler yağ yastıkları genellikle küçük ve RNA ve proteinler küçük miktar (özellikle yalın fare modellerinde) vermek, bu protokoller bir küçük bir örnek dışarı alabilirsiniz veri en üst düzeye çıkarmak.
Bu kağıt amacı üç fare beyaz yağ dokusu depoları hem de miktar ve RNA izolasyon kalitesi yeterli örnek koleksiyonundan emin olmak için bir yöntem ayrıntılı olarak tarif etmektir. Bu iletişim kuralı takip ederek elde RNA gerçek zamanlı PCR deneyleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı kültürlü birincil adiposit RNA izolasyonu için tasarlanmamıştır.

<table><tbody><tr><td>1 mL seringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA&amp;bull;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Block heater (dry bath)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/&amp;micro;l)&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Filtered tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High fat rodent diet</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Leptin forward PCR primer (5&amp;rsquo;-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3&amp;rsquo;) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptin reverse PCR primer (5&amp;rsquo;-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3&amp;rsquo;) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Nanopure water (referred as ultrapure water)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile examination gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal rodent diet</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution (TRIzol)&amp;nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Pre-identified aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz spectrophotometer cuvette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rack for PCR tube strips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Racks for RT-PCR tube strips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Random hexamers&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR Rotor Gene system&amp;nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated bench-top centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 1.5 mL screw cap tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR machine</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 forward PCR primer (5&amp;rsquo;-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3&amp;rsquo;) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 reverse PCR primer (5&amp;rsquo; ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3&amp;rsquo;) 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel mortar and pestle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical pads</td><td>Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors&amp;nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mouse adipose tissue collection and processing for rna analysis

Çoğunlukla lipidler içerdiğinden diğer dokulara karşılaştırıldığında, beyaz yağ dokusu gibi gerçek zamanlı PCR ve Western Blot, karşıdan akış uygulamaları için bir önemli ölçüde daha az RNA ve protein içeriği vardır. Ek adımlar bu lipitlerin önlemek için gerektiğinde RNA izolasyon yağ dokusu örneklerinden de meydan okuyor. Burada, bu örnekler işlemek ve RNA izolasyon gerçekleştirmek için fare üç anatomik olarak farklı beyaz yağ dokuları toplamak için bir yordam mevcut. Biz daha fazla gerçek zamanlı PCR kullanarak cDNA ve gen ifade deneyleri sentezi tarif. Burada açıklanan protokol hayvanın saç ve kan yağ yastıkları yanı sıra doku toplama sırasında farklı yağ yastıkları arasında çapraz bulaşma kirlenme azalma sağlar. Bu da yeterli miktar ve çıkarılan RNA kalitesini sağlamak için optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı nerede yağ doku örnekleri gerçek zamanlı PCR gibi rutin deneyler için gerekli olan herhangi bir fare modeli için yaygın olarak uygulanabilir ama birincil adiposit hücre kültürü izolasyonu için uygun değildir.

Nekropsi yordamı izleyerek üç beyaz yağ dokuları toplanmış ve fareler (N ve HF diyet beslenen farelerin) iki grup ağırlıklı. Beklendiği gibi fareler HF diyet son vücut ağırlığı ve kilo alımı littermates N diyet (Tablo 1) göre artmıştı. Logosuna 2 kat artış PGF, PRF ve SCF ağırlığını obez farelerde N diyet'e kıyasla daha fazla bu gözlemler eşlik edildi.
İzole RNA ile herhangi bir deneyler gerçekleştirmeden önce saflığı 4,9 adımda anlatıldığı gibi değerlendirilmiştir. Her beyaz yağ dokusu için saf RNA (Tablo 2) olarak kabul edilir civarında 2.0 OD260/OD280 olduğunu oranı olarak örnekleri yeterli kalitede RNA izolasyon fenol çözüm tarafından üretilen. Gerçek zamanlı PCR veri leptin mRNA ifade PGF, PRF ve SCF obez farelerin N diyet (şekil 4A)'e göre önemli ölçüde arttı gösterdi. Nitekim, leptin mRNA ifadede gözlenen farklılıklar s16, Ct değerleri değil değiştirilmiş olarak fareler iki grup arasındaki sonuçlar normalleştirmek için kullanılan referans gen (şekil 4B) bir değişim nedeniyle değildi. HF diyet bir çalışma protokolü bir parametre belirtilir böylece, s16 güvenilir bir referans gen PGF, PRF ve SCF mRNA ifade için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig1.jpg"> Resim 1 . Farelerde beyaz yağ dokusunun anatomik Lokalizasyon. N diyet erkek fare her yağ dokusu depo ve böbrek üstü bezleri lokalizasyonu göstermek için davranışlarını kesip. SCF (A), (B)PGF, PRF (C) ve böbrek üstü bezi (D). PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57026/57026fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig2.jpg"> Resim 2 . RNA izolasyon protokolü akış şeması kullanarak fenol çözüm. RNA topraklı beyaz Yağ dokusundan izole etmek için gereken adımları şematik gösterimi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57026/57026fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig3.jpg"> Şekil 3 . Çamaşır suyu jel üzerinde RNA kalite değerlendirme. 1 ug subcutaneous yağlı (SCF) ve peri Gonad yağ (PGF) izole RNA'ın üzerinde % 1'özel beyazlatıcı Jel Elektroforez tarafından ayrılmış. 28s ve 18s rRNA UV-transillumination tarafından görüntülenmiştir. Jel SCF ve bir fare PGF izole RNA normal bir diyet beslenir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57026/57026fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig4.jpg"> Şekil 4 . HF diyetin etkisi beyaz yağ dokusu leptin ve s16 mRNA ifadede. Leptin (A) ve s16 (B) mRNA ifade. Veri s16 için Ct değer olarak gösterilir ve her ikisi de ortalama ± SE n olarak sunulmaktadır leptin için veri s16 mRNA düzeyleri için normalleştirilmiş 12-13 grup başına =. * p < 0.05 N diyet için karşılaştırıldığında. N, normal; HF, yüksek yağ; PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı. Bu rakam Tan, değiştirilmiş olan P. ve ark, obezite (2014) 22, 2201-2209. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57026/57026fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>N diyet</td>
			<td>HF diyet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son vücut ağırlığı (g)</td>
			<td>37,5 ± 1.3</td>
			<td>46,7 ± 1.7*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kilo alımı (g)</td>
			<td>6.6 ± 0.7</td>
			<td>16,7 ± 1.0*</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF (g)</td>
			<td>1,08 ± 0.17</td>
			<td>2,19 ± 0.15*</td>
		</tr>
<tr>
<td>PRF (g)</td>
			<td>0,79 ± 0,15</td>
			<td>1,71 ± 0.06*</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF (g)</td>
			<td>1.62 ± 0,35</td>
			<td>3,55 ± 0.20*</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Vücut ve beyaz yağ dokusu ağırlıkları HF diyet etkisi. Değerleri ifade aracı olarak ± SE n = 14-15 grup başına. * p < 0.05 N diyet için karşılaştırıldığında. N, normal; HF, yüksek yağ; PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı. Bu rakam Tan, değiştirilmiş olan P. ve ark, obezite (2014) 22, 2201-2209.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Örnekleri</td>
			<td>Oranı OD260/OD280</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF 1</td>
			<td>2.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF 2</td>
			<td>2.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF 3</td>
			<td>2,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>DARBE TEKRARLAMA FREKANSI 1</td>
			<td>1,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>DARBE TEKRARLAMA FREKANSI 2</td>
			<td>2.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>DARBE TEKRARLAMA FREKANSI 3</td>
			<td>2.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF 1</td>
			<td>2.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF 2</td>
			<td>2,02</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF 3</td>
			<td>2.06</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2. RNA saflık beyaz yağ dokuları izolasyonu sonra. n = 3 yağ dokusu başına. PGF, peri Gonad yağ; PRF, peri-böbrek yağ; SCF, karın subcutaneous yağlı.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis at JoVE.com

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Bu kağıt amacı farklı beyaz yağ dokuları fareler toplamak, yağ örnekleri işlemek ve RNA ayıklamak için bir adım adım yordam sunmaktır.

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

48.5K Görüntüleme.  Université de Montréal. Bu kağıt amacı farklı beyaz yağ dokuları fareler toplamak, yağ örnekleri işlemek ve RNA ayıklamak için bir adım adım yordam sunmaktır.

Video: Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Nörobilim

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent pathways. Until recently, thermogenic adipocytes were considered a homogeneous population. However, recent studies have indicated that there are multiple subtypes or subpopulations that are distinct in developmental origin, substrate use, and transcriptome. Despite advances in single-cell genomics, unbiased decomposition of adipose tissues into cellular subtypes has been challenging because of the fragile nature of lipid-filled adipocytes. The protocol presented was developed to circumvent these obstacles by effective isolation of single nuclei from adipose tissue for downstream applications, including RNA sequencing. Cellular heterogeneity can then be analyzed by RNA sequencing and bioinformatic analyses.

This publication describes a protocol for the isolation of nuclei from mature adipocytes, purification by fluorescence-activated sorting, and single-cell level transcriptomics.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

Genetik

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Beyaz Adipositlerinin Transkriptom ve Epigenom Analizleri için İzolasyonu ve İşlenmesi

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

Murin Beyaz Adipositlerinin Transkriptom ve Epigenom Analizleri için İzolasyonu ve İşlenmesi

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of arthritis research, many studies are focused on inflamed joints that are composed of a complex mixture of bone, cartilage, muscle, stromal cells and immune cells. Here, we established a reliable and robust mechanical method to disrupt inflamed mouse paws into homogeneous pulverized samples in a cryogenically controlled environment. Protein and RNA lysates were processed to enable proteomic and transcriptional endpoints and molecular characterization of relevant disease pathways in local tissue.

A cryogenic pulverization method to process murine paws using a liquid nitrogen freezer mill was developed to improve the yield and quality of RNA or protein extracted from the tissues and enable the analysis of molecular profiles associated with inflammatory responses.

Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Biyoloji

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Tıp

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Murin Beyaz Adipositlerinin Transkriptom ve Epigenom Analizleri için İzolasyonu ve İşlenmesi

Murin Beyaz Adipositlerinin Transkriptom ve Epigenom Analizleri için İzolasyonu ve İşlenmesi

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning