Yazarlar, George Farr'a ve Horwich laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından desteklendi.

Burada farelerin anestezisi, ötanazisi ve kardiyak perfüzyonu için açıklanan işlemler Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kapsamında gerçekleştirildi.
1. RNase içermeyen Enstrümanların ve Çözümlerin Hazırlanması
<ol><li>RNase, tezgah üstleri, mikropipettes ve araştırmacı dahil olmak üzere tüm laboratuvar yüzeylerinin ortak bir kirleticisi.<ol>
<li>Eldivenleri sık sık değiştirin veya RNA'ları arındırıcı bir çözelti ile düzenli olarak silin.</li>
		<li>Paslanmaz çelik diseksiyon aletleri ve cam eşyalar, 1 saat veya daha uzun bir süre >200 °C'de ısıtılarak RNase içermeyen hale getirilebilir. Not: Buhar sterilizasyonu RNase'yi yok etmez. Alternatif olarak, bir RNase arındırıcı çözelti ile silin, ardından RNase içermeyen% 70 etanol ve hava kuru.</li>
		<li>Tezgah üstlerini, diğer laboratuvar yüzeylerini ve mikropipetörleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile, ardından RNase içermeyen% 70 etanol ile silin. RNA kurtarma ve analizi için belirli bir laboratuvar tezgahı veya çalışma alanı belirleyin. Not: Pipetlerin millerini silmeden önce uç ejektörlerini çıkarın ve mümkünse bırakın.</li>
		<li>Üretici tarafından RNase içermeyen olarak onaylanmış tüpler, mikrosantrifüj tüpler, pipetler ve mikropipette uçları kullanın. Çok düşük bağlayıcı uçların ve mikrotüplerin kullanılması önerilir. Mümkünse, bu bileşenlerin yeni açılmış kutularını veya torbalarını kullanın ve bunları genel laboratuvar kaynağından ayrı tutun.</li>
		<li>Ticari kaynaklardan RNase içermeyen çözümler [Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS (PBS), etanol, RNaz içermeyen %70 etanol] elde edin. Her deney için yeni açılan şişeleri kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Azure B boyasının kaynağı, bozulmamış RNA'nın başarılı bir şekilde kurtarılması için kritik öneme sahiptir. Değerli numuneleri boyamaya ve toplamaya adamadan önce her bir boya grubunu test edin. Deneyimsel olmayan bir hayvandan birkaç bin nöron toplayın, RNA hazırlayın ve 8,5'in üzerinde sürekli olarak RIN sayıları üreten bir tane bulmak için aşağıda açıklandığı gibi RNA bütünlüğünü belirleyin.<ol>
<li>Azure B boyayı (%1, wt/vol) RNase içermeyen %70 etanolde çözün, tipik olarak 50 ml santrifüj tüpünde 30 ml etanolde 0,3 g. Bir gecede RT'de veya tüm parçacıklar çözünene kadar bir rocker üzerinde iyice karıştırın. Bu çözeltinin bir tüpü, boyama yoğunluğunu etkilemeden birden fazla slaytı boyamak için kullanılabilir.</li>
		<li>Önlem olarak, her biyolojik kopya için farklı bir leke tüpü kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha fazla tedavi olmadan kordon bölümlerini gömmek için kriyooldları ve O.C.T.'yi kullanın.</li>
	<li>Kriyostatı -20 ila -24 °C'de sakla. Bölümleme işleminden sonra, yeterli sayıda hazırlanana kadar slaytları -80 °C dondurucuya yerleştirin. Slaytlar yapıldıktan sonra RNA hazırlığına en kısa sürede başlayın. Uzun süreli depolama için, slaytlar yerine, 80 °C'de bölümlenmemiş veya kısmen bölümlenmiş OCT bloklarını saklayın.</li>
	<li>RNA hazırlama kiti üreticisinin talimatlarına göre sağladığı çözümleri kullanarak, parçalanmış motor nöronlardan RNA hazırlığı için guanidin tiyosiyanat tamponunu yapın.</li>
</ol>2. Farelerden Omurilik Bölümlerinin Hazırlanması (Şekil 1A)
<ol><li>Tüm diseksiyon aletlerini, cam kaydırakları, jiletleri ve diseksiyon platformunu RNase dekontaminasyon çözeltisi ile pişirerek veya silerek temizleyin ve ardından RNase içermeyen% 70 etanol. 2 dakika kurulayın. Laboratuvar mendilleriyle kaplayarak her şeyi tozsuz tutun.</li>
	<li>Anestezi, kardiyak perfüzyon ve ötanazi de dahil olmak üzere hayvan elleçleme işlemleri, hayvanı omurilik diseksiyonu noktasına hızla getirmek amacıyla yerel kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinin (IACUC) gereksinimlerine göre yapılmalıdır.<ol>
<li>Ölümcül dozda Ketamin (450 mg/kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun.</li>
		<li>Derin bir anestezi seviyesi elde edildikten ve ayak parmağı sıkışması tepkisi eksikliği ile onaylandıktan sonra, fare ventral tarafını bir diseksiyon platformuna (örneğin bir strafor tahtası) yerleştirin, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs boşluğunu açın ve sol ventrikülün içine yerleştirilmiş bir infüzyonun 27 G kelebek iğnesini yerleştirin (araştırmacının sağındadır). Keskin bir forseps ile sağ kulakçıkları çalın ve peristaltik bir pompa kullanarak yaklaşık 2 dakika boyunca 5-7 ml / dk oranında PBS ile perfuse. Atriyumdan akan sıvı bu noktada büyük ölçüde kansız olmalıdır.</li>
		<li>Perfüzyon iğnesini çıkarın, farenin kafasını çıkarın ve diseksiyon tahtasında ters çevirin. Omuriliği açığa çıkarmak için cildi açın, omurları çıkarmak için küçük makas ve tokmak kullanın ve sinir köklerini keskin bir tokmaklarla keserken omuriliği çıkarın. Hız ve uygulama, perfüzyonun başlangıcından kablonun çıkarılmasına kadar hareket etmek için gereklidir; bu en fazla 7 dakika sürmelidir.</li>
		<li>Kalan kanı temizlemek için kabloyu RNase içermeyen suda 10 saniye durulayın. Omuriliği kavisli bir tokmakla RNase içermeyen bir cam kaydırağa çok nazikçe ama hızlı bir şekilde döşeyin. Temiz bir jilet kullanarak omuriliği enine 9-10 parçaya bölün.</li>
		<li>Parçaları aynı .C kullanarak O.C.T. ile dolu bir kriyoold içine yerleştirin ve temiz bir iğne kullanarak dikey olarak hizalayın. Kalıbı sıvı azotla önceden soğumuş 2 metilbütan içeren sığ bir tepsiye yerleştirin ve ardından RNA bozulmasını önlemek için omurilik parçalarını hızlı bir şekilde dondurmak için tepsiyi sıvı bir azot banyosuna koyun.</li>
		<li>OCT gömülü bloğu bölümlemeden önce 6 aya kadar -80 °C'de saklayın. RNA bütünlüğünü korumak için kablonun alınmasından donmaya kadar olan işlem 5 dakika içinde yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her biri 9-10 omurilik kesiti içeren 20 μm dilim üretmek için bir kriyostat ile -20 °C'de O.C.T.'ye gömülü bloğun, bölümlerin slayda yapışmasını sağlamak için başlangıçta oda sıcaklığında tutulan RNase içermeyen PEN-membran 2 μm slaytlarda kriyoeksiyon. Kriyostatın içindeki -20 °C'lik bir yüzeydeki bölümü hemen yeniden dondırın. Slaytları kullanılana kadar -80 °C'de tutun.</li>
</ol>3. Omurilik Bölümlerinin Lekelenerek Boyanmışlığı (Şekil 1A)
<ol><li>Temiz bir rafta altı adet 50 ml konik tüp yerleştirin. Hepsini 25-30 ml RNase içermeyen% 70 etanol ile doldurun, böylece slayt daldırıldığında derinlik slayttaki tüm bölümleri kaplamak için yeterlidir. Daha önce açıklandığı gibi 30-35 ml%1 Azure B çözümü yapın ve yıkama veya boyama sırasında değişen çözümler arasındaki süreyi en aza indirmek için aynı rafta tutun. Ekstra çözeltiyi hızlı bir şekilde boşaltmak için rafın önünde üç veya dört laboratuvar mendili bulundurun.</li>
	<li>-80 °C dondurucudaki slaytları kuru buza alın. Bir kaydırağı eldivenli bir avuç içine yerleştirerek çözün. Slayttaki nem ve yoğuşmaların çoğunu laboratuvar silme ile silerek, bölümlere dokunmamaya dikkat ederek çıkarın. Slaydı tamamen kurumak için 30-40 sn petri kabına taze silika jel kurutucu üzerine koyun. Laboratuvar nemi yüksekse, kaydırağı daha hızlı kurutmak için vakum dessicator'da kısa bir işlem yapılabilir.</li>
	<li>Yıkama ve lekeleme.<ol>
<li>Kurutulmuş kaydırağı RNase içermeyen ilk tüpe% 70 etanol batırın. Slaydı 30 saniye bekletin, ardından 45-60 sn boyunca yukarı ve aşağı daldırarak OCT'yi çıkarmak için slaydı yıkayın. Kaydırağı çözeltiden alın ve laboratuvar mendillerindeki fazla sıvıyı boşaltın. Slaydı% 70 etanol ikinci tüpe batırarak aynı işlemi tekrarlayın. Omurilik bölümlerinin etrafındaki OCT tamamen gitmiş değilse, üçüncü tüpteki yıkamayı tekrarlayın.</li>
		<li>Fazla sıvıyı boşalttıktan sonra, slaydı %1 Azure B çözümüne %70 RNase içermeyen etanolde 30-45 saniye batırın. Laboratuvar silme işleminde fazla Azure B'nin suyunu boşaltın; bu noktada, tüm slayt mavi olacaktır.</li>
		<li>Slaytı bir sonraki %70 etanol tüpüne batırın ve fazla boyayı gidermek ve spesifik motor nöron lekelerini görünür hale getirmek için hızlı bir şekilde 3-4x aşağı ve yukarı daldırın. Bölümler çok koyu lekeli görünüyorsa, % 70 etanol taze bir tüpte destaining adımını tekrarlayın. Boyama çok hafif görünüyorsa, slaydı 30 saniye daha Azure B çözümüne döndürün ve yinelenenleri yok etmeyi yineleyin. Fazla etanol silin ve tüm sıvı gidene kadar kaydırağı ~40 saniye kurutun. Gri madde açık mavi olacak, oysa motor nöronlar kolayca görülebilen koyu maviye boyanacak. Diseksiyona hemen başlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lazer Yakalama Mikrodisksiyonu (LMD) (Şekil 1B)
<ol><li>Mikroskobu açın ve numune toplama için 0,6 ml'lik bir mikrofuge tüpünün kapağını takmak için tüp tutucuyu boşaltın. 0,6 ml'lik bir mikrofuge tüpünün kapağına 30 μl guanidin tiyosiyanat lizis tamponu koyun. Çözeltiyi pipet ucu kullanarak yayarak kapağın yüzeyini sıvı ile örtün. Bu şekilde, toplanan tüm nöronlar parçalandıkça çözünür hale gelecektir. Kapağı delik ve hedefle mikroskop yazılımıyla hizalayın. Lazer yakalamaya başlayana kadar kapağı kapalı konumda tutun.</li>
	<li>Hava kurutulmuş kaydırağı LMD mikroskobun aşamasına baş aşağı yerleştirin, böylece PEN'in zarı aşağı doğru kayar. Bölümleri olan membran, altında toplama tüpü olan deliğe bakmalıdır.</li>
	<li>Slayt hazırlığına başlamadan önce lazeri 10 dakika açın. 5X hedefi olan bir omurilik bölümüne odaklanın. Diseksiyon için 20X hedefine geçin.<ol>
<li>Hafif kalemle bir "kukla" bölgeyi işaretleyin ve lazerin toplamadan kesmesine izin verin. Bu, PEN zarını rahatlatır ve birden fazla bölgeyi art arda işaretlemeyi ve kesmeyi mümkün kılar.</li>
		<li>Ventral korna bölgesindeki motor nöronlara yeniden odaklanın ve tanımlayın. Bu nöronlar konumları, piramidal morfolojileri, büyük boyutları ve Azure B ile koyu mavi boyamaları ile tanınabilir (Şekil 2).</li>
		<li>Hafif kalemi kullanarak, çizim aracını seçin ve motor nöronların kenarı boyunca işaretleyin ve tam bir anahat çizin. Motor nöron dışındaki hücrelerden bulaşmayı önlemek için anahattı motor nörona mümkün olduğunca yakın hale getirmeye çalışın. (Lazer kesim hattının ne kadar geniş olduğunu görmek ve boşluğu gerektiği gibi ayarlamak için önceden bazı bölümleri test edin.) Kesmeden önce birden çok hücreyi işaretleyin; yazılım pozisyonları hatırlayacaktır.</li>
		<li>Kapak konumuna tıklayarak kapağı kesme konumunun altına getirin. Lazerle motor nöron diseksiyonu başlatmak için başlat düğmesine tıklayın. Tüm motor nöronları bir slayttaki tüm bölümlerden bir mikrofuge tüpünün kapağına toplayın.</li>
		<li>Toplama tamamlandıktan sonra, tepsiyi boşaltarak ve tüpü hafifçe yerinden çıkararak mikrofüzyon tüpünü tutucudan alın. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleme ile tampondaki motor nöronları tamamen çözün. Çözeltiyi 4 °C'de 2 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyarak tüpün gövdesine taşıyın. Numuneyi kuru buzda hemen dondurun ve -80 °C'de saklayın. Bu işlem, slayt boyamadan motor nöron koleksiyonuna kadar, RNA bozulmasını en aza indirmek için bir slayt için 30 dakika içinde yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Motor Nöronlardan RNA Hazırlama
Toplanan tüm nöronları bir hayvandan çözün ve RNA çıkarmak için bir araya toplayın. Örnekler, içlerindeki motor nöronların sayısına (Azure B ile lekelenmiş) bağlı olarak soluk mavi görünebilir. LMD doku için sağlanan protokole göre uygun bir kit kullanarak RNA çıkarın, mümkün olan minimum hacimde elde edin. Numunenin miktarını ve bütünlüğünü kontrol etmek için 1 μl alın. Kalan RNA'yı kuru buzda hızlı dondurun ve -80 °C'de saklayın.
6. RNA Kalite ve Miktarının Belirlenmesi
Üreticinin protokolüne göre kılcal elektroforez mikroakışkan çipi üzerindeki 1 μl numune ile RNA kalitesini belirleyin. RNA-seq ve qRT-PCR için 8,5'in üzerinde bir RNA Bütünlük Numarası (RIN) içeren toplam RNA preparatları kullanılabilir. Veri çıktısı genellikle örneğin yaklaşık konsantrasyonu da içerir.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Omurilik dilimlerinin lazer mikroseksiyonu ile toplam RNA üretimi için bu protokolün en önemli başarı ölçüsü RIN değeri5 'tir. Daha yüksek ökaryotlardan alınan RNA örnekleri için, 8,5'in üzerindeki değerler düzenli olarak yüksek kaliteli sıralama ve qRT-PCR verileri verir. Verim düşük ancak kalite yüksekse, hazırlığı tekrarlayın. Bütünlük daha düşükse (hatta 7,5-8), ancak sorunun kaynağını bulmak ve yeniden denemek daha iyidir. Bir şeylerin ters gidebileceği birçok adım vardır, ancak gerçekten sorunun sadece iki kaynağı - endojen RNaz kontaminasyonu veya eksojen RNaz kontaminasyonu. Birincisi pratikle ele alınabilir, böylece farenin fedakârlıktan O.C.T gömülü kablosunu dondurmaya kadar geçen süre en aza indirilebilir. Protokolde endojen RNaze'nin zayıf bir sonuca katkıda bulunabileceği diğer nokta dilimlerin hazırlanması sırasındadır. Her dilim bir oda sıcaklığı PEN kaydırağını hızlı bir şekilde yapışmalıdır, ancak eriyecektir (O.C.T netleşir). Dilim ne kadar hızlı yeniden refrozen edilebilirse o kadar iyi. Kullandığımız kriyostat, odanın içinde -20 °C'de olan ve dilimi hızlı bir şekilde yeniden dondurmak için kullandığımız düz yüzeylere sahiptir. Kullanılan kriyostatta benzer bir nokta bulun ve dilimin tekrar hızlı bir şekilde opak hale geldiğinden emin olun.
Eksojen RNaz kaynaklarının izini sürmek zor olabilir, çünkü çok fazla olasılık vardır. Açıkça RNase içermeyen kullanılan tek reaktifler O.C.T. ve Azure B'dir. Azure B daha önce tatmin edici bir performans sergilediyse, bu reaktif hiçbir zaman sorun olmasa da, yeni bir O.C.T. şişesi deneyin. RNase içermeyen reaktifler, farklı bir tedarikçiden bile değiştirilebilir. Çok daha olası bir kaynak araştırmacı. Çalışma alanının kapsamlı bir şekilde temizlenmesine ek olarak, genellikle başka bir laboratuvar üyesinin prosedürdeki tüm adımları takip etmesi ve gözlemlemesi yararlıdır. Bu rutin olarak bu işlemi yapmayan biri olsa bile, yeni bir göz kümesi fark edilmeyen bir kirlenme kaynağı alabilir.
Bu protokolün RNA'yı diğer omurilik hücrelerinden, diğer türlerden omurilik hücrelerinden veya diğer organlardaki belirli hücre türlerinden kurtarmaya kadar uzatmak, endojen RNaz'ın etkisini ortadan alırken veya en azından en aza indirirken ilgi çekici hücrelerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için çeşitli alanlarda değişiklikler gerektirecektir. Buradaki protokolde, kablonun hızlı bir şekilde çıkarılması ve dondurulması, %70 etanolde Azure B boyama ile birleştiğinde, hem RNA bozulmasının en aza indirilmesine hem de motor nöron hücre gövdelerinin kolay tanımlanmasına izin verildi. Azure B, RNA3'e bağlanıyor gibi görünen nöronlar için iyi kurulmuş bir histokimyasal lekedir ve nörodejeneratif hastalığı olan hastalardan beyin dokusunun otopsi örneklerinde nöronların RNA içeriğini değerlendirmek için kullanılmıştır6. Özellikle, Azure B boyama, saflaştırılmış RNA'nın bütünlüğünü veya ters yazıp çözümlenme yeteneğini etkilemedi. Benzer LMD protokollerinde cresyl violet7 ve toluidine blue8 gibi diğer boyalar kullanılmıştır. Hücre cisimlerinin parçalanırken doğrudan guanidin tiyosiyanat çözeltisine toplanması, sağlam RNA'nın rutin olarak iyileşmesiyle sonuçlanan son adımı sağladı.
Diğer hücreler ve organlar için de benzer yaklaşımlar öngörülebilir, endojen RNa'lar tarafından RNA bozulmasını en aza indirirken veya tercihen önlerken ilgi çekici hücreleri tanımlamanın başarılı analiz için kritik gereklilik olduğunu kabul etmek. Pankreas gibi yüksek RNas seviyelerine sahip dokularda, hızlı kullanım ve düşük sıcaklık, görselleştirme için doğal otofluoresanslarından yararlanarak RNA'nın β hücrelerden geri kazanılmasına izin vermek için birleştirilmiştir9. Tanımlama için antikor lekeleme kullanan prosedürler de bildirilmiştir10, ancak elimizde tam olarak başarılı olmamıştır. Son olarak, LMD mikroskoptaki doku bölümlerinde tanımlamak için kullanılabilecek ilgi çekici hücrelerde floresan füzyon proteinlerini(örneğin GFP, YFP, RFP) ifade eden birçok fare modeli mevcuttur. Aslında, bu protokolle analiz ettiğimiz fare suşları SOD1 ve YFP11arasında bir füzyon proteinini ifade eder ve omurilik motor nöronları oldukça floresandır. Bununla birlikte, O.C.T.'yi aynı anda ortadan kaldıracak, RNaz aktivitesini engelleyecek ve motor nöronların görselleştirilmesine ve LMD tarafından iyileşmesine izin verecek kadar YFP floresanını sürekli olarak koruyacak bir dizi etanol yıkama ve / veya dehidrasyon durumu bulamadık. Belki de bu sınırlamayı aşmak için yeni bir floresan protein veya organik çözücülerde floresan koruyan mevcut proteinlerin bir varyantı bulunabilir.

Birden fazla farklı hücre tipinden oluşan memeli dokularında, lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LMD) enstrümantasyonunun ortaya çıkması, RNA veya protein düzeyinde analiz için belirli bir hücre tipi seçme imkanına sahiptir. Şu anda, amplifikasyon ve yeni nesil sıralama teknikleri, RNA'ların göreli seviyelerinin değerlendirilmesi ve çeşitli ekli formların tanımlanması da dahil olmak üzere transkriptomun nispeten kapsamlı bir envanterini elde etmek için birkaç bin hücreden toplam RNA havuzunun kullanılmasını sağlar. Bugüne kadar, birkaç bin hücrenin proteomik analizleri sadece daha bol türler aracılığıyla uzanacaktır. Örneğin, 3.000-4.000 motor nöron hücre gövdesinden (gösterilmeyen) en bol proteinlerin 1.000'< tespit ettik ve Zhu ve iş arkadaşları yakın zamanda ~15.000 tümör hücresinden 2.665 protein tanımladık1. Bununla birlikte, kütle spektrometresinin daha fazla gelişmesiyle, bu tür analizlerin çok daha derinliğe uzanması muhtemeldir.
Burada, farelerin omuriliklerinden motor nöron hücre cisimlerinin LMD'si için kullanılan özel bir protokol ve ardından RNA hazırlanması sunuyoruz. Bu protokol, presemptomatik transgenik mutant süperoksit dismutaz (SOD)1 amyotrofik lateral skleroz (ALS) farelerinin motor nöronlarından RNA'ları hem RNA-seq hem de qRT-PCR doğrulama2ile vahşi tip SOD1 transgenik suşundan hazırlanan RNA'larla karşılaştırma bağlamında kullanılmıştır. Özellikle, omurilikteki gri maddenin ön boynuzundaki motor nöronlar, astrosit denizi ile çevrili toplam hücre popülasyonunun% <10'unu oluşturur ve bu nedenle transkripsiyonal profilleri tüm kordonun çalışmalarından kolayca arındırılamaz. Lazer yakalama yaklaşımı, bu hücrelerdeki RNA ekspresyonunu analiz etmek için idealdir, fizyoloji kısa intra kardiyak salin perfüzyonunu takiben kordonu hızla çıkararak ve dondurarak korunur. Motor nöron somata büyüktür ve bu nedenle kolayca tespit edilebilir, burada nöronlar için güçlü bir benzeşime sahip bir boya kullanarak3. Ek olarak, bu boyutta, bu hücreler yakalanan hücre başına nispeten büyük miktarda RNA sağlar. Kullanılan prosedür, aşağıda ayrıntılı olarak açık olarak açıklanmış olduğu gibi, diğer nöronal hücre tiplerinin yanı sıra, özellikle boya boyama teknikleri veya antikor boyama ile tanımlanan diğer hücre tiplerini elde etmek için kolayca ayarlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

İlgi çekici hücrelerden yüksek kaliteli RNA hazırlanması, hücre tipleri arasındaki transkripsiyon farklılıklarının veya sağlık ve hastalıkta aynı hücre tipi arasında veya farmakolojik tedavileri takiben kesin ve anlamlı bir analiz için kritik öneme sahiptir. Omurilikte, birçok nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkta ilgi çekici olan motor nöronlardan böyle bir hazırlık, motor nöronların toplam hücre popülasyonunun% <10'unu temsil etmesi nedeniyle karmaşıktır. Lazer yakalama mikrodisksiyonu (LMD) bu sorunu gidermek için geliştirilmiştir. Burada, endojen ve eksojen RNazların RNA hasarını önlemek için fare omuriliğini hızlı bir şekilde kurtarmak, dondurmak ve bölümlemek için bir protokol açıklıyoruz, ardından endojen RNaz'ı inhibe ederken motor nöronları tanımlamak için % 70 etanolde Azure B ile boyama. LMD daha sonra boyalı nöronları doğrudan guanidin tiyosiyanat lizis tamponuna yakalamak ve RNA bütünlüğünü korumak için kullanılır. Toplam RNA'yı kurtarmak ve bütünlüğünü ölçmek için standart teknikler kullanılır. Bu malzeme daha sonra transkriptlerin RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Yukarıda ve Şekil 1'de özetlenen protokol, yaklaşık 20 PEN kaydırakta 9-10 20 μm dilimden incelenen 3.000-4.000 omurilik motoru nöron hücre gövdesinden 8,5 > RIN ile toplam RNA'nın 50 ng veya daha fazlasını üretmelidir. Bu sayıda slayt, fare omuriliğinin O.C.T. gömülü bloğunun% 10'undan daha azını temsil ettiği için, -80 ° C'de depolanan bloğa geri dönmek ve başka bir RNA hazırlığı turundan geçmek için daha fazla dilim kesmek mümkündür. Bir analiz için daha fazla miktarda RNA gerekiyorsa, birkaç gün içinde diseksiyon ve RNA hazırlığı yoluyla işlenebilen bir seferde yalnızca slayt sayısını(örneğin 20) yapmak, ardından ikinci bir tur için daha fazla slayt yapmak ve ürünleri birleştirmek daha iyidir. İyi bir hazırlık ile kötü bir birleştirmekten kaçınmak için önce her preparatın RIN'ini kontrol etmeyi unutmayın. RNA-seq yöntemleri daha hassas hale geliyor ve yeni PCR teknolojileri mevcut teknolojilerden daha yüksek hassasiyet vaat ediyor. Bu nedenle, daha az nöron hücre gövdesinden daha az RNA gerekecek ve bu da daha fazla sıralama derinliği ve ilginç vuruşların daha kapsamlı bir şekilde doğrulanmasına izin verecektir. Öte yandan, qRT-PCR analizi ve doğrulama4 için MIQE önerilerine tam bağlılık, düşük bolluklu RNA'lar için gerekli kontrol reaksiyonlarına izin vermek için daha büyük miktarlarda gerektirebilir.
Şekil 2, Azure B boyama ve diseksiyondan sonra omurilik ventral boynuz bölümünün bir bölümünün tipik bir dizi görüntüsü gösterir. Panel A'da, büyük, koyu lekeli hücre gövdeleri, anti-Chat antikor boyama2ile onaylanan motor nöronlardır ve daha küçük komşu hücrelerden kolayca ayırt edilir. Panel B, aynı bölgeyi hafif kalemle özetlenen ve mikroskop yazılımı tarafından numaralandırılan tek tek hücre gövdeleriyle gösterir. Anahatlar, lazerin kesme genişliği için küçük bir izinle hücre gövdelerinin kenar boşluklarını yakından takip eder. Bu aralık, motor nöron sitozol kaybını önlerken yabancı malzemenin dahil edilmesini en aza indirmek için her lazer güç ayarı için belirlenmalıdır. C ve D panelleri lazer kesildikten ve tek tek hücre gövdeleri toplama kapağına düştükten sonraki bölümü gösterir. Kesme kenar boşluğunun C panelinde hafif kalem anahattını tam olarak izlemediğine, ancak büyük ölçüde bunun dışında kaldığına dikkat edin. Bu düzensizlik, lazerin neden olduğu dokuya verilen ısı hasarını yansıtan her kesimin etrafındaki karartılmış alan gibi D panelinde de belirgindir. Bu nedenle, iki hücre gövdesi birbirine çok yakınsa, onları ayrı ayrı kesmeye çalışmak ve yakın temas bölgelerinde ısı hasarı için biraz RNA kaybetmek yerine, tek bir kesim için ana hatlarıyla belirlemek daha iyidir.
Şekil 3, LMD tarafından toplanan ~4.000 fare motoru nöron hücre gövdesinden hazırlanan bir RNA örneğinin RNA bütünlüğünün elektroforetik analizinin tipik sonuçlarını göstermektedir. Üst panel, toplam RNA'nın 1 μl'si tarafından üretilen elektroferogramdır; sağdaki içe jelin bir görüntüsüdür. Her ikisinde de, belirgin ribozomal RNA zirvelerine dikkat edin. Alt panel, RNA boyut standartlarını içeren şeridin elektroferogramıdır. Analiz yazılımı, bu örnek için 4.9 ng/μl konsantrasyonda 9.8 RIN hesapladı. Bu çözeltinin toplam 13 μl'si analizden sonra mevcuttu ve transkript miktarlarının aşağı akış qRT-PCR doğrulaması için 64 ng RNA sağladı. Orta derecede bol transkriptlerin tipik bir qRT-PCR analizi için, toplam RNA'nın 0.15-0.20 ng'si doğru miktar2üretmek için yeterlidir, bu nedenle bu preparattan elde edilen RNA miktarı, önerilen4. Tabii ki, nadir transkriptlerin doğrulanmasına izin vermek için daha büyük miktarlarda giriş RNA'sı kullanılabilir. Bu miktar, kütüphane hazırlığına ve yeni nesil RNA-seq'e izin vermek için de fazladır.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Şekil 1. Omurilik dilimi üretimine genel bakış ve omurilik motor nöron hücre vücutlarının lazerle mikroseksiyonu. A)Dilim üretimi ve boyamada önemli adımlar. B)Omurilik bölümü ve lazer diseksiyonunun karikatür görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Şekil 2. Azure B lekeli motor nöron hücre gövdelerinin lazer diseksiyonunun öncesi ve sonrası görüntüleri. A)Lekeli bir bölümün ventral boynuzun bir kısmı. Dört büyük, koyu lekeli hücreye dikkat edin. Ayrıca, motor nöron olmayan (Anti-Chat antikor boyama ile doğrulanan; gösterilmeyen, ancak bkz. Bandyopadhyay2)ve diseksiyon için seçilmeyecek birkaç hafif lekeli ve biraz daha küçük hücreler vardır. Birçok küçük, karanlık nokta muhtemelen nöronal süreçlerdir (dendritler ve aksonlar), ancak bu doğrulanmadı. B) Işık kalemi ile özetlenen dört hücre gövdesi. Anahatların, aralarında minimum mesafe olacak şekilde hücrelerin kenar boşluklarını yakından izlediğini unutmayın. Bu aralık her mikroskop ve lazer için ampirik olarak kurulmalıdır. Yazılım, kaç kişinin toplandığını takip eden tek tek nöronları numaralandırır. C ve D) Lazer kesildikten ve hücre gövdelerini içeren parçalar toplama kapağına düştükten sonra. Geride kalan deliğin anahattan biraz daha büyük olduğunu ve düzensiz olduğunu unutmayın. Bu, lazer ışınının genişliğini ve dokunun yerel bileşimine bağlı olarak hafif değişken kesme verimliliğini yansıtır. Ayrıca lazerin neden olduğu lokal ısıtma hasarı nedeniyle her deliği çevreleyen koyulaşmış dokunun kenarı da belirgindir. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Şekil 3. LMD örneklerinden hazırlanan RNA'nın bütünlüğünün elektroforetik analizi. A)Yukarıdaki protokolle ~4.000 motor nöron hücre gövdesinden hazırlanan RNA'nın 1 μl aliquot'ı mikroakışkan çip üzerinde mikrokapcal elektroforez ile analiz edildi. Elektroferogram, belirgin ribozomal RNA zirveleri ile gösterilir. Sağda jelin kendisinin bir görüntüsü vardır. B) Boyut standartlarının elektroferogramı, ilgili jel şeridi sağda olacak şekilde gösterilir. Cihaz yazılımı bu örnek için 9.8 RIN ve 4.9 ng / μl konsantrasyon <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">hesapladı.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection at JoVE.com

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

production-rna-for-transcriptomic-analysis-from-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K Görüntüleme.  Yale School of Medicine. Yüksek kaliteli toplam RNA, %70 etanolde Azure B ile omurilik bölümlerini lekelendikten sonra lazer yakalama mikroseksiyonu ile fare omurilik motoru nöronlarının hücre gövdelerinden hazırlanmıştır. RNA-seq ve qRT-PCR tarafından aşağı akış RNA analizine izin vermek için 3.000-4.000 motor nörondan yeterli RNA (~40-60 ng) elde edilir.

Video: Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Omurilik Stimülasyonuna Motor Nöron Yanıtlarını Anlama

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Yazar Spotlight: Omurilik Stimülasyonunu İlerletmek - Yama-Kelepçe Elektrofizyolojisi Yoluyla Motor Nöronların Hücresel Tepkilerini Keşfetmek 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Spinal Kord Stimülasyonu Sırasında Motor Nöronlarda Tüm Hücre Yama-Klemp Kaydı için Omurilik Diliminin Ex vivo Hazırlanması

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...