Bu yöntem, çeviriaraştırma alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin dolaşan biyobelirteçler ile hasta prognozu arasındaki ilişki gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük miktarda giriş materyali ile kolay ve güvenilir bir metodoloji ile dolaşan biyobelirteçlerden oluşan bir panelin ekspresyonunu değerlendirme şansıdır. Bu tekniğin etkileri kanser hastalarının tedavisine kadar uzanır, çünkü hastaların karar verme ve tedavi takibinde yararlı olan dolaşan biyobelirteçleri belirleyebilir.
Ayrıca, bu yöntem biyobelirteçanalizi dolaşan içine fikir sağlayabilir. Ayrıca hastalığın moleküler karakterizasyonu için doku biyomarker ekspresyon analizi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Çıkarma adımlarını öğrenmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir.
Başlamak için, plazma örneğinin 400 mikrolitresini RNase içermeyen, iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, tüpe 400 mikrolitre denaturing çözeltisi ekleyin. Bir-nanomolar spike-in dört mikrolitre ekleyin.
Çözeltiyi karıştırdıktan sonra 800 mikrolitre asit fenol-kloroform ekleyin. 60 saniye boyunca çözeltiyi girdap ve maksimum hızda 15 dakika santrifüj. Daha sonra, üst sulu fazda bulunan lysate'yi temiz bir tüpe aktarın ve interfazı bozmamaya özen gösteriyor.
Kurtarılan sulu fazın hacmini ölçün ve lysate'ye 1/3 hacim etanol ekleyin. Ardından, filtre kartuşu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Etanol-lysate karışımının 700 mikrolitreye kadarını filtre kartuşuna aktarın.
Filtre kartuşu 10,000 kat yerçekiminde 30 saniye santrifüj edin. Ardından, akış yoluyla toplam hacmini ölçün. Sonra, filtrat etanol hacminin 2/3 ekleyin ve iyice karıştırın.
Yeni bir toplama tüpüne ikinci bir filtre kartuşu yerleştirin. Ardından, numunenin 700 mikrolitrekadarını kartuşa aktarın ve akış tan zindanetmeden önce 30 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde santrifüj yapın. Filtre kartuşu için 700 mikrolitre mikrorna yıkama çözeltisi ekleyin ve 15 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde bir toplama tüpüyle santrifüj edin.
Akış tan atın ve filtre kartuşu'nu aynı tüpe geri koyun. Bundan sonra, filtre kartuşu yeni bir toplama tüpüne taşıyın. Ardından, kartuşa önceden ısıtılmış elüsyon çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.
MikroRNA'ları kurtarmak için filtre kartuşu 30 saniye boyunca 10.000 kat yerçekiminde santrifüj edin. Metin protokolüne göre poliadenilasyon reaksiyonkarışımı kokteylini hazırlayın. Numunenin iki mikrolitresini bir reaksiyon plakasının her kuyuya aktarın.
Sonra, her kuyuya reaksiyon kokteylinin üç mikrolitresini ekleyin. Girdap ve kısa bir süre içeriğini aşağı spin plaka santrifüj. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı izleyin.
Bir santrifüj tüp içinde ligasyon reaksiyon karışımı kokteyl hazırlayın. Daha sonra, reaksiyon plakaher kuyuya kokteyl 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, bir dakika için bir shaker üzerinde reaksiyon plaka içeriğini karıştırın, 900 rpm, plaka kısa bir santrifüj izledi.
Bundan sonra, reaksiyon plakasını bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı uygulayın. Ters transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirmek için, metin protokolüne göre bir santrifüj tüpünde reaksiyon karışımını hazırlayın. Daha sonra, ligasyon ürünü içeren plakaher kuyuya karışımı 15 mikrolitre ekleyin.
Bir dakika için 1, 900 rpm bir shaker üzerinde plaka içeriğini karıştırın, plaka kısa bir santrifüj ardından. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen yordamı izleyin. Daha sonra miR-Amp reaksiyon karışımını hazırlayın ve yeni bir reaksiyon plakasının her kuyuya 45 mikrolitre karışımı ekleyin.
Bundan sonra, reaksiyon plakasının her kuyuya BEŞ mikrolitre RT ürünü ekleyin. Bir dakika için 1, 900 rpm bir shaker üzerinde plaka karıştırın, plaka kısa bir santrifüj ardından. Ardından, plakayı bir termal döngüye yerleştirin ve metin protokolünün tablo birinde özetlenen yordamı izleyin.
İlk olarak, TE tampon her cDNA örnek seyreltmek. Daha sonra, bir santrifüj tüp IÇINDE PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. hacmin %10'u fazla dır.
Plakanın her kuyusu için reaksiyon karışımının 19 mikrolitresini aktarın. Plakayı kapatın ve kısa bir süre santrifüj edin. Son olarak, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi, bir RT-PCR sisteminde termal protokolü gerçekleştirin.
Bu vaka serisinin tüm plazma örneklerine eklenecek en iyi konsantrasyonun hangisi olduğunu seçmek için başak kontrolüseri seyreltmeleri yapıldı. Bu protokol sayesinde her hastadaki tüm biyobelirteçlerin yanı sıra genel vaka serisinde tek bir biyomarker in değerlendirilmesi mümkün oldu. Bu protokolde, kemoterapi rejimi ile tedavi edilen kolorektal kanserli hastalarda progresyonsuz sağkalım, genel sağkalım ve objektif yanıt oranı ile ilgili anjiyogeneze bağlı sirkülasyon miRNA'lardan oluşan bir panel analiz edildi.
MiRNA'nın ekspresyon düzeyleri ile ilk klinik değerlendirme arasında karşılaştırıldığında has-miR-155-5p'de artış gözlendi. Bu artış daha kısa PFS ve Os ile ilişkiliydi. Bu yordamı çalışırken, bir duman başlık altında fenol-kloroform kullanarak adımları gerçekleştirmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, dolaşımdaki proteinlerin izolasyonu ve analizi veya kodlama RNA'ları gibi diğer yöntemler, dolaşan biyobelirteçlerden oluşan daha kapsamlı bir panelin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Bu teknik, gelişiminden sonra sıvı biyopsi alanında araştırmacıların kanser hastalarında dolaşan biyobelirteçlerin ekspresyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır. Kan ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar kaplaması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
