Bu çalışma Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale tarafından desteklenen, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, Hopital de Strasbourg, pour la Recherche Derneği sur le Kanser, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche ve Bölge Alsace. Pietro LaNeve la Recherche Médicale Fondation tarafından dökün desteklenmiştir. Şu anda, o bir Istituto Italiano Tecnologia (İİT) bursu bir alıcı. Yayın maliyetleri Neurex ağı tarafından desteklenmektedir (TriNeuron - Program İnterreg IV Yukarı Ren)

1. Numune Toplama <ol><li> Pipetleme yarı yapışık Schneider&#39;in 2 hücreleri, (ortalama 1-5 x 10 6 hücre), ayırmak ve santrifüj (1 dakika için 100 xg) hasat. In vitro kültürlenmiş hücrelere yapışık durumunda, standart koşullarda bunları trypsinize veya doğrudan bir hücre kazıyıcı yardımı ile, RNA ekstraksiyon reaktifi için uygun bir miktar içine levhalardan toplarlar. </li><li> Embriyo toplanması için, sinek kafeslerde Drosophila suşları büyümeye ve izin embriyolar yumurta döşeme plakaları üzerinde birikir. Damıtılmış su içinde bir fırça (dH 2 O) embriyolar siliniz, elek filtreleme tarafından enkaz atmak yıkayınız ve bir şişe 48 embriyolar kurtarmak. </li><li> Bir diğer yöntem olarak, elle dokular / organlar teşrih. Vis gibi diseksiyon iğneler veya forseps kullanılarak, bir stereo mikroskop (20 X büyütme) altında, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde, Drosophila karın testisler (piRNA analizi için tercih edilen bir sistem) yalıtmakSullivan ve arkadaşları 49 ayırd. </li><li> Pestle RNA ekstraksiyon reaktifi 0.5 hacim bağımlılığı üzerine örnekleri homojenize. </li></ol> 2. RNA Ekstraksiyon / Analiz <ol><li> Aşağıdaki Üreticilerin talimatları ticari reaktif ile RNA izolasyonu gerçekleştirmek. DİKKAT! RNA ekstraksiyon ajanlar genellikle zehirli ve yakıcı vardır. Alternatif bir şekilde, RNA izolasyonu için bir 50 Proteinaz K tabanlı bir protokol uygulanır: <ol><li> Durdurma Mix 400 ul numune içine seyreltilir ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Kloroform: izoamil alkol ve kloroform ekstraksiyonu ve etanol (EtOH) çöktürme / yıkama, standart fenol suda çözülebilen komponentlerin reküperasyonu. Hava örnekleri kuru ve dietilpirokarbonat (DEPC) içine tekrar süspansiyon çift (dd) H 2 O damıtılmış -lı </li></ol></li><li> UV spektrofotometrik ölçümü ile RNA konsantrasyonu değerlendirin. Ayrıca, RNA saflık 2.0 civarındadır, yüksek bas sağlamakA 260 üzerindeki ed / A 280 okuma. </li><li> Aşağıdaki gibi agaroz jeli denatüre edici RNA, hazırlık Kontrol <ol><li> Bir temiz bir beher içinde, sürekli karıştırma altında, DEPC ile GKD 2 O 82 ml, 1.2 g Agaroz çözülür. Tamamen eriyene kadar kaynatın. </li><li> Jel solüsyon soğumaya bırakın; sıcaklığı 60 ° 10X 4-morfolinpropansülfonik asit 10 ml eklemek C ulaştığında (MOPS) 1X son konsantrasyonda (YP) için tampon, ve 8 ml 3 formaldehit% 37% FC. DİKKAT! Formaldehit kanserojen. </li><li> Yatay elektroporez hücresine jel dökün. Jel en az 1 saat boyunca bir başlık altında katılaşması için izin verin. Katılaşma sonrasında, MOPS 1X içine jel daldırın. </li><li> Tümbölen RNA numunesinin 2 mikrogram ve Ladder 1 mikrogram (doğru değerlendirilmesi istendiğinde bir RNA işaretleyici kullanın). RNA agaroz yükleme boyası (ALD) 3 cilt ve Ladder&#39;a. Sıcaklık 70 ° C&#39;de 5 dakika boyunca buz üzerinde ve hemen serin. CAKatkı! ALD İçeriği (etidyum bromür ve formamiddir, Malzeme bakınız) sırasıyla, mutajen ve aşındırıcı. </li><li> Örnekleri yükleyin ve arada tampon geri dönüşümü ile yaklaşık 1 saat boyunca 50 V de jel çalıştırın. UV görselleştirme veya jel görüntüleme ile RNA fraksiyon desenini kontrol edin. 28S ve 18S rRNA ve tRNAs tekabül eden somut bantları tanır (Şekil 1). </li></ol></li><li> -80 ° C&#39;de Kuzey Testi veya saklamak RNA devam edin. </li></ol> 3. denatüre Akrilamid Jel Hazırlanması <ol><li> Bu bölme aşamasında için küçük bir dikey elektroforetik cihazı (plaka boyutu yaklaşık 8 cm x 9 cm, tarak kalınlığı 0,75 mm) kullanın. </li><li> Bir döküm çerçeve içinde birbirine temiz gözlük birleştirin. </li><li> (19: 1), MOPS 1X çözelti, 7 M üre,% 10 akrilamid / bis-akrilamid, 10 ml hazırlayın. Dökümden hemen önce,% 10 amonyum persülfat ve TEMED 100 ul, 10 ul ve süratli bir şekilde karıştırın. DİKKAT! Akrilamid nörotoksik ve kanserojendir. </li><li> Cam plakalar arasındaki jel dökün ve kabarcıkları önlemek için dikkatli iyi tarak yerleştirin. Jel, kullanılmadan önce en az 45 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize edelim. Alternatif olarak, jel O / N, su ile ıslatılmış filtre kağıdı ile sarılmış ve saran sargısına kapalı olarak muhafaza edilebilmesi. </li></ol> 4. Numune Hazırlama <ol><li> 0,5-20 kısım her numune için toplam RNA&#39;nın ug. 3-4 ul hacim aşarsa, vakum örnek kurutun. </li><li> Boyut tayini için bir belirteç olarak (hazırlanması için, Bölüm 4.3 ve 4.4), örnekler paralel radyo-etiketli düşük frekans merdivenin bir kısım (20-30 cps) çalıştırın. Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi, örnekler paralel olarak işleme tabi tutmaktadır. </li><li> Merdiven: 10 bp-merdivene 0.1 ug kullanılarak fosfat ileri reaksiyonu kurmak. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve 20 mM FC kadar etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> EtOH yağış / yıkama, kuru hava ve saflaştırarakGKD 2 O (yaklaşık 100 ul). tekrar süspansiyon DİKKAT! 32 P radyoaktif bir kaynağıdır. </li><li> Her bir numune için akrilamid mavi boya (ABD) bir eşit hacmi ekleyin. 5 dakika boyunca 80 ° C&#39;de ısıtılarak denatüre etmek ve yükleme. DİKKAT kadar buz üzerinde serin! Formamid (ABD cinsinden) aşındırıcıdır. </li></ol> 5. Elektroforetik Fraksiyonasyon <ol><li> Döküm destek cam plakalar çıkarın ve düzgün elektroforez hücrede bir araya. Yeterli Running Buffer (RB), her iki iç ve dış bölmeyi doldurun. </li><li> Yavaşça tarak kaldırmak ve 10 dakika boyunca 200 V&#39;de jel ön çalıştırın. Yükleme örnekleri önce, bir şırınga aracılığıyla bazı RB squirting kuyulardan üre mevduat silsin. </li><li> Düz ipuçlarına her oyuğa altındaki aşama dikkatlice 4,5 tabakalandırmak örnekleri için. Ters akmasını önlemek için anot ve katot bağlantıları kontrol edin. Numuneler 5 dakika boyunca 100 V&#39;ta jel girdikten sonra, ben200 V&#39;a voltajı arttırın </li><li> Yaklaşık 7 cm uzunluğunda, bir fraksiyonlara ayırma, bir 45 dakika süren bir çalışma yeterlidir. Jel taşma Bromofenol mavisi (ABD bir izleme pigment) kaçının. </li><li> Tercihe bağlı bir adım olarak, etidiyum bromür (EtBr) boyama ile parçalanmış uzun RNA jel üzerinde: Görsel <ol><li> Jel üstünden uzağa 2 cm kesmek ve kısaca GKD 2 O. dilim durulayın </li><li> RB, EtBr 0.5 ug / ml YP nazik karı koca gibi yaşayacaklar ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında jel dilim inkübe edin. </li><li> RB 15 dakika jel destain, UV ışınlaması veya jel görüntüleme uzun rRNA görselleştirmek. RNA yükleme ve kalitesi (bkz Şekil 1, Panel 7). DİKKAT edin! Etidyum bromür bir mutajen. </li></ol></li><li> Bu arada küçük RNA türlerini içeren jel alt kısmı blot devam edin. </li></ol> 6. Jel Blot <ol><li> 6 lekeleme alanına sığdırmak için kurutma kağıdı parçaları ve uncharge eşdeğer bir parça kesmekd naylon membran. Kağıt yapraklarını, membran ve RB 2 blot pedleri nemlendirin. Tamamen art arda RB onları sıkarak pedleri emmek için emin olun. </li><li> Aygıtından jel çıkarın ve bir spatula ile ortalama gözlük açın. Kuyu kaldırmak için temiz bir kesici kullanın. Jel ıslak whatman bir kağıt yerleştirin ve hafifçe yukarı kaldırın. </li><li> Jelin serbest yüzünde bir naylon zar yerleştirin. Numune yükleme işlemi göre olan filtre yönlendirmek için bir köşe işaretleyin. &quot;Sandviç&quot; (3 Kağıt parçalarını her tarafı) tamamlayın. Olası bir hava kabarcıklarını çıkarmak için, yüzey üzerinde leke plastik çubuk döndürün. </li><li> Blot kaset iki lekeleme pedleri ve daha sonra arasındaki blot yerleştirin. , Blot modülü kaseti monte RB ile bölmeyi doldurup (jel ve pozitif terminali arasında kalmalıdır naylon membran) doğru yönde kontrol edin. </li><li> 20 dakika boyunca 20 V aktarın. Not: 10 dakika kurutma modülü ve r açtıktan sonra, homojen koşulları sağlamak içintransferi tamamlamadan önce 180 ° sandviç otate. </li></ol> 7. Membran Çapraz <ol><li> Taze Çapraz Çözüm (XLS) 6 ml hazırlayın. Doyurabilecek 10 cm (naylon membran daha büyük) 10 cm XLS. DİKKAT kurutma kağıdı parçası x! HCI (XLS bir bileşeni) son derece yakıcıdır. </li><li> Blot sökün ve ıslak 3MM filtre kağıdı üzerinde membran yerleştirin. Not: RNA, doymuş kağıt ile doğrudan temas halinde olmamalıdır. Iki cam levha arasında filtresi ve kağıdı yerleştirin ve Saran-şal sarın. </li><li> Bir GKD 2 O yıkama, ardından 2 saat boyunca 60 ° C &#39;de membran, ısıtın. -20 ° C&#39;de saklayın veya melezleşme geçin. </li></ol> 8. Membran melezleme <ol><li> RNA yükleme (isteğe bağlı adım 5.5) kontrol edilmiş ise, doğrudan melezleme devam edin. Ya da, bir naylon filtreden en üstüne uzak 1 cm kesmek sistemi çapraz hybridizatio bilmekparçalanmış uzun RNA&#39;lar ns. </li><li> 37 ° C&#39;de hibridizasyon çözeltisi (HS) 10 ml ön ısıtma. , 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de somon spermi, 1 mg denatüre buz üzerinde serin ve hümik ekleyin. </li><li> , Bir hibridizasyon etüvü içinde dönme altında, en az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de HS filtreyi inkübe edin. Filtrenin RNA tarafı HS karşı karşıya olduğunu kontrol edin. </li></ol> 9. Probe Sentez <ol><li> 4.3 de tarif edildiği gibi, belirli bir antisens oligonükleotid olarak 10 pmol bir fosfat ön reaksiyonu ayarlayın. </li><li> (EtOH ya da çökeltme yoluyla) Tris-EDTA-NaCl (TEN) 5 hacim, reaksiyona tampon ve bir Sephadex G-25 sütun üzerinde jel dışlama kromatografisi ile birleşmemiş nükleotidlerden işaretli primer arındırmak ekleyin. Prob aktivitesi sıvı parıltı sayacı ile değerlendirilebilir. </li></ol> 10. Membran Hibridizasyon <ol><li> 10 ml taze alikot (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan ve tamamlanan) ile bitmiş HS değiştirin. Isı için sondaBuz üzerinde serin ve yeni ekle HS 10 dakika boyunca 95 ° C olarak ölçülmüştür. 37 ° C AÇIK filtreyi inkübe. </li></ol> 11. Membran Yıkama <ol><li> Hibridizasyon çözüm kurtarmak ve bir radyoaktivite-koruyucu kutusuna -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yıkama Tamponu (WB) &#39;de durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile iyice yıkayın. </li><li> Filtre köşelerde bakiye radyoaktivite kontrol etmek için bir Geiger Mueller Dedektörü kullanın. Arka plan emisyon yaklaşık 5 cps olduğunda, fuar zar geçin. </li></ol> 12. Sinyal Algılama <ol><li> Otoradyografisidir filmlerde ya da moleküler görüntüleme ekranı ON filtreyi Açığa. Fotografik işleme veya dijital dönüşüm ile sinyallerini veriyor. </li><li> Özel ölçüm yazılımı (İmageJ veya Optiquant) tarafından bant yoğunluğu analiz edin. </li></ol> 13. Membran sıyırma <ol><li> Soyma çözeltisi kaynayan 500 ml su altında, zar birincil sinyalleri kaldırmak için, Daha sonra 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Yeni bir (ön) hibridizasyon ile devam ya da -20 ° C&#39;de filtre saklayın. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

RNA nörogenezi düzenleyen hangi aracılığıyla intertwining sophisticate bizim takdir sürekli artmasına rağmen, nöral kök hücre biyolojisi, nöronal farklılaşma / fonksiyonel entegrasyon, sinir patolojileri ve kanser gelişimini etkileyen RNA bazlı circuitries mekanik etkileri keşfedilmemiş kalır. Drosophila kısa kodlamama RNA&#39;lar ve transkripsiyon faktörleri majör moleküler oyuncuları olarak hangi keşfedilmemiş hücresel yollar, çözülmeye enstrümantal melanogaster gibi k...

RNA biyokimya geçmiş yıllarda 1 muhteşem ilerlemeler yaşanmıştır. Gen ifadesinin kontrolü RNA potansiyeli son anlama yeni RNA bazlı düzenleyici mekanizmaların 3,4 keşfedilmesiyle ve bilinen transkripsiyon sonrası olayların bir derin karakterizasyonu ile, güçlü bir kodlayıcı olmayan ribo-düzenleyiciler 2&#39;nin tanımlanması ile patlama edilmiştir 5. Hep birlikte bu çalışmalar izin RNA biyoloji dramatik güncel bilimsel peyzaj önemli bir araştırma konusu haline sahneyi yapmak. Özellikle, son yıllarda biz moleküler nörobiyoloji 6, modern hayatın bilimde en dinamik araştırma alanlarında birinde &quot;RNA dünyası&quot; yaygın etkisi duygusu alıyorsanız. Geçtiğimiz yüzyılın son on yılında, toplam bilimsel senaryo RNA müdahelesi 7,8 keşfiyle ve küçük düzenleyici RNA&#39;ların 9,10 devrim olmuşturmicroRNA özellikle 11 ile ilgili olarak, endojen gen ekspresyonu ve kombinasyon pleiotropik düzenleyici olarak hemen hemen tüm hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde implike küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar ifade edilmiştir. MiRNA&#39;ların yüksek sayıda Drosophila ve de 12-15 insan hücrelerinde tespit edildiğinde neredeyse 10 yıl Ambros ve Ruvkun laboratuarlarında tarafından Caenorhabditis elegans miRNA ilk keşiften sonra, yenilenen dikkat alanına döndü. O zamandan beri, çok yönlü transgenik yaklaşımları sayesinde, Drosophila melanogaster miRNA biyosentezi ve aktivite araştırılacağı değerli bir biyolojik bağlamda olarak durdu. Drosophila miRNA&#39;ların yolları, metabolizma yaşlanma sinyalizasyonu kapsayan,-böcek spesifik veya evrimsel olarak korunmuş süreçlerinde farklı işlevleri ortaya çıkarmıştır , davranış ve, elbette, nörojenez. Bu doğrultuda, son zamanlarda ilginç co bir roman bağlantı 16 tanıttıana gen gsm / kayma ve RNA yolun arasında meydana gelen rrelation. Sinek transkripsiyon faktörü GCM / Glide 17-19 multipotent glial vs nöronal kaderi seçim nöral öncüleri 20 uçmak dikte hücre kaderinin belirleyicisi, eşsiz bir örneğini oluşturmaktadır. Yirmi yıl bu konu üzerinde uzun araştırmalar gsm / üzerinde yakınsak gen ekspresyon düzenleme çoklu ve çakışan girdilerin oluşumunu nöral gelişim sırasında nöronal ve glial meslektaşları arasındaki hassas oranını dengelemek için gerekli eşik seviyelerini kurmak için 21-28 kayma altını açıkça gelmiştir. Biz DMEL-miR279 hedefleme yoluyla düzenlemenin gsm yayınlayabilmesine-transkripsiyonel ince ayar / ifadesini 16 kayma katkıda bulunan bir diğer kontrol düzeyi temsil keşfetti. Küresel olarak, bu araştırma çizgiler gerektirmiştir belirli metodolojik iyileştirmeler: yıllar boyunca, çeşitli teknolojiler aslında trad analiz etmek için geliştirilmişitional RNA&#39;lar gibi küçük olmayan bir kodlama RNA miktarının belirlenmesi için dönüştürülmüş, RNase koruma tahlilleri, cDNA dizileri 29-31, gerçek zamanlı PCR yöntemleri 32-35 ve 36,37 dizi analizi gibi. Diğer taraftan, teknik yaklaşımlar yeniden kalibre alanında sürekli ilerlemeler önemli avantajlar sağlamaktadır. Northern blot analizi (nb ya da RNA jel leke analizi) temsili bir örneğini teşkil eder: Bu boyut belirlenmesi yanı sıra, her iki ekspresyon seviyesi kantitatif sağladığından büyük ölçüde, RNA birikmesine profil kullanılır. Bununla birlikte, yöntemin içsel zayıf hassasiyet kısa RNA gibi, düşük miktarda gen ifadesi ince ayarlayıcıları uygulanacak olduğunda sınırlayıcıdır. Bir zararlı sonucu belirli biyolojik numunelerin zor başvurusunu yapan toplam RNA, büyük miktarda gerekliliktir. Bu gibi sebeplerle, küçük RNA&#39;lar tespiti için spesifik NB varyantları için 38-40 geliştirilmiştir: Biz geliştirilmiş NB yordam yararlandıedure 41 (ENB, Gelişmiş Northern Blot), DMEL-miR279 ve gsm / kayma arasındaki yukarıda belirtilen etkileşimi durulaştırmada ederken. Bu yöntem, bir karbodiimid türevi aktivitesine dayanarak diğer kimyasal çapraz bağlama adımı dayanır [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid, EDC] bir katı destek üzerine sabitlemek için bir nükleik asit. Karbodiimid aktive karboksil veya fosfat grupları ve amin grupları arasında amid 42 bağların oluşumunu katalize etmek üzere bilinen çok yönlü bir çapraz bağlayıcıdır. Bu özellik, naylon membran yüzeyinde amino gruplarına da mono-fosforile edilmiş 5&#39;-hidroksil grubu vasıtasıyla kovalent olarak çift küçük RNA&#39;ların etmek için kullanılabilir. Elde edilen bağlantı konfigürasyonu, sırayla, dikkate değer tespiti ile sonuçlanan iyileştirme 43 prob hedef hibridizasyon verimliliğini hareketsizleştirilmiş nükleik asidin erişilebilirliğini arttırmaktadır. Bu teknik belli relevanc kabulDrosophila moleküler çalışmalar e, hangi küçük kodlamama RNA&#39;lar yeni ve farklı sınıfların oluşumu 44 ortaya çıkmaktadır. Bunlar arasında, 45,46 diziye özgü gen susturma katılan piwi etkileşen RNA&#39;lar (piRNAs 47), belirli bir alt tipi teşkil rasiRNAs. Bu yöntemin operasyon detayları tam olarak tarif edilen ve bir rasiRNA, rasi4 arasında, ilk kez, microRNA DMEL-miR279 ve DMEL-miR286 analizine göre ve bundan sonra görselleştirilebilir. Biz RNA (az 1 mikrogram) minimal miktardaki kötü ifade hedeflerini ortaya bize izin bu yöntemi, extremes itti.

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

Geçen yıl RNA düzeyinde gen ekspresyon kontrol mekanizmaları etrafında bilimsel ilgi patlaması yaşandı. Moleküler biyoloji dalı ölçüde post-transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli oyuncu olarak RNA&#39;lar kodlamayan keşfiyle tarafından desteklendi. Böyle bir devrimci perspektif yüksek verimlilik düzeyi (genom tanımlama) ya da tek aday analizi (spesifik türlerin kararlı durum birikimi) gibi hem, eşlik ve kısa RNA&#39;lar ifade profilleme için güçlü teknolojilerin geliştirilmesi tarafından tetiklenen olmuştur. Birkaç state-of-sanat stratejileri dozlama veya kaçan moleküllerin görüntülenmesi için mevcut olmasına rağmen, Northern Blot tahlil RNA ifade anında ve doğru değerlendirilmesi için moleküler biyolojide uygun yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu birçok durumda daha sofistike, pahalı teknolojiler ve uygulama doğru bir ilk adım, kolayca anlayışlar kazanmak için tercih edilen bir yöntemdir kalır temsilRNA biyoloji içine. Burada elle larva / yetişkin dokular kesilmiş ya da in vitro kültürlenmiş hücrelerde, insan embriyosu Drosophila melanogaster ikinci zayıf eksprese microRNA (ya da diğer küçük düzenleyici RNA türlerini) tespit edilmesi için (Kuzey Benek Gelişmiş) verimli bir protokol genel bakış. RNA çok sınırlı bir miktarı ve sitometri izole edilmiş hücreler olabilir, akış malzeme kullanımı da öngörülmektedir.

Şekil 1 &#39;de metinde tarif edilen ve şematik bir şekilde temsil genel prosedür takip edilerek, farklı kökenlerden gelen karmaşık bir RNA örneklerinden küçük RNA&#39;ların tanımını inceledik. (: Agaroz jel fraksiyonasyon denatüre bağlı bir adım) ve çift yüklü Şekil 1&#39;de sunulan deneyde, RNA bütünlüğü açısından kontrol Proteinaz K ekstre Drosophila Schneider 2 hücrelerinden izole edilmiştir. Jelin yarısı nötr bir zar üzerinde kurutulur...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.9K Görüntüleme.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire.  Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır. 

Video: Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Uygulamalarda Kantitatif Karşılaştırılması Cis</emTransgenik>-Regulatory Element (CRE) Etkinlikler Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Bir bakımı<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Nüfus Kafes

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...