Bu araştırma retina dejeneratif hastalığı Vakfı mücadele görme engelliler için körlüğü önlemek, New York, www.rpbusa.org ve büyük New York Merkezi araştırma tarafından desteklenmektedir www.blindness.org. Yazarlar Luanna Bartholomew, doktora, bu el yazması onun eleştiri için teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol uyum içinde Helsinki Bildirgesi ve Yale Üniversitesi insan araştırma Etik Komitesi kuralları ilkelerinin için gerçekleştirilir.
1. kaynak insan donör gözler
<ol><li>İnsan donör küre Ulusal hastalık araştırma değişim (NDRI, Philadelphia, PA) edinin. Projeye bağlı olarak donör gözleri en az üç çift deneysel her grup için hazırlamak.</li>
	<li>Donör gözleri 10 h içinde ve gemi 48 h post mortemiçinde enucleate. Sonra steril Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) kültür orta buz üzerinde laboratuvarda gözlere taşıma. Daha önce bildirilen çalışmalar donör gözleri ve hasat Bruch'ın membran25,26,29faaliyetlerinin ve biyolojik özellikleri bu moda koru taşınan göstermiştir.</li>
</ol>2. hasat insan Bruch'ın membran Explants
<ol><li>100 mm kültür çanak ve bir kesi ile sklera 3 mm arka limbus için yapmak için kullanmak iyi bıçak makas karbon dioksit bağımsız DMEM medya ve çepeçevre her iki yönde uzanan bir 1.5 x 1.5 inç gazlı bez her göz batırılmış bir yer.</li>
	<li>Yapmak bir tam-kalınlık sirkumferansiyel kesi (camsı için delici) 1 mm arka ora serrataiçin. Kaldırmak ve anterior segment (kornea, lens ve Iris), Vitre ve retina atın.</li>
	<li>İyi Cerrahi makas sklera ve koroid arasında dört Radyal kesi yapmak ve o zaman soyma sklera optik sinir, çevre uzak koroid/Bruch'ın membran karmaşık yırtılma önlemek için karşılamaya çalışırken.</li>
	<li>Ardından, çevresel bir kesi ora serrata boyunca suprachoroidal uzayda yapmak ve RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık özafagusu sklera üzerinden soyma.</li>
	<li>Yerel RPE hücrelerinin explant ile 0,02 M amonyum hidroksit Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 60 x 15 mm polistren Petri kabına DPBS (şekil 1) üç - kez yıkayarak takip oda sıcaklığında 20 dakika içinde banyo tarafından kaldırın.</li>
	<li>Bruch'ın membran karmaşık explant karbondioksit içermeyen medyada membran bakan her explant Bazal lamina tabakası ile 0.2 µm gözenekli bir unlaminated, hidrofobik 65 µm kalınlığında politetrafloroetilen membran üzerinde süzülüyor.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant ile politetrafloroetilen membran fritted cam desteğinde bir cam microanalysis vakum filtre tutucu sistemi yerleştirin.</li>
	<li>Bruch'ın membran Bazal laminin yan dokunmamaya dikkat çekici Teflon ile kaplı ince Forseps ile choroidal tarafındaki kıvrılmış kenarlar düzleştirin.</li>
	<li>Özel (DPBS %4) 15 mL ısı ve sonra 37 ° C'ye serin Sonra explant düz kalmasını güvence altına almak için nazik emiş uygulanırken Bruch'ın membran-koroid karmaşık choroidal taraftan üzerine liquidized jeli 15 mL dökün. 2-3 dk özel kuvvetlendirmek ve uzak politetrafloroetilen membran soyma için 4 ° C'de doku tutun.</li>
	<li>Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel içinde 1,5 inç) Bruch'ın membran düzeltmek için çanak altındaki sıcak sıvı özel ile kaplı bir 60 x 15 mm polistren hücre kültür yemek (ile Bruch'ın membran yukarı dönük olacak şekilde) yerleştirin Kuyunun dibinde yukarı dönük olacak şekilde explant Bazal laminin tabaka ile explant.</li>
	<li>Özel Bruch'ın membran explants kültür tabak içinde stabilize etmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Bruch'ın membran kültüründe explants kapak DPBS ile yemek ve yemek ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın. Şekil 2A izole Bruch'ın membran bir 60 x 15 mm kültür tabak içinde explants gösterir.</li>
	<li>İstenen kültür sistemi içinde 96-şey plaka ise, Bruch'ın membran explant (çapı, katılaşmış özel jel ile 1,5 inç) laminin tarafı ile düz bir Teflon sayfada yukarı yerleştirin.</li>
	<li>Beş ya da altı, kesilmiş bir trephine kullanarak 6 mm-daire düğme Bruch'ın membran karmaşık gelen explant ve her % 4 özel üzerinde sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de yerleştirin. Özel Bruch'ın membran explants (düğme) her kuyunun düzeltmek için oda sıcaklığında 2-3 dakika içinde kuvvetlendirmek. Not: Şekil 2B trephined Bruch'ın membran düğmeleri bir 96-şey plaka gösterir. Genellikle, 9-11 düğmeleri veya explants her gözünden hasat edilebilir.</li>
</ol>3. insan Bruch'ın membran üzerinde retina Pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının Explants
<ol><li>Donör gözleri aldıktan sonra DPBS ile Gözdışı doku temiz. Çevresel bir kesi Iris sklera aşağıda 5 mm nokta (pars plana) subretinal boşluğa dokunmatik olun. Anterior segment, Vitre mizah ve retina atmak.</li>
	<li>Bruch'ın membran ve soğuk DPBS ile RPE levha içerir kadeh yıkayın. 5 mL % 0.25 tripsin artık her göz örnek için 10 dk daha için de RPE hücrelerle ayırmak. 50 mL tüp içinde 37 ° C'de ısındı % 15 fetal sığır serum (FBS) ile DMEM tam orta tripsin tepki 25 mL ile gidermek.</li>
	<li>200 × g 24 ° C'de 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi ve Pelet 5 mL DMEM tam orta resuspend (% 15 ile FBS).</li>
	<li>Hücreleri saymak ve antibiyotik içeren her çeşitli yaşlı Bruch'ın membran explants (düğme) 200 µL serum-Alerjik minimum temel medya (MEM) bir 96-şey plaka Bazal lamina üzerine 15.000 RPE hücrelerin tohum (100 IU/mL penisilin G, 100 mg / mL streptomisin, 5 mg/mL gentamisin ve 2,5 mg/mL Amfoterisin B). Bu yoğunluk kaplama 20 µm hücre çapını varsayarak RPE hücrelerinin kaplama alanı yaklaşık % 15'i karşılamak izin verir.</li>
	<li>Hücreleri sayede hücre yoğunluğu sonra stepwise kadar % 100 izdiham bağlı olarak her parametre etkisi hücre davranış için arttırılabilir düğmesi üzerine plaka.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de % 95'i air/5% CO2 oksijen bir ortamda 24 h için explant takmak izin Yavaşça orta sıcak tam DMEM ile değiştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+3-nitrotyrosine+and+nitro-A2E+in+human+Bruch's+membrane.">Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).</li><li>Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membranes+in+development+and+disease.">Basement membranes in development and disease.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).</li><li>Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+basement+membrane-linked+diseases.">Cell therapy for basement membrane-linked diseases.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+and+laminin+in+Bruch's+membrane+and+basal+linear+deposit+in+the+human+macula.">Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula.</a> Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).</li><li>Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+drusen+formation+in+the+normal+and+aging+eye+and+their+relation+to+age+related+maculopathy:+a+clinicopathological+study.">Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study.</a> Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+composition+of+drusen+associated+with+glomerulonephritis:+implications+for+the+role+of+complement+activation+in+drusen+biogenesis.">Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis.</a> Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).</li><li>Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+alterations+precede+vascularization+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+dystrophic+rats.">Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats.</a> Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).</li><li>Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+changes+in+Bruch's+membrane.+A+histochemical+and+morphologic+study.">Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study.</a> Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).</li><li>Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+in+age-related+macular+degeneration:+pathogenesis,+natural+course,+and+laser+photocoagulation-induced+regression.">Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li><li>Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+and+morphometric+analysis+of+the+choroid,+Bruch's+membrane,+and+retinal+pigment+epithelium+in+postmortem+eyes+with+age-related+macular+degeneration+and+histologic+examination+of+surgically+excised+choroidal+neovascular+membranes.">Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes.</a> Surv Ophthalmol. 44, S10-S32 (1999).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch's+membrane.">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro.">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li><li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch's+membrane.">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li><li>Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+study+of+retinal+pigment+epithelium+sheet+transplants+onto+Bruch's+membrane.">Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+different+layers+of+host+human+Bruch's+membrane+by+retinal+pigment+epithelial+cell+grafts.">Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).</li><li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+of+aged+Bruch's+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation.">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li><li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch's+membrane.">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li><li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases.">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li><li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li><li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch's+membrane.">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li><li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium.">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li><li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reengineering+human+Bruch's+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium.">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).</li><li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruch's+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium.">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbiri bildirmek için herhangi bir ticari açıklamalar var.

Yaşlı insan Bruch'ın membran (hücre dışı matriks) AMD hastalık ilerleme katkıda bulunur ve böylece bu değiştirilmiş matris RPE hücre disfonksiyonu için nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için gerek yoktur. Yaşa bağlı değişimler AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, hastalığın etkileri taklit ex vivo model sistemleri patofizyolojisi anlamak için değerli bir araç olarak hizmet verebilir. Bu el yazması açıklanan metodoloji tutarlı bir şekilde Bruch'ın membran explants ve kültür RPE hücrelerinin, birincil, ölümsüzleştirdi veya kök hücre kaynaklı RPE hücre hatları dahil olmak üzere insan yalıtmak için kullanılabilir.
Daha önce de belirtildiği gibi insan Bruch'ın membran explants NDRI kaynaklı. Bir iletişim kuralı kabul edilebilir donör gözler için ayarlanan ölçütleri belirten NDRI ile kuruldu. Örneğin, bağış yok bilinen retina göz hastalıkları olması gerekir, gözleri/küre içinde 10 h ölümünden sonra alınır ve küre 48 saat içinde laboratuvarda ölümünden sonra (yolu ile paket teslimâtı buzda) geliyor. Uygun yaş aralığı ve gözleri bir çalışma, örneğinistatistiksel analiz için gerekli sayısını belirtin., Küre bağış bağış yaşları 50-89 arasında beş dünya çift 20-49 yaşları arasındaki beş çift.
Genellikle on çifti küre kullanılabilir her ay ortalama göz küre kullanılabilirliği değişir. Göz paket temel, de-tanımlanan donör bilgi ile geldi: yaş, ırk, ölüm, ölüm nedeni, zamanı ve tıp tarihi (hastalık listesini ya da comorbidities) kısa.
En önemlisi, insan Bruch'ın membran explants hasat göz ve camsı RPE Bruch'ın membran-koroid kompleks izolasyon için sağlar, anterior segment kaldırılmasını gerektirir. Bruch'ın membran izole olduğunda, RPE hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda acellular explants üzerine tohumlari ve aşağı akım deneyler için kültürlü. Hazırlık ve yordamsal işleme burada açıklandığı gibi kritik, laminal yüzeyi bakan-up sırasında değil müessir yüzeyin mekanik zarar görmesini önlemek için emin olmak için izole Bruch'ın membran yönünü dikkat hücre dışı matriks yüzey yapısı.
Bu da Bruch'ın membran explant sistemleri kullanırken, orada bireysel donör genomik arka plan gibi aşağı akım deneylerin sonuçlarını, yaş Bruch'ın membran veya Bruch'ın öldükten sonra zaman etkileyebilecek bazı değişkenler belirtilmelidir membran ve konumunu Bruch'ın membran, i.e., merkezi veya periferik Bruch'ın membran explants bir parçası. Herhangi bir diğer insan dokusu çalışma ile gibi gerekli istatistiksel gücü var ve donör göz yaşı uygunsa eşleştirmek için uygun donör göz örnek numarası işe gerekir. Göz bankaları gözlerinden kabul etmek için sıkı kriterleri kurulması önemli bir parametredir. Sadece gözleri bu az 10 h öldükten sonra enucleated ve hangi Bruch'ın membran hazırlık içinde 24-48 h ölümünden sonra hasat edilebilir kabul. Optik sinir site yönlendirmesi için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve aynı yerlerde kullanmak deneysel ve çalışma grupları denetlemek. Bu önlemler alarak, bir deneysel değişkenlik en aza indirebilirsiniz.
Özetle, RPE Bruch'ın membran-koroid karmaşık ve nasıl yaş ve hastalık etkilenen anlayışı patofizyolojisi katkısı AMD anlamak için önemlidir. Ex vivo teknikler istihdam modeli sistemleri insan dokusu kullanarak bu efektleri araştırmak için değerli bir araç vardır. Burada, biz insan donör explants yaşında Bruch'ın membran ilgili ex vivo modeli olarak istihdam bir metodoloji tanımlamak. Bu teknik bir nasıl matris içinde yapısal değişiklikleri araştırmak için bir araştırma aracı RPE overlaying etkileyebilir gibi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran kullanmak izin verir ifade25 eki, yayılması ve gene de dahil olmak üzere hücre davranış , 27. başarılı benzer ex vivo modeli sistemlerinin geliştirilmesi AMD anlayışımız daha fazla ve yeni tedavi olanakları gelişimi kolaylaştırmak.

Yaşa bağlı nitrosative ve oksidatif stres de dahil olmak üzere birçok faktör tarafından neden olduğu insan Bruch'ın membran yapısal değişikliklere giderek artan retina pigment epitel (RPE) hücreleri ve katkıda işlevi birden çok zararlı etkileri Patoloji yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Hücre replasman tedavisi için gelişmiş atrofik AMD ya da coğrafi Atrofi dikkate alınarak, tedavi büyük olasılıkla RPE hücre Atrofi bir yatak üzerine hücrelerinin nakli gerektirir. Yaşa bağlı değişiklikler insan Bruch'ın membran içinde hasar için hücre dışı matriks6,9,10,11 verilen transplante RPE hücre Greftler başarısını olumsuz yönde etkilenebilir , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. Bruch'ın membran Biyoloji ve nasıl matris içinde yapısal değişiklikler katkıda bulunmak için AMD ilerleme araştırılması insan hastalık patoloji anlamak için çok önemli. Böylece, ex vivo yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran hasat tarif protokolleri geliştirmek için yaşa bağlı göz alanındaki araştırmacılar için kritik bir ihtiyaç vardır.
Tarihsel olarak, bu modeli yaşa bağlı bozukluklar coğrafi atrofi ve hayvanlar23yaşında bir insan Bruch'ın membran gibi zor oldu. Bu zorluk birden fazla etkene kemirgenler ve modelleme hastalığı yanı sıra çoğu omurgalılar24yılında makula eksikliği için sık kullanılan diğer türler ile karşılaştırıldığında insanlar uzun ömürlü kaynaklanmaktadır. Burada açıklanan yöntemin avantajı hücreleri doğrudan yaşlı ve/veya hastalıklı bireylerin post mortem gözlerinden çıkarılan Bruch'ın membran üzerinde test edilebilir olduğunu. Bu makalede genel amacı yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran bir ex vivo modeli için detaylı bir metodoloji sağlamak için dahil olmak üzere insan Bruch'ın yalıtım membran insan bağış explants ve RPE tohum için hücreleri aşağı akım deneyler. Bu model hücre dışı matriks hasar RPE hücre işlevi ve patoloji20,25,26,27,28katkısını araştırmak için uygun bir model olarak hizmet verebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1219">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:599px;">Human donor globes</td>
			<td style="width:305px;">National Disease Research Interchange, NDRI</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbon-dioxide independent media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18045-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrophobic 65 &#181;m-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 &#181;m pores</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>JGWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>09-753-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2576-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 &#215; 10mm culture dish</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>25373-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trephine</td>
			<td>Accutome</td>
			<td>AM0570 60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum essential media (MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11095-080&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1336-21-6 
			&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing of retinal pigment epithelial cells on an ex vivo model of aged human bruch's membrane

Vitaminler ve antioksidanlar Age-Related göz hastalığı çalışma tarafından önerilen bir yana, olguların % 90'ı temsil eden "kuru" veya atrofik yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için hiçbir etkili tedavi vardır. Tedaviler yavaş veya coğrafi Atrofi (GA) gelişimi geri zekalı için gereklidir ve Bruch'ın membran patoloji anlama bu sürecin parçasıdır. İnsan Bruch'ın zarda değişiklik AMD ilerlemesini retina pigment epitel (RPE) damage hücre katkıda bulunarak koyun. AMD eğitim için yeterli hayvan modellerin eksikliği göz önüne alındığında, yaşlı insan Bruch'ın membran ex vivo modelleri gibi davranış RPE hücrelerinin çalışma için yararlı bir araç ölümsüzleştirdi ve birincil hücre hatları gibi RPE satırları İndüklenmiş pluripotent kök elde edilen hizmet hücreler (iPSCs). Burada, bir hasat insan Bruch'ın membran explants eki, Apoptozis ve yaygın, photoreceptor dış işbirliği yeteneği de dahil olmak üzere insan bağışçılardan numaralı seribaşı RPE hücre davranış etkilerini belirlemek izin verir ayrıntılı bir yöntem mevcut kesimi, polarizasyon ve gen ekspresyonu kurulması. Bu tahlil ex vivo modeli ne zaman yaşlı/tehlikeye hücre dışı matriks seribaşı RPE hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için yaşlı Bruch'ın membran sağlar.

Bu iletişim kuralı düzgün gerçekleştirildiğinde, kimse RPE hücre işlevi yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini polarite ve dış kan retina bariyerini kurulması, büyüme faktörleri ve sitokinler polarize salgılanmasını tarafından belirleyebilirsiniz, ve fagositoz photoreceptor çubuk dış segmentleri.
Biz-si olmak oluşturmak bir hastalık fenotip yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde göstermek veri. Örneğin, üzerinde RPE hücrelerinin kültür insan Bruch'ın membran explants azalır RPE hücre yatıştırıldı (şekil 3) yaşlı. Yaşlı insan Bruch'ın membran üzerinde kültürlü RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS), işbirliği için kapasitesini bu hücreler bir kritik RPE işlev (şekil 4) azaltır. Ayrıca, apoptotik hücre tespit ve terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick son etiketleme (tünel) leke önceki iş26açıklandığı gibi kullanarak bu düğme explants karşılaştırıldığında. RPE hücre gen ifade profil bir yaşında ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran etkilerini Mikroarray teknolojisi kullanılarak belirlenebilir. RPE hücre gen ekspresyonu insan Bruch'ın membran explants için genç bireyler (şekil 5)27karşılaştırıldığında büyük kişilerden kültürlü zaman değiştirilmez göstermiştir. İstatistiksel analiz için explants en az 3-5 insan bağışçılardan grubu başına kullanılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Şekil 1. Donör gözlerinden insan Bruch'ın membran izolasyon şematik gösterim. İnsan Bruch'ın membranlar sklera, anterior segment, retina, Vitre kaldırarak hasat ve yerel retina pigment epitel (RPE) hücreleri. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Şekil 2. İnsan Bruch'ın membran (BM) bir kültür tabak içinde izole. (A) insan Bruch'ın membran explants (çapı, katılaşmış özel jel ile her 1,5 inç) şematik bir 60 × çanak altındaki sıcak sıvı özel dolu 15 mm polistren hücre kültür çanak (BM yukarı doğru) yerleştirilir. (B) bu birkaç 6 mm dairesel düğme (explants), trephined bir insan Bruch'ın membran explant her ow sonra yerleştirdiği bir sigara tedavi polistiren de bir 96-şey plaka, 37 ° C'de % 4 özel tarih. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Şekil 3. Retina pigment epitel (RPE) hücre genç ve yaşlı insan Bruch'ın membran (BM) oranına yatıştırıldı. Bruch'ın membran explants--dan genç insan üzerine numaralı seribaşı birincil RPE hücrelerinin (< 50 yaşında, n = 3) veya büyük (> 70 yaşındaki, n = 5) donör gözler üç hafta için. Hücre eki hızı MTT hücre canlılığı tahlil tarafından ölçüldü. Büyük insan Bruch'ın membranlar %24 RPE hücre eki oranı azaldı (8,54 + / genç BM 100 S.E. büyük BM 76.65 1,44 +/-vs S.E.). p < 0,05, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Şekil 4. Retina pigment epitel (RPE) hücre fagositoz insan Bruch'ın membran (BM) yaşa göre etkilenir. Bruch'ın membran explants büyük insan kültürlü birincil RPE hücrelerinin çubuk dış segmentleri (ROS) işbirliği için azaltılmış bir yetenek vardı (9,3 +/-genç BM 873 S.E., n = 5 eski BM 608 25,4 +/-vs S.E., n = 5). p < 0,01, S.E. standart hata =.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Şekil 5. Sayısı retina pigment epitel (RPE) hücre genler üzerinde genç kültürlü her örnek olarak ifade veya büyük insan Bruch'ın membran explants. Birincil RPE hücrelerinin üzerine numaralı seribaşı olarak ifade genlerin sayısının daha fazla dağılım oldu genç insan Bruch'ın membran karşı büyük (6201 ± 388 6439 ± 80, vs sırasıyla); Beş explants her yaş grubu için test edildi. Cai, tüm yazarların tam izni ile sunulan H ve ark. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane at JoVE.com

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

culturing-retinal-pigment-epithelial-cells-on-an-ex-vivo-model-aged

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

10.1K Görüntüleme.  Yale School of Medicine. Bu iletişim kuralı, yaşlı ve/veya hastalıklı insan Bruch'ın membran retina pigment epitel (RPE) hücre kültürü çalışmalarının göstermek için hedeftir. Bu yöntem RPE hücre davranış güvenliği aşılan bir hücre dışı matriks üzerinde çalışmaya uygundur.

Video: Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Gelişim Biyolojisi

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...