The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

Kültür Reaktifler ve Kültür Plakaların hazırlanması 1. <ol><li> Kök hücre bazal ortamı, 400 ml 5x serumsuz ek 100 ml ilave etmek suretiyle besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı hazırlayın. Orta 2 haftaya kadar 4 ° C &#39;de 6 ay boyunca -20 ° C&#39; de stabildir. </li><li> Rho-bağlantılı sarmal bobin ihtiva eden bir protein kinaz (Rock) inhibitörü (Y-27362) için ticari olarak temin edilebilen embriyoit gövdesi (EB) oluşumu ortamı içinde 10 uM çözeltisi ekleyin. </li><li> (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı, F-12, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM esas olmayan amino asitleri, 2 mM L-glutamin,% 10 nakavt serum yerine (KSR) ve 10 ug / ml gentamisin ilave edilerek DMEM farklılaşma ortamı hazırlayın / F12). </li><li> 1x N1 takviyesi, 0.1 mM esas olmayan amino asitleri, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 20 ng / ml hidrokortizon, 5 ug / ml gentamisin ve% 15 eklenmesi ile iPS RPE orta hazırlayın fetal sığır serumu (FBS) &lt;sup&gt; Minimum Essential Orta Kartalı (MEM) 21. PH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu stok çözeltisi hazırlayın. Hafifçe dönen 1 N sodyum hidroksit içinde triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 1 mg eritin. MEM 49 mi triiyodo-L-tironin sodyum tuzu ve 50 ml 20 ug / ml yapmak için ekleyin. Alikotları hazırlayın ve gerektiği kadar -20 ° C&#39;de donar. Son kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim kullanın. </li><li> Hidrokortizon stok çözeltisi hazırlayın. Hafif çalkalama ile% 100 etanol içinde 1 ml hidrokortizon, 1 mg çözünürleştirilir. MEM 19 mi, 20 ml hidrokortizon stok çözeltisi ug / ml 50 yapmak için ekleyin. -20 ° C&#39;de kısım ve donma kadar gerekli. Son kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim kullanın. </li><li> DMEM / F12 içinde 1 mg / ml dispase bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Matris kaplı plakaların hazırlanması <ol><li> Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) çıkarılan protein matrisi mou hazırlayın0.08 mg / ml DMEM / F12 içinde se sarkoma hücreleri. Kat matris solüsyon içerisinde 1 ml, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğa. 1 saat boyunca oda sıcaklığında kaplanmış inkübe edin. </li><li> 1 saat inkübe edildikten sonra, fazla DMEM / F12 aspire. Kuyular kurumasını önlemek için besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı, 0.5 ml ilave edilir. matris kaplı plakalar kullanıma hazırdır. </li></ol></li><li> DMEM / F12 içinde 2 ml her bir durulanarak, mikro plakalar hazırlayın. DMEM / F12 çıkarın ve her bir Rock inhibitörü ile takviye edilmiş EB formasyonu sıvısının 0.5 ml ilave ediniz. 5 dk herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için 2.000 xg&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir sodyum azid% 2 FBS karıştırılarak FACS boyama tamponu hazırlayın ve% 0.09. PH 7.4 tampon ayarlayın. </li><li> DMEM / F12,% 10 FBS eklenerek tripsin nötralize çözelti hazırlayın. </li></ol> 2. iPS Kültür <ol><li> IPS hücre tohumlama öncesinde, sıcak besleyici içermeyen kök hücre kültürü 37 ° C, orta, ve ma vartrix plakaları hazır kaplı. </li><li> Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde IMR90-1 iPS hücrelerini eritin. Daha sonra su banyosundan cryo-flakon çıkarın ve% 70 etanol ile şişeyi silin. Hücre kümeleri kırılmasını en aza indirmek için 2 ml&#39;lik bir pipet kullanarak 15 ml konik bir tüp hücre transfer edin. </li><li> Damla damla hücrelere sıcak besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı 5 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj hücreler çıkartıldı ve süpernatan. </li><li> Dikkatle besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamının 2 ml hücre kümeleri tekrar süspansiyon ve matris ile kaplanmış bir levhanın gözleri içine hücre kümeleri tohum. % 5 CO2,% 95 nem ile 37 ° C inkübatör içine plaka koyun. </li><li> Günlük iPS hücre kültürü ortamı değiştirin. Tohumlama sonrası farklılaşmamış koloniler 5-7 gün gözlemleyin. Bir ışık mikroskobu altında geçit (yoğun merkezi koloniler) için hazır farklılaşmamış koloniler için kontrol edin. </li></ol> IPS hücrelerinin 3. Pasajlanması <ol><li> Başlangıçta önce geçide iPS hücreleri, su banyosu içinde 37 ° C Dispase çözeltisi, DMEM / F12 ve besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı ısıtın. </li><li> IPS hücrelerini pasaj önce, bölgeyi kazıma ve orta aspire farklılaşma herhangi alanları kaldırmak. Dikkatle 2 ml DMEM / F12 ile iPS hücrelerini durulayın. </li><li> / Ml dispaz her bir kuyucuğa 1 mg 1 ml ilave edilir ve 7 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe edin. Dispaz aspire ve yavaşça DMEM / F12, iki kez 2 ml hücre kolonileri yıkayın. Durulamadan sonra, her bir kuyucuğa besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamının 2 ml ilave ediniz. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanarak hafifçe hücre kümeleri oluşturmak için plaka koloniler kazımak. 15 ml konik tüp müstakil hücre kümeleri aktarın. Hücrelerin sonraki geçişini tohum yeterli besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı ekleyin. </li></ol> Microwell Plakaları kullanma EBS 4. Nesil <ol><li> IPS hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması <ol><li> Mediu&#39;yu kaldıriPS hücrelerinden m DMEM / F12 içinde 2 ml iPS hücrelerini yıkayın. 6 gözlü bir plakanın her bir de iPS hücreleri Accutase 750 ul ekle. Hücreler plakasına (yaklaşık 5-10 dakika) ayrılmasını sağlamak için izin vermek için 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile inkübe hücreleri. </li><li> Yavaşça kalan hücreleri ayırmak için bir pipet kullanın ve plaka yüzeyinde kalan hücreleri ayırmak için. 50 ml&#39;lik bir konik tüp hücreleri aktarın. DMEM / F12, 5 ml plaka durulayın ve konik bir tüp içinde hücreler ile yıkandı, DMEM / F12 birleştirir. Olası kalıntı hücre kümeleri kaldırmak için bir 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin. </li><li> Accutase çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücreleri santrifüjleyin. Hücre yoğunluğu yaklaşık 0.5-1.0 x 10 7 hücre / ml olacak şekilde EB formasyonu ortamında hücre pelletini. </li><li> Tripan mavi ve bir hemositometre ile hücre sayımı yolu ile yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek. </li></ol></li><li> Adjustinmikro g hücre yoğunluğu boyutu kontrollü EBS oluşturmak üzere <ol><li> İstenen EB boyutları oluşturmak için bir mikro tablanın her bir çukuruna hücre sayısını ayarlar. Eşit hafifçe hücreler birkaç kez pipetleme hücreleri dağıtmak, adım 1.9 hazırlanan levhaların mikro hücreleri ekleyin. NOT: kuyu başına mikro EB sayısı x başına hücre kuyu başına gereken hücrelerin sayısı = istenilen sayı. </li><li> 2.0 ml &#39;lik bir son hacme kuyu kaya inhibitörü ile takviye edilmiş EB formasyonu orta ayarlayın. Yavaşça her pipetleme iyi hücreleri yeniden dağıtın. 3 dakika boyunca 100 x g&#39;de mikro plakaları santrifüjleyin. % 5 CO2 ve 24 saat için% 95 nem ile 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde plakaları yerleştirin. </li></ol></li><li> Mikro plakalardan Hasat EBS <ol><li> Iyi EBS çoğunun çıkması için 1 ml mikropipetöre ile yukarı ve aşağı orta pipetleme mikro Hasat EBS. Bir ters 40 mikron hücre yoluyla EB süspansiyon geçmek50 ml&#39;lik konik bir tüp üzerine süzgeç tek hücreler ayıklandı. </li><li> Tüm EBS kaldırmak için DMEM / F12 içinde 1 ml bir mikro oyuk plaka 5 kez yıkayın. Yıkar toplayın ve ters hücre süzgecinden geçmek. Yeni 50 ml konik tüp kadar hücre süzgecinden sağ tarafını çevirin. EB formasyonu ortam ile yıkanarak EBS toplayın. Verimi belirlemek için EBS sayın. </li></ol></li></ol> 5. Kaplama EBS ve başlatılıyor Farklılaşma <ol><li> &lt;1,000 EBS / yoğunluğunda iyi EB formasyonu ortamı artı 10 uM Kaya inhibitörü (adım 1.8.1 gibi), altı gözlü levha üzerinde kaplanmış protein matrisi üzerindeki EBS Plate. % 5 CO2 ve 24 saat için% 95 nem ile 37 ° C&#39;de EBS inkübe edin. </li><li> 24 saat EB sonra kaplama, farklılaşma başlatmak için farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücreler, daha fazla analiz için toplanır kadar her gün farklılaştırma ortamının yarısı değiştirin. </li><li> RT-PCR yapmak için günde 6, 17, 29 ve 60 ° C&#39;de örnekleri toplamak, immunocytochemistry ve FACS karakteristik RPE genlerin ve proteinlerin ifadesini doğrulamak için. </li></ol> 6. RNA ekstraksiyonu ve PCR <ol><li> Piyasada mevcut kit verilen talimatlara göre EB örneklerinden RNA ayıklayın. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> CDNA ters transkript kiti piyasada mevcut RNA göre toplam RNA 100 ng ters transkripsiyon gerçekleştirin. </li><li> CDNA 10 umol / 10 ng bir konsantrasyonda cDNA 10 ng, aşağıdaki primerler kullanılarak (Tablo 1) ile PCR yapın. Aşağıdaki gibi PCR ayarlayın: 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de DNA&#39;yı denatüre, 72 ° C&#39;de bir son döngü, ardından 30 saniye, 1 dakika için 72 ° C için 15 saniye boyunca 95 ° C&#39; de 35 döngü 60 ° C yükseltmek 10 dakika işleme sokuldu. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünü çalıştırın. </li></ol> 7. İmmünositokimya <ol><li> Oda sıcaklığında PBS ile iki kez EBS yıkayın. % 4 paraformald RT EBS saptamak10 dakika boyunca ehyde. Oda sıcaklığında bir kez PBS ile yıkayın. 4 ° C de PBS içinde mağazası örnekleri boyama için kullanılana kadar. </li><li> Boyama gününde, tespit ve permeabilization reaktifler ile sabit hücreler tedavi. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (permeabilizasyon çözeltisi içinde% 10 keçi serumu) bloke etme çözeltisi ile inkübe edin. </li><li> Belirtilen seyreltmelerde aşağıdaki birincil antikorlar kullanılarak permeabilizasyon çözeltisi içinde% 10 keçi serumu immunokimya yapın: Anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), ve anti- ZO1 (1: 100). 4 ° C &#39;de antikor O / N karşılık gelen örnekleri inkübe edin. </li><li> Bir sonraki gün, hücreler birinci antikorları ayıklamak ve PBS ile numuneleri üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin. </li><li> Hücrelerinden ikincil antikoru çıkarın ve PBS içinde numuneleri üç kez yıkayın. Kapak montaj ortamı içeren DAPI ile cam slaytlar fişleri monte ve örnekler karanlık odasında O / N ayarlamanıza olanak verir.Lekelenmeye görselleştirmek için bir floresan mikroskop kullanın. </li></ol> FACS Analizi 8. Boyama <ol><li> PBS içinde iki kere kültür EBS yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu yapmak için 5-10 dakika boyunca% 0.25 tripsin, 0.5 ml EBS inkübe edin. Tripsin nötrleştirme çözeltisi ile tripsin (1 ml / çukur) nötralize. </li><li> 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj ile tek bir hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Süpernatantı atın ve tüp hücrelere DMEM / F12 10 ml ekleyin. Yavaşça hücreleri karıştırmak için ters. 600 x g&#39;de santrifüj. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan atılır ve FACS lekeleme tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücrelerin toplam sayısını sayın. 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüjleyin. Santrifüj atmak süpernatant sonra. Hemen% 4 paraformaldehid, 0.5 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Nazik vorteks ile iyice karıştırın. 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 10 dakika için 600 xg&#39;de santrifüj ve kaldırmaksüpernatant. Vortex hafifçe hücre pelet bozacak. Soğutulmuş permeabilizasyon çözeltisi 1 ml ilave etmek suretiyle hücre geçirgenliği. Girdap, yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilmeye. </li><li> 10 dakika için 600 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. FACS tampon boyama ve tekrar süspansiyon 3 ml ekleyin. Bir kez daha bu adımı tekrarlayın. 5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda, FACS lekeleme tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Her bir mikrofüj tüplerine hücre süspansiyonu (0.5 x 10 6 hücre), 100 ul aktarın ve birincil antikor tavsiye edilen hacim ekleyin. Pax6, hücre süspansiyonu 100 ul PE karşıtı Pax6 5 ul ilave edin. MITF, hücre süspansiyonu 100 ul anti-MITF 5 ul ilave edin. </li><li> Karıştırın ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. FACS lekeleme tampon maddesi 3 ml ilave edilir. 10 dakika için 600 xg&#39;de karıştırın ve santrifüj. Süpernatantı ve iki ek kez 8,16 tekrarlayın. </li><li> MITF boyama için, ikincil Antibo hücreleri inkübedy, 1 bir seyreltme keçi anti-fare Alexa Fluor 488: 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile 2000. Pax6 boyama için, bu adımı kaçının. </li><li> 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de, FACS lekeleme tampon maddesi ve santrifüj 5 ml hücreleri yıkayın. Iki kez bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Hücre pelet bozmaya hafifçe FACS boyama tampon ve vorteks 500 ul hücrelerin tekrar. Numuneler akım sitometri analizi için hazırız. </li></ol> 9. IPS-RPE İzolasyon ve Kültür <ol><li> Günün 29 at, dikkatli bir 200 ul pipet kullanarak kültür plaka seçilen pigmentli koloniler etrafında kesti. 15 ml konik tüp yüzen koloniler aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj koloniler çıkartıldı ve süpernatan. </li><li> 10 dakika boyunca 600 x g&#39;de DMEM / F12 ve santrifüj 10 ml hücre kolonileri yeniden süspanse. Süpernatantı. </li><li> 7-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de% 0.25 tripsin ve 2 ml koloniler inkübe edilerek, tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması. Yavaşça koloniler ayırmak için hücre süspansiyonu vorteks. </li><li> IPS-RPE orta 2 ml ekleyerek tripsin nötralize eder. 10 dakika için 600 xg&#39;de Santrifüj ve süpernatant atın. IPS-RPE orta 2 ml bir tekrar süspansiyon hücreleri. 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir kuluçka makinesi içinde bir protein matrisi kaplanmış 6-yuvalı plaka ve yeri içine hücreleri aktarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li><li>Ukrohne, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4+reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).</li><li>Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+outside+the+liver:+induced+pluripotent+stem+cells+for+hepatic+applications.">Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications.</a> World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).</li><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+source+of+cardiac+regeneration.">iPS cells: a source of cardiac regeneration.</a> J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li><li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage.">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Cour la, M., Tezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Retinal+Pigment+Epithelium.">The Retinal Pigment Epithelium.</a> Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).</li><li>Vaajassari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+defined+and+xeno-free+differentiation+of+functional+human+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Mol Vis. 17, 558-575 (2011).</li><li>Carr, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat.">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).</li><li>Muniz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+uptake,+processing,+and+secretion+in+human+iPS-RPE+support+the+visual+cycle.">Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).</li><li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+inducing+embryoid+body+formation:+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells.">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).</li><li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers.">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li><li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücre tedavisi için pluripotent kök hücrelerin tam söz gerçekleştirilmesi için, tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kendi farklılaşma atılması için gereklidir. Bu rapor, mikro plaka teknolojisini kullanarak boyutu kontrollü EBS oluşturan RPE doğru farklılaşma başlatmak ve RPE protein ve gen göstergeleri tanımlamak için protokolleri açıklar. In vitro olarak farklılaşma senkronize etmek için, EBS homojen boyutları zorunlu agregasyonu mikro plakalara santrifüj iPS hücrelerinin bi...

Uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri dış faktörlerin 1 yetişkin hücrelerinin yeniden programlanması türetilen pluripotent kök hücrenin bir türüdür. Bunun aksine, embriyonik kök hücrelerin (EKH), pluripotent kök hücrenin başka bir tip blastosist 2-3 iç hücre kitlesi elde edilmiştir. Farklı kökenlerden rağmen, iPS hücreleri ve EKH in vitro ve herhangi bir hücre tipine 4-5 içine ayırt etme kapasitesinde çoğaltmak için onların sınırsız kapasite karşılaştırılabilir. IPS hücrelerinin bu özellikleri onları kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp uygulamaları için ideal bir aday olun. Son araştırma çabaları retina pigment epiteli (RPE), 6-11 dahil olmak üzere özel yetişkin hücreleri üretmek için sağlam farklılaşma protokolleri geliştirmeye odaklandık. IPS türetilen hücrelerin potansiyel klinik uygulamaları için, belirli bir hücre tipi için yönlendirilmiş bir farklılaşma gereklidir. Çeşitli yöntemler vardıronların verimlilik 6-7, 12-16 büyük ölçüde değişir RPE içine hem EKH ve iPS hücrelerinin yönettiği farklılaşması için yayınladı. Biz hala geliştirme veya farklılaşması sırasında hücre / doku kaderi yöneten moleküler olayların pek bilmiyorum. Son yıllarda, çabalar mümkün olduğunca embriyonik gelişimini taklit edebilir farklılaşma protokol geliştirmek için girişimlerde bulunulmuştur. Blastosist aşamasında, kök hücrelerin kaydedilmemiş nüfusu üç boyutlu mikroçevresinin birlikte bulunmaktadır. Yani, çeşitli stratejiler araya ESC / iPS hücrelerini yapmak ve üç boyutlu onları büyümeye uygulanmıştır. Bu kök hücre agrega embriyoid organları (EBS) denir. Çalışmalar kök hücrelerin EB farklılaşma embriyo gelişiminin erken evre taklit ve kendiliğinden onun dış yüzeyinde ilkel endoderm neden olduğunu göstermiştir. EB gelişme ilerledikçe sonra, her üç germ soylarının farklılaştırılmış hücre fenotipleri 17-18 görünür. Therefore, EBS tabanlı farklılaşma protokolleri ESC / iPS hücrelerinin in vitro farklılaşması için dikkat çekti ve pluripotent kök hücrelerinden 13 den RPE nesil için iyi bir aday olduğunu var. EBS ESC / iPS hücrelerinden çeşitli yöntemlerle yapılabilir. Başlangıçta, EBS yapışkan koloniler kazıma ve yapışmayan süspansiyon kültürü içinde muhafaza edilerek yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım, düşük tekrarlanabilirlik neden EBS heterojen nüfus verir. Asma damla hücre kültürü ve mikro temelli EBS formasyonu oldukça tekrarlanabilir tanımlanan boyutlarda homojen EBS verim EBS oluşumu için diğer popüler teknikler vardır. Ayrıca, mikro tekniği daha az çaba ile agreganın çok sayıda elde edebilirsiniz. EBS içindeki hücrelerin farklılaşması dışı ve hücre içi mikroçevreden morfojenik ipuçları bir multiplex tarafından düzenlenir. Bir mon farklılaşma aksineolayer biçimi, EBS hücrelerin karmaşık montaj ve 17 oluşmasına arası sinyalizasyon için bir platform sağlar. İlginç bir şekilde, tek tek EBS yapmak için kullanılan pluripotent kök hücre sayısı hücrelerin kaderini etkileyen gözlenmiştir. 1000 hücre EB eritroid soy 20 doğru itilir ise, örneğin, insan EKH bir hematopoietik farklılaşma çalışmada 500 hücre EB myeloid doğru farklılaşmasını teşvik ettiği görülmüştür. Bir başka çalışmada, küçük EBS nöro-ektoderm farklılaşma 11, 17 doğru terfi büyük EBS ise endoderm farklılaşma tercih. Bu geçmiş çalışmalar kuvvetle bireysel EBS yapmak için kullanılan ESC / iPS hücrelerinin sayısı herhangi bir hücre tiplerine farklılaşma esaslı EBS etkilediğini göstermektedir. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, RPE doğru ayırt etmek eğiliminde EBS büyüklüğü etkisini aydınlatılamamıştır var hiçbir geçerli çalışmalar vardır. Bu çalışmanın amacı etkisini karakterize etmekRetina pigment epiteli (RPE iPS-) farklılaşma ve RPE soy yönelik farklılaşması için EBS yapmak için en uygun hücre sayısını belirlemek için - uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri üzerine EB boyutu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Bu deneyde, iPS hücreleri kültüre ve EBS gelen RPE soy içine ayırt. Kontrol boyutlarda EBS mikro plakalar kullanılarak oluşturulmuştur. Şekil 1, EB oluşumu görüldüğü gibi, mikro plakalar içinde homojen olduğu görülmüştür. Bu EBS sonra, (Şekil 2), toplandı ve 6-delikli plakalar üzerine plakalandı. RPE RPE işaretlerinin da klasik altıgen morfolojisi, pigmentasyon ve ifade ile tespit edilebilir. 12 haftalık kültür sonrası, 200 h?...

Watch this Scientific Journal Video about Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies at JoVE.com

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K Görüntüleme.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır. 

Video: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

Pluripotent kök hücre üretimi insan ilkel Germ hücreli benzeri hücre Embryoid organları yüzeyden astarlanmalıdır pluripotent adlı indüklenen

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...