Biz Atsushi Miyawaki oranlı metrik pericam mt ifade inşa bize sağladığı için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (DB) hibe GM081685 tarafından da desteklenmiştir.

1. Pericam mt Transfeksiyon ve Hücre hazırlanması. <ol><li> Levha HeLa hücrelerinde standart 6 kuyu kültür plaka yerleştirilen steril cam lamelleri transfeksiyon önce gece. </li><li> DNA / Lipofectamine 2000 kompleksleri üreticisi (Invitrogen) tarafından önerildiği gibi hazırlayın. Biz oranlı metrik pericam-mt ifade vektör 4 mg ve her bir kuyu için 0.5 ml Opti-MEM seyreltilmiş Lipofectamine 2000 10 mcL kullanın. Hücreleri ~% 70 konfluent transfeksiyon önce olmalıdır. </li><li> 1.5 mL antibiyotik olmadan aynı medya ile her bir kuyunun HeLa kültür ortamı (Dulbecco&#39;nun modifiye kartal orta,% 10 FBS, penisilin / streptomisin) değiştirin. </li><li> DNA / Lipofectamine kompleksleri, her iyi transfekte ekleyin. 37 o C,% 5 CO 2 hücre kültürü inkübatör 4 saat inkübe ile sallanan ve hafifçe karıştırın. </li><li> Antibiyotikler ile kültür ortamı ile antibiyotik ücretsiz medya değiştirin. Hücreleri görüntüleme 1-2 gün önce oranlı metrik pericam ifade etmek için izin verin. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition <ol><li> HeLa hücreleri ile bir lamel: 107mm NaCl, 7.2mm KCl, 1.2mm MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11.5mm glikoz,% 0.1 sığır serum albümin ve 20mm Hepes 7.2 görüntüleme çözümü ile uygun bir görüntüleme odasının içine yerleştirin. Laboratuvarımız Invitrogen Attofluor hücre odasına kullanır. Ters bir mikroskop aşamada görüntüleme odasının monte edin. </li><li> Faiz oranlı metrik pericam bir 40x (veya üstü) immersiyon yağı hedefi kullanarak ifade bir ya da daha fazla hücre içeren bir alan bulun. Biz oranlı metrik pericam 380 nm dalga photobleaching daha az dirençli olduğunu buldular ve böylece biz uygun hücreleri tanımlamak için bu dalga boyu kullanabilirsiniz. Şekil 1 &#39;de elde edilen görüntüler için, 1.3 sayısal diyafram ile Nikon Superfluor 40X objektif kullanıldı. Yüksek büyütme hedefleri de (60-100x) uygun olacaktır. Krom Teknoloji filtreler D380/30x kullanılan Tahrik olma filtreler (380 + / - 30 nm) ve D495/10 (495 + / - 5 mil), ışın dağıtıcı 505DCXR (505nm longpass) ve emisyon filtresi HQ535/50m (535 + / - - 25nm). Şekil 1 görüntüleri elde etmek için kullanılan mikroskop bir Roper Bilimsel Coolsnap HQ CCD kamera, Ludl MAC6000 hızlı filtre çarkı ve değiştirici, soğutmalı bir MetaFluor veri toplama ve analiz yazılımı ile donatılmış Nikon TE2000 inverted mikroskop oluşur. Bu protokol, uygun filtre ve oranlı metrik görüntü yakalama ve işleme yeteneğine sahip yazılımlar ile herhangi bir standart geniş alan mikroskobu adapte edilebilir. </li><li> 495 ve 380 nm filtreleri kullanarak çift uyarma için yazılımı kurun. Oranlı metrik pericam bağlayıcı Kalsiyum 495 nm&#39;de absorbans artar, böylece oranı, 495 nm/380 nm için ayarlanmış olmalıdır. Oranlı metrik pericam 415 nm 4 kalsiyum uyarma tepe vardır. Çoğu kalsiyum görüntüleme laboratuvarlarda her yerde, çünkü sadece bu protokolde 380 nm filtre kullanmanızı öneririz. 410 nm filtre varsa, 380 nm filtre için tercih edilir. </li><li> Sırayla 495 ve 380 nm alternatif heyecan verici görüntüler elde. Perfüzyon aparatı ile agonist uygulamadan önce en az 30 için başlangıç ​​kalsiyum düzeylerinin görüntüler elde. Her agonist için ek süre işaretleyin. Pozlama süreleri ve satın alma aralıkları agonist stimülasyon yanıt izlenen yarı-hızlı kalsiyum dinamikleri için hala yeterli zaman resolution.For Örneğin izin verirken, photobleaching önlemek için optimize edilmelidir görüntüleri Şekil 1B ve C Çok daha hızlı satın alma oranları her iki saniyede elde edildi ayrıca 6 mümkündür. Staurosporine uygulamadan sonra Uzun vadeli görüntüleme satın almalar arasında uzun bir zaman aralığı (30s) (Şekil 1 D ve E) ile satın alınmıştır. </li></ol> 3. Görüntü İşleme ve Analizi <ol><li> Deney tamamlandıktan sonra elde edilen görüntüler çevrimdışı analiz edilebilir. Kalsiyum düzeyleri değişiklikleri izlemek istediğiniz ilgi alanları (ROI) tanımlayın. Alanında boş bir alan içinde gerekirse arka plan çıkarmak için seçilen bir yatırım getirisi kullanın. Mitokondri oldukça hareketli ve dinamik olduğunu kaydetti ve uzun süre boyunca tek bir mitokondride tahminde olaylar her zaman mümkün değildir olmalıdır. Böylece, bazı hücre tipleri bu organel yüksek motilite dikkate alınarak, ROI seçimi dikkatle izlenmelidir olmalıdır. Ayrıca, Şekil 1, çeşitli uyaranlara heterojen mitokondri yanıt kanıtlandığı gibi. Verileri çevrimdışı analiz etmek ve bir kare-kare bazında yerleştirme RO1 izlemek için bu nedenle önemlidir. Son derece hareketli mitokondri mitokondriyal kalsiyum ölçüm ayrıntılı bir açıklaması başka bir yerde 7 tarif edilmiştir. </li><li> ROI Elde Edilen oranı ölçümleri, Excel ya da benzer graphingsoftware ithal edilebilir. Veriler tek bir hücre ya da tek mitokondri mitokondriyal kalsiyum düzeyleri değişiklikleri temsil eden bir eser olarak sunulan veya fl ortalama olabilirbirkaç ROI uorescence sinyalleri. Ayrıca, Fas ligand 8 apopitozu geçiren lenfositlerin bir nüfusa ortalama mitokondriyal kalsiyum seviyelerini ölçmek için bu tekniği kullandım . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. (A) oranlı metrik-pericam mt hücre içi lokalizasyonu. Bu ilk görüntü oranlı metrik-pericam-mt ifade canlı HeLa hücre gösterir. Ikinci görüntü mitokondri seçici boya MitoTracker Kırmızı CMXRos floresan boyama gösterir. (B) Birleştirilen görüntüyü sarı floresan oranlı metrik-pericam-mt ve MitoTracker floresan co-lokalizasyon göstermektedir. Pseudocolor oranı (495:380 nm), 10 mM ATP ile tedavi mt-oranlı metrik pericam ifade 4 HeLa hücrelerinin görüntüleri bir dizi (C) ilgi bölgesi (ROI) mitokondriyal kalsiyum düzeylerindeki değişikliklerin Niceleme Pseudocolor oranı (495:380 nm) mt ifade eden bir HeLa hücre görüntüleri (B) (D) 10 mM ATP ile tedavi edilir. Serisi belirtilen oranlı metrik pericam 0.5 mcM staurosporine ile tedavi edildi. Bireysel mitokondride kalsiyum yanıt olarak heterojenite belirgin yanı sıra 60 dakika mitokondri önemli parçalanma. Diğerleri kalsiyum seviyesi önemli değişiklikler (sarı ok başı) görünmüyor, ancak bazı mitokondri, kalsiyum (beyaz ok başı) salınım artışlar var. Apoptozis indüksiyonu sonra tek bir HeLa hücre küresel mitokondriyal kalsiyum düzeyleri artar (E) Niceleme 0.5 mcM staurosporine.

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death:+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2++uptake+in+apoptosis.">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2++concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein.">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li><li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis.">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li><li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binds+to+inositol+(1,4,5)+trisphosphate+receptors,+amplifying+calcium-dependent+apoptosis.">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li><li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH:+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis.">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li></ol>

Burada mitokondriyal hedefli oranlı metrik pericam kullanarak mitokondriyal kalsiyum ölçmek için çok basit bir yöntem mevcut. Olarak kabul edilebilir sinyal-gürültü oranı ile kolayca HeLa hücreleri bireysel mitokondri görmek mümkündür, hiçbir deconvolution standart widefield optiği kullanarak, Şekil 1A gösterilmiştir. Bu zaman yapışık konfokal mikroskopi veya diğer özel ekipman için gerek kalmayabilir HeLa hücrelerinde, kültür hücreleri gibi, önemli ölçüde düzleştirmek çünkü. Biz poli-lizin kaplı lamelleri 8 yapıştırılır Jurkat hücrelerinde benzer sonuçlar bulduk. Boyalar kullanarak metodolojileri aksine, non-invaziv oranlı metrik pericam (Şekil 1E) gibi genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri kullanarak saat mitokondriyal kalsiyum düzeylerinin izlenmesi de mümkündür. Hücre ölümü sırasında mitokondriyal kalsiyum analiz ederken bu özellikle önemlidir. Ayrıca, apoptotik süreci sırasında fisyon / mitokondri parçalanması görselleştirmek için de mümkündür. Şekil 1D ve E görüldüğü gibi, staurosporine tedavi, 20 dakika mitokondri hangi doruklarına seçin alt popülasyonlar kalsiyum yavaş bir artışa neden olur. Kalsiyum düzeyleri tedavi 2 saat sonra tekrar gitmeden önce tekrar mitokondriyal parçalanma ile eş zamanlı aşağı gidin. Bu Fura-2 9 kullanarak ölçülen staurosporine tedavi ile indüklenen sitozolik kalsiyum yavaş dalgaları ile tutarlıdır. Böylece, önemli kinetik bilgiler statik ölçümler istihdam yöntemleri ile mümkün değildir elde edilebilir. Oranları ve kalsiyum konsantrasyonları Şekil 1&#39;de sunulan olmasına rağmen, mutlak kalsiyum düzeyleri 4, 10 hesaplamak için in situ sensörü kalibre etmek mümkündür. Dikkate alınması gereken önemli bir ihtar oranlı metrik pericam pH 4, 10 duyarlı olmasıdır . Hem sitozolik ve mitokondriyal pH seviyeleri apoptozis 11 sırasında dramatik bir biçimde değiştirebilir, bu önemli bir husustur. Izole mitokondri ifade pericam pH Titrasyon göstermek artan [H +] 410 nm eksitasyon, aynı anda hem mitokondriyal kalsiyum ölçmek için kullanılabilir bir özellik tarafından uyarılmış emisyon üzerinde çok az etkisi ile artar, 495 nm&#39;de heyecan pericam emisyon ve pH 12. Böylece, seçici 410 nm eksitasyon emisyon izleme için daha az endişe ile pH olmayan ratiometrically monitör mitokondriyal kalsiyum için bir araç sağlar. Son olarak, burada sunulan protokol, böylece bu tekniği en laboratuarlara erişilebilir hale yaygın kullanılan filtreler ile standart bir epifluorescent mikroskop erişim gerektirir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>MEA53310</td>
<td>Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices, Inc</td>
<td>Metafluor</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Attofluor cell chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>A-7816</td>
<td>Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>11668-019</td>
<td>Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies </td>
</tr>
<tr>
<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>M7512</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring dynamic changes in mitochondrial calcium levels during apoptosis using a genetically encoded calcium sensor

Çeşitli uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu Dinamik değişiklikler, proliferasyon, diferansiyasyon ve apoptosis 1 gibi birçok hücresel süreçleri düzenler. Mitokondri, kalsiyum birikimi apoptozis sırasında serbest pro-apoptotik faktörlerin sitoplazmada 2 içine mitokondri teşvik etmektedir. Bu nedenle, doğrudan canlı hücrelerde apoptozis sırasında in situ mitokondriyal kalsiyum ölçmek için ilgi . Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme çift uyarma oranlı metrik ve oranlı metrik olmayan sentetik kalsiyum gösterge boya ile yüklü hücreler, hücre içi kalsiyum sinyal çeşitli yönlerini incelemek için güvenilir ve çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Sitozolik kalsiyum akıları ölçerek, bu teknikleri kullanarak oldukça basittir. Ancak, rhod-2 ve rhod-FF gibi sentetik kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam hücreler intramitochondrial kalsiyum seviyelerini ölçmek daha zor. Mitokondri hedeflenen Sentetik göstergeleri mitokondriyal kalsiyum tekrarlayan artar yanıtları köreldiğini ve mitokondriyal morfolojisi 3 bozabilir. Ayrıca, sentetik göstergeler, uzun vadeli denemeler için uygunsuz hale getiren birkaç saat içinde mitokondri sızıntısı eğilimindedir. Böylece, mitokondriye hedefleyen yeşil floresan protein (GFP) 4 veya aequorin 5 dayalı genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri, mitokondriyal kalsiyum dinamikleri ölçümü önemli ölçüde kolaylaştırmıştır. Burada, farklı uyaranlara tepki olarak mitokondriyal kalsiyum akıları gerçek zamanlı ölçümü için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Seçici mitokondri hedeflenen &#39;oranlı metrik pericam&#39; floresan mikroskopi yöntemi dayanıyor. Oranlı metrik pericam dairesel karılmış sarı floresan protein ve kalmodulin 4 bir füzyon dayalı bir kalsiyum göstergesi. Oranlı metrik pericam kalsiyum bağlayıcı emisyon spektrumu, yaklaşık 515 nm zirveleri, değişmeden kalırken, 415 nm ile 494 nm eksitasyon zirve kaymasına neden olur. Oranlı metrik pericam ~ 1.7 mcM 4 in vitro sabit bir disosiasyon tek bir kalsiyum iyonu bağlar. Oranlı metrik pericam Bu özellikler, mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve uzun vadeli değişimler miktarının izin verir. Ayrıca, bu metodoloji, yaygın olarak kullanılan filtre setleri ile standart bir geniş alan kalsiyum görüntüleme mikroskop adaptasyonu açıklar. Iki ayrı agonistleri purinerjik agonist ATP ve apoptozis indükleyici ilaç staurosporine kullanarak, saat saniye zamansal çözünürlüğe sahip mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri izlemek için bu yöntem uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondrial fizyon / parçalanma ölçmek için de yararlı olduğunu göstermektedir. Böylece, özellikle de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondriyal kalsiyum dinamikleri sürekli uzun vadeli ölçümü için uygundur.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor at JoVE.com

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

23.8K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Video: Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Biyoloji

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

Kortikal nöronlar kullanarak Fura-02:00 Kalsiyum Görüntüleme

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

İnsan T lenfositleri, Kalsiyum-Film Aktive Kalsiyum Tüm Hücre Kayıt (Kerek) Akımlar

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

İleri Genetik Ekran Kullanarak Transgenik Kalsiyum Reporter Aequorin Kalsiyum Sinyalyeni Hedefleri Belirlemek için

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...