Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) projesi hibe 31003A_135649, 31003A_153457 ve 31003A_172994 (için JVS) ve Leopoldina dostluk LPDS 2011-16 (için BS) tarafından finanse edildi. Bu eser "Mikroskobu görüntüleme Merkezi" (MIC) Bern Üniversitesi optik kurulumları benefitted.

Tüm hayvan iş hayvan deney için Kanton Komitesi tarafından onaylanmış ve federal kurallarına göre yapılır.
1. anestezi fare
<ol><li>Önlük ve eldiven dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymek.</li>
	<li>Ketamin, xylazine ve serum 20 mg/mL ve 1 mg/mL, bir çalışma konsantrasyonu sırasıyla karıştırın. Çalışan hisse senedi intraperitoneally enjekte (IP) 8-10 µL/g fare de. Fare kafesin içine yerleştirin. Not: Bu protokol ile bir C57BL/6 arka plan 6 - için 40-hafta-yaşlı erkek ve dişi fareler için test edilmiştir.</li>
	<li>Acepromazine çözüm 2.5 mg/mL, hazırlamak ve 30 µL ı.p., 15 dk sonra ketamin-xylazine enjeksiyon (75 µg/fare) enjekte.</li>
	<li>5-15 dakika sonra yeterli anestezi ve analjezi için kontrol ederek refleksleri, örneğin, para çekme refleks pençe veya Korneal refleks için kontrol edin.</li>
	<li>Refleksleri için yaklaşık her 30 dakika deneme süresi sırasında kontrol. Subkutan ketamin/xylazine enjekte 1,5 µL/g fare, her 60 dk veya önceki Eğer refleksleri olumludur. Not: İnhalasyon anestezi isoflurane gibi fare fiksasyonu nedeniyle bu protokolü ile kullanılamaz.</li>
</ol>2. çalışma alanından kürk kaldırma
<ol><li>Tıraş kabaca üzerinden 5 mm Kaudal ağız çene doğru her iki kulak üzerinde uzanan ön ayakları doğru genişleyen bir alan tıraş için kullanın.</li>
	<li>Traş alana bir pamuklu çubukla ile saç dökücü krem uygulayın. Dikkatle ve iyice 3 dakika sonra örneğin, ıslak mendil ile silerek kaldırın.</li>
</ol>3. Sahne Alanı'nda Mouse fix
Not: Bu protokol için kapak paket fişi (bir sahne bir vida ile bağlı, diğer kalıcı olarak üzerine Sabit); iki serbestçe ayarlanabilir sahipleri ile donatılmış özel bir sahne (şekil 1) kullanır. ayarlanabilir stereotaksik kulak çubuklarını; bir vida ile sıkılır bir dize; serbestçe ayarlanabilir bir metal halka Isıtma; ve fare gövde yerleştirmek için yükseltilmiş içilir. Bu aşamada, eklenen bir stereotaktik sahibi ve exteriorized SMG tutan alt kapak SLIP desteği ile popliteal lenf nodu aşamasından değiştirilir. Ayrıntılı planlar veya Sahne Alanı'nın tırnak talep üzerine temin edilmektedir.
<ol><li>Sahne Isıtma ring için sahipleri ve çıkarılabilir kapak fişi tutucu kaldırarak hazırlayın. Kulak çubuğu sahipleri ve sabit kapak fişi tutucu vidayı gevşetin. Bir parçası olarak kullanılan odada fare için Sahne Alanı'nın merkezi alanına gazlı bez bant.</li>
	<li>Yapıştırıcı ((Bu alt kapak cam olacak) bir silindirik metal tutucu tepesine bir 20 mm çapında cam takmak için Malzemeler tablobkz:). Bir 25 mm cam (Bu üst kapak cam olacaktır) düz metal tutucu altına tutkallayın. Kapak gözlük yaklaşık 2-3 mm metal sahipleri ile örtüşme ve cam kalan yağ ve tutkal serbest kalmasını sağlamak.</li>
	<li>Fareyi üzerine gazlı bez, gergin dizeye dikey sırtında kulak barlar arasında ortalanmış kafa yerleştirin.</li>
	<li>Üst ekstremite cerrahi bant ile sahne alanı'na fare düzeltmek.</li>
	<li>Ardından, dize üst ön kesici kanca ve çene bir yatay konuma ulaşana kadar sıkın. Açılı bir eğri forseps biraz dil nefes kolaylaştırır ağzından dışarı çıkarmak için kullanın.</li>
	<li>Sıkı bir şekilde, ama zorla değil, kuyruk çekin ve Sahne Alanı'na teyp.</li>
	<li>Yaklaşık 30 ° açı bar ve Sahne Alanı'nın kenar arasında elde etmek için kulak çubuklarını hizalayın. Bu açı emin olmak için sağ ve sol 30 derecelik açıyla bir yaprak kağıda çizmek için bir üçgen cetvel kullanın ve şeffaf sahne alanı sahipleri buna göre hizalamak için kağıt üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Çene çene immotile kadar içe doğru hareket ettirerek aynı anda sol ve sağ bar kulak çubuklar arasındaki düzeltmek ve vidayı sıkın. Göğüs hareketi öncesinde, sırasında ve çene sabitleme sonra gözlemlemek. Azaltılmış veya barlar boyun, çene kemiği değil; giderilen nefes yok gösterir Bu durumda, hemen sabitleme yordamı yineleyin.</li>
	<li>Isıtma fareyi örneğin, yakın bir Isıtma lambası ve/veya sahne alanı altında bir Isıtma yastığı yerleştirerek sağlar.</li>
</ol>4. cerrahi maruz kalma bir Stereomicroscope kullanarak Tükürük bezi
Not: Aşağıdaki adımları stereomicroscope, fine forseps ve Cerrahi makas kullanılmasını gerektirir. Yordamı terminal olduğundan, steril çalışma koşulları sağlamak gerekli değildir. Etanol temizlik aletleri yeterli.
<ol><li>Yaklaşık 15 mm Kaudal ağız ve çene hattı 5 mm medial deride hafif bir çıkıntı yaşar sağ SMG LOB yaklaşık konumunu bulun. Çıkıntı ortasında küçük cilt kapağı kaldırın ve oluşturmak için ve açılış yaklaşık 5 mm uzunlukta kesip.</li>
	<li>Hemen bir 4 mm-yüksek halka vakum yağ kesme çevreleyen cilt üzerinde uygulayın. (Bir vakum şırınga yağ dolu bir körelmenin 25 G Hipodermik İğne ile kullanın).</li>
	<li>Yağ halka doku operasyon sırasında nemli kalır emin olmak için serum fizyolojik ile doldurun.</li>
	<li>Stereomicroscope altında aşağıdaki yordamı kullanarak bağ dokusu bozabilir: bir iyi forseps bağ dokusu SMG için doğrudan bağlı bir parça sıkıca tutun ve bu Yırtığı kadar distal bağ dokusu çekmek için ikinci bir forseps kullanır. Bazı bağ dokusu SMG için bağlı kalmasını sağlamak; işleme sağlar beri bu arzu edilir. Bu kanama neden olur bu yana Forseps ile bezi kendisi dokunmayın.</li>
	<li>Tekrarlayın bağ dokusu ilk bezinin üstüne sonra (arasında SMG sağ ve sol LOB) medial tarafında dağıtmak, bu hareket. Hapı submandibular bezi ayırmayın.</li>
	<li>Lateral bağ dokusu çevresinde SMG (Kaudal, distal rostral için için için medial) saat yönünün tersine kaldırmak devam edin.</li>
	<li>Kan akımı, efferent Lenfleribile ve tükürük kanalı, tek bir pakette bezinin kafatası sitesinde bulunan bulunan, değil yırtıldı emin olun.</li>
	<li>Bir kez lateral bağ dokusu bozulur, forseps Kaudal SMG Kaudal sonu yukarı kaldırmaya SMG sonuna kadar bağlı bağ dokusu çekmek için kullanın. Aşağıda SMG LOB bağ dokusu bozabilir Kaudal başlayan ve rostral sonuna doğru hareket.</li>
	<li>SMG tüm sitelere bağ dokusu (büyük besleme/boşaltma kan damarları ve WD rostral sitesiyle hariç) kaldırılana kadar devam edin.</li>
</ol>5. sabitleme bezi
<ol><li>Tuz tutan yağ halka en az 4 mm (bkz. Adım 4.2) yüksek ve değil sızıntı olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Yükleme alt kapak cam (bkz. Adım 3.2) metal çubuk yüksekliği ayarlanabilir onun sahibine ekleme tarafından. Kapak notu sahibi olduğunu konuma ayarlanır ve Sahne Alanı'na bağlı yağ halka dokunmaz emin olun. Kaudal yön sahibinden fare, yaklaşık 60 ° açılı kapak kabaca üçte kapsayan kayma ile (Kaudal ve distal parça) maruz LOB getirin. Cam kadar alt bezi ile temas.</li>
	<li>Yeni tuzlu su deposu oluşturmak için kapak cam üstüne yağ halka tamamlayın.</li>
	<li>Dikkatle üstüne kapak notu SMG LOB Forseps ile ona bağlı bağ dokusu dokunmadan sadece çek (org yukarı bakacak şekilde alt site ile çevrilmiş).</li>
	<li>Yağ yüzük bile bir yüksekliği en az 4 mm ve kaçak değil emin olun. Gerekirse, şırınga 30 G kullanarak tuzlu su deposu dolum salin ile dolu.</li>
	<li>Üst kapak cam için cam tutucu olduğunu konumunda olduğundan emin olun. Vida ile 25 mm üst kapak cam metal sahibi sahibine bağlamak için kullanın. Ayarlanabilir vida yuvasının kapağı cam SMG ortada ortalanacak şekilde konumlandırmak için kullanın.</li>
	<li>Doğrudan SMG kişiler kadar üst kapak cam düşürmek için ayarlanabilir tutucu vidaları kullanın. Şekli ve bu adımı sırasında bezinin boyama gözlemlemek. Bezi yüzey alanı büyük görünür veya boyama (örneğin pembe beyaz), hemen değiştirir kapak cam SMG basıncı azaltmak için daha yüksek bir konuma koymak.</li>
	<li>Kaçakları için tuzlu su deposu hava kabarcıkları ve/veya damla serum havzanın dışında bakarak kontrol edin. Bir sızıntı veya hava kabarcık algılanırsa, kaldırmak kapak fişleri ve tüm yağ ve--dan adım 2 yeniden başlatın.</li>
	<li>Vida tüm fiksasyon vidaları kapatın.</li>
</ol>6. Isıtma yüzük ve sıcaklık probu sabitleme
<ol><li>Göle bir sıcaklık probu takın ve yakın bezi getirin, daha sonra sahneye sonda tel bant.</li>
	<li>Bir yağ yüzük (yağ yüzük çapı Isıtma yüzük çapı için karşılık gelmelidir) Merkezi SMG ile üst kapak notu uygulanır. Isıtma yüzük kapak notu üstüne getirin ve yağ ile kapatın. Isıtma yüzük sahneye boru bant.</li>
</ol>7. görüntüleme
Not: Bir akort Ti:Sa lazer ve su-daldırma 20 X veya 25 X hedefleri ile floresan mikroskop ile donatılmış bir dik iki fotonlu mikroskop sistemi kullanıyoruz. Doku drift düzeltilmesi gerçek zamanlı satın alma sırasında bir otomatik sahne ve VivoFollow19kullanarak uygulanabilir. Bu resim alma kararlılığını geliştirir, ancak gerekli değildir.
<ol><li>Dik mikroskobu sistemi mikroskop üreticisi tarafından sağlanan bir uygun yazılımı kullanarak açın. Ti:Sa lazer 780-900 nm uyarma dalga boyları için ayarlayın.</li>
	<li>Isıtma boru Isıtma Yüzük'e bağlanın. Peristaltik su pompası SMG ısıtmak için halka aracılığıyla sıcak su (80 ° C su banyosu içinde boru parçası batış tarafından ısıtmalı) dolaşır.</li>
	<li>Bir dijital termometre sıcaklık probu takın. Sıcaklık değil 35-39 ° c arasında ise Peristaltik pompa hızını ayarlayın Ne kadar hızlı pompa çalışır, sıcak nesne alır ve ahlak bozukluğu çok yönlü.</li>
	<li>Resim alma işlemine geçmeden önce kan akım hızları görsel bir denetimi gerçekleştirin. Dikkatle lökosit geçit ince kılcal damarlar yoluyla veya floresan dextran enjeksiyon kontrol edin. Not: kan akımı fizyolojik olduğunda intravenöz enjekte floresan dextran hemen tüm SMG damarlara doldurur. Bu hemen hemen her zaman bu yordamdaki durumdur.</li>
	<li>Bağışıklık hücreleri, görüntüleme derinliği genellikle 2nd harmonik üretimi sinyal ile tanımlanan SMG yüzeyinin altında 20-150 µm arasında uygulamaktır. 150-300 µm görüş alanı kayıt görüntü yığınları ile yaklaşık 512 x 512 veya daha yüksek pixel kararlılık ve z-derinliklerine 20-60 µm ile 2-4 µm görüntüler arasında aralığını. Yığın edinme her 20-30 s 20-60 dk toplam süresi için yineleyin.</li>
	<li>Minimum ve maksimum sıcaklık düzeyleri bir görüntü sırası edinimi sonra kontrol etmek için dijital termometre kullanın. Minimum veya maksimum 37 ± aralığı içinde değilseniz görüntü sırası atmak 2 ° C. Amaç görüntü dizileri arasında daldırma için su dolum.</li>
	<li>Görüntüleme oturumun sonunda, CO2 boğulma anestezi altında tarafından fareler ötenazi. Not: Bu hayvan deney İsviçre federal yönergelere uygun olarak. diğer kurallar ötenazi için başka bir yerde geçerli olabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive+System.">Digestive System.</a> Digital Histology. , 101-121 (2005).</li><li>Carpenter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Saliva+in+the+Oral+Processing+of+Food.">Role of Saliva in the Oral Processing of Food.</a> Food Oral Processing. , 45-60 (2012).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).</li><li>Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+CD66a+and+CD117+in+the+mouse+submandibular+gland.">Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland.</a> Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).</li><li>Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+podoplanin+in+the+mouse+salivary+glands.">Expression of podoplanin in the mouse salivary glands.</a> Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).</li><li>Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+salivary+gland+function+by+autonomic+nerves.">Regulation of salivary gland function by autonomic nerves.</a> Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).</li><li>Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Dendritic+Cells+in+Normal+Human+Salivary+Glands.">Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).</li><li>Hofmann, M., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+promotes+accumulation+of+a+unique+memory+CD8+T-cell+population+in+murine+salivary+glands.">E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).</li><li>Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+tertiary+lymphoid+structures,+autoimmunity,+and+exocrine+dysfunction+in+a+novel+model+of+salivary+gland+inflammation+in+C57BL/6+mice.">Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).</li><li>Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+activation+of+the+RANK+signaling+receptor+induces+murine+salivary+gland+tumors.">Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+A+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).</li><li>Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy.">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#181;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:Al_2O_3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#181;m in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier.</a> Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).</li><li>Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+3D+in+vivo+intravital+microscopy+images+with+an+iteratively+refined+soft-tissue+model+for+immunology+experiments.">Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments.</a> Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cervical+spinal+cord+window+preparation+allows+for+two-photon+imaging+of+T-Cell+interactions+with+the+cervical+spinal+cord+microvasculature+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 8, 406 (2017).</li><li>Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), e52607 (2015).</li><li>Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CD4+T+cell+interstitial+migration+in+the+inflamed+dermis.">Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis.</a> J Vis Exp. (109), e53585 (2016).</li><li>Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).</li><li>Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node.">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> J Vis Exp. (60), e3720 (2012).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).</li><li>Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+imaging+subcellular+structures+in+live+mice+expressing+fluorescent+proteins.">Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins.</a> J Vis Exp. (79), e50558 (2013).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li><li>Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+actions+of+distinct+nonmuscle+myosin+II+isoforms+drive+intracellular+membrane+remodeling+in+live+animals.">Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals.</a> J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).</li><li>Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannulation+of+the+mouse+submandibular+salivary+gland+via+the+Wharton's+duct.">Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct.</a> J Vis Exp. (51), e3074 (2011).</li><li>Chen, G. Y., Nu&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+Sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage.</a> Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).</li><li>McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+causes+of+variation+of+body+temperature+in+mice.">Some causes of variation of body temperature in mice.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).</li><li>Baumgart, K., Wagner, F., Gr&#246;ger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+metabolic+effects+of+hypothermia+and+inhaled+hydrogen+sulfide+in+anesthetized+and+ventilated+mice.">Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice.</a> Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).</li><li>Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+area+of+the+murine+aorta+linearly+increases+with+increasing+core+body+temperature.">Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature.</a> Int J Hyperth. , 1-13 (2017).</li><li>Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CMV+infection+induces+the+continuous+production+of+mucosal+resident+T+cells.">Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells.</a> Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).</li><li>Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li><li>Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).</li><li>Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+interactive+two-photon+photoconversion+of+recirculating+lymphocytes+for+discontinuous+cell+tracking+in+live+adult+mice.">Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice.</a> J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).</li><li>Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).</li><li>Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging.">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).</li><li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+lipid+bilayers+with+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Bu iletişim kuralı için in vivo düşsel bezlerinin fare çene ve sublingual tükürük kez İmmünoloji alanında kullanılan dik doğrusal olmayan mikroskobu kullanarak basit bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntem diğer ekzokrin bezleri baş ve boyun bölgesinde görüntüleme için adapte edilebilir. Örneğin, laboratuarımıza gözyaşı bezinin görüntüleme (gösterilmez) benzer bir şekilde sahne aldı.
Kaza sonucu doku hasarı oluşabilir SMG etrafında bağ dokusunu bu Pr...

Tükürük gıda yağlamak, ağız yolu Mukozal yüzeylerin korumak ve sindirim enzimleri gibi antibakteriyel maddeler1,2teslim ekzokrin bezleri tarafından salgılanan. Sözlü submukoza içinde serpiştirilmiş küçük tükürük bezleri yanı sıra göre onların konumu1,2büyük bezleri parotid, dil ve çene, tanımlanan üç ikili kümesi vardır. Epitel hücreleri, Piramit şeklinde düzenlenen şişesi şeklindeki kesesi (acini) veya myoepithelial hücreleri ve bir membran, çevrili demilunes tükürük1seröz ve müköz bileşenleri salgılar. Acini akmak içine onlar sonunda bir tek boşaltım kanalı1' e katılmak kadar hangi çizgili kanalları birleştirmek ara kanalları dar luminal space. SMG ana boşaltım kanalı Wharton'ın kanal (WD) denir ve sublingual caruncle3,4açılır. SMG epitel yuvası bu nedenle son derece arborized bir yapı a bohça-in üzüm1,5,6benzeyen manifold terminal bitiş noktaları ile temsil eder. SMG interstitium kan ve lenf damarları parasempatik sinirler8 ve hücre dışı matriks5içeren bağ dokusu7 içinde gömülü oluşur. Normal insan ve kemirgen tükürük bezleri de T hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreler9immünglobulin salgılar plazma hücreleri tükürük9içine,10(IgA) yanı sıra, içerir. Sağlığı ve hastalıkları çok yönlü işlevleri nedeniyle, SMG Biyolojik araştırma diş hekimliği4, İmmünoloji11, Onkoloji12, fizyoloji8ve hücre biyolojisi dahil olmak üzere, birçok alan için ilgi bir konudur 3.
Görüntüleme dinamik hücresel süreçler ve etkileşimleri, Biyolojik araştırma13,-14güçlü bir araçtır. Saçılma veya birden çok fotonlar emilimini örnek tarafından güvenen, doğrusal olmayan optik (NLO), temel derin doku görüntüleme ve yenilikler inmicroscopes gelişimini doğrudan hücresel süreçler karmaşık doku13 incelemek için izin verdi ,15. Birden çok fotonlar emilimini düşük enerji fotonlar, hangi sınırları fluorophore uyarma için odak düzlem tarafından teslim toplam uyarma enerji gerektirir ve böylece daha derin doku penetrasyonu düşük duyarlilik ve odak dışından gürültü ile sağlar uyarma13,15. Bu ilke İki fotonlu mikroskobu (2 PM) tarafından istihdam ve floresan örneklerin en fazla 1 mm15,16derinliklerinde görüntüleme sağlar. Kurulumları kullanıcı dostu ve güvenilir hale gelmiştir piyasada bulunan 2 de dikkatli bir şekilde ortaya çıkarmak ve imzalat fareler, hedef organ özellikle görüntüleme serisi zaman sukut için stabilize etmek üzere intravital görüntüleme için büyük sorun olduğunu. Veri toplama olmuştur sonra dijital drift düzeltme için birkaç yöntem17,18 yayınlandı ve "VivoFollow", gerçek zamanlı kullanarak yavaş doku drift zıt bir otomatik düzeltme sistemi en son geliştirdiğimiz bir Bilgisayarlı sahne19. Bu seçenek ancak, yüksek kaliteli doku hareket, özellikle hızlı hareketler nefes ya da kalp atışı19neden en aza indirmek için görüntüleme için hala önemlidir. Hazırlık ve stabilization yordamlar omurilik20, karaciğer21, Cilt22, akciğer23ve lenf nodu24de dahil olmak üzere birden fazla organ için yayınlanmıştır. Ayrıca, fare Tükürük bezi görüntüleme modellerinde gelişmiş3,25 edilmiş ve daha yüksek çözünürlüklü bir ters mikroskop Kur-26, SMG uyarlanmış antikorundan intravital görüntüleme için rafine 27 , 28.
Burada, İmmünoloji alanında intravital görüntüleme için yaygın olarak kullanılır dik doğrusal olmayan mikroskobu kullanarak fare SMG intravital görüntüleme için pratik ve uyarlanabilir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, popliteal lenf nodu hazırlıkları kullanılan yaygın istihdam immobilizasyon sahne değiştiren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Narketan 10 %&#160; (Ketamine) 20ml (100 mg/ml)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>3605877535982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>680538150144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline NaCl 0.9%</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3535789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml)</td>
			<td>Fatro</td>
			<td>6805671900029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9818L</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removal cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>4002448090656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>Durapore (3M)</td>
			<td>1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>Durapore (3M)</td>
			<td>1538-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue Ultra gel, instantaneous glue</td>
			<td>Pattex, Henkel</td>
			<td>4015000415040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1343/ 631-1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease for laboratories 60 g glisseal N</td>
			<td>Borer (VWR supplier)</td>
			<td>DECO514215.00-CA15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T )</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T )</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Migros</td>
			<td>617027988254</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Gazin 5 x 5 cm</td>
			<td>Lohmann and Rauscher</td>
			<td>18500</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red dextran 70kDa</td>
			<td>&#160;Molecular Probes</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade Blue dextran 10kDa</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>D1976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td>TrimScope I and II</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>or other water immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>95969077651</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy

Submandibular Tükürük bezi (SMG) üç büyük tükürük bezleri biridir ve biyolojik araştırma, hücre biyolojisi, Onkoloji, diş hekimliği ve İmmünoloji dahil olmak üzere birçok farklı alanlar için ilgi olduğunu. SMG salgı epitel hücreleri, myofibroblasts, endotel hücreleri, sinirler ve hücre dışı matriks ekzokrin bir bezdir. Fare ve fare SMG dinamik hücresel süreçler daha önce görüntüsü, çoğunlukla kullanarak çoklu foton mikroskop sistemleri ters. Burada, cerrahi hazırlanması ve istikrar için in vivo düşsel dik çok foton mikroskop sistemleri ile imzalat farelerde fare SMG için basit bir protokol açıklayın. Endojen temsilcisi intravital görüntü kümesi sunmak ve adoptively floresan hücreleri, kan damarları veya tükürük kanalları ve fibriler kollajen görselleştirmek için ikinci harmonik üretimi etiketleme de dahil olmak üzere aktarılır. Özetle, bizim iletişim kuralı İmmünoloji alanında intravital görüntüleme için yaygın olarak kullanılan dik mikroskobu sistemlerindeki fare tükürük bezleri cerrahi hazırlanması için izin verir.

Bu iletişim kuralı neredeyse tüm dorsal veya ventral yan SMG görüntüleme sağlar. Görüş alanı genellikle biraz SMG hücresel kompozisyon4farklıdır sublingual Tükürük bezi de içerir. Her iki bezleri tarafından fibriler kollajen kapsüllenir ve loblar bölünmüştür. Çoğu 2 de fibriler kollajen etiket içermeyen bir görüntüsünü 2nd harmonik sinyali ölçerek sistemleri oluşturabilir ancak genellikle floresan moleküller hücre ve...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy at JoVE.com

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

Biz cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve fare submandibular Tükürük bezi dik intravital mikroskobu kullanılarak intravital görüntüleme için stabilize etmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı diğer ekzokrin bezleri için baş ve boyun bölgesinin fareler ve diğer küçük kemirgen kolayca uyarlanabilir.

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Görüntüleme.  University of Bern. Biz cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve fare submandibular Tükürük bezi dik intravital mikroskobu kullanılarak intravital görüntüleme için stabilize etmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı diğer ekzokrin bezleri için baş ve boyun bölgesinin fareler ve diğer küçük kemirgen kolayca uyarlanabilir.

Video: Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Kasık lenf düğüm intravital Mikroskopi

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Tükürük bezi işlevi farelerde ölçülmesi için bir yöntem

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...