Name: preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy
Uploaded: 2018-05-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy at JoVE.com

Bu eser İsviçre Ulusal Vakfı (SNF) projesi hibe 31003A_135649, 31003A_153457 ve 31003A_172994 (için JVS) ve Leopoldina dostluk LPDS 2011-16 (için BS) tarafından finanse edildi. Bu eser "Mikroskobu görüntüleme Merkezi" (MIC) Bern Üniversitesi optik kurulumları benefitted.

Tüm hayvan iş hayvan deney için Kanton Komitesi tarafından onaylanmış ve federal kurallarına göre yapılır.
1. anestezi fare
<ol><li>Önlük ve eldiven dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymek.</li>
	<li>Ketamin, xylazine ve serum 20 mg/mL ve 1 mg/mL, bir çalışma konsantrasyonu sırasıyla karıştırın. Çalışan hisse senedi intraperitoneally enjekte (IP) 8-10 µL/g fare de. Fare kafesin içine yerleştirin. Not: Bu protokol ile bir C57BL/6 arka plan 6 - için 40-hafta-yaşlı erkek ve dişi fareler için test edilmiştir.</li>
	<li>Acepromazine çözüm 2.5 mg/mL, hazırlamak ve 30 µL ı.p., 15 dk sonra ketamin-xylazine enjeksiyon (75 µg/fare) enjekte.</li>
	<li>5-15 dakika sonra yeterli anestezi ve analjezi için kontrol ederek refleksleri, örneğin, para çekme refleks pençe veya Korneal refleks için kontrol edin.</li>
	<li>Refleksleri için yaklaşık her 30 dakika deneme süresi sırasında kontrol. Subkutan ketamin/xylazine enjekte 1,5 µL/g fare, her 60 dk veya önceki Eğer refleksleri olumludur. Not: İnhalasyon anestezi isoflurane gibi fare fiksasyonu nedeniyle bu protokolü ile kullanılamaz.</li>
</ol>2. çalışma alanından kürk kaldırma
<ol><li>Tıraş kabaca üzerinden 5 mm Kaudal ağız çene doğru her iki kulak üzerinde uzanan ön ayakları doğru genişleyen bir alan tıraş için kullanın.</li>
	<li>Traş alana bir pamuklu çubukla ile saç dökücü krem uygulayın. Dikkatle ve iyice 3 dakika sonra örneğin, ıslak mendil ile silerek kaldırın.</li>
</ol>3. Sahne Alanı'nda Mouse fix
Not: Bu protokol için kapak paket fişi (bir sahne bir vida ile bağlı, diğer kalıcı olarak üzerine Sabit); iki serbestçe ayarlanabilir sahipleri ile donatılmış özel bir sahne (şekil 1) kullanır. ayarlanabilir stereotaksik kulak çubuklarını; bir vida ile sıkılır bir dize; serbestçe ayarlanabilir bir metal halka Isıtma; ve fare gövde yerleştirmek için yükseltilmiş içilir. Bu aşamada, eklenen bir stereotaktik sahibi ve exteriorized SMG tutan alt kapak SLIP desteği ile popliteal lenf nodu aşamasından değiştirilir. Ayrıntılı planlar veya Sahne Alanı'nın tırnak talep üzerine temin edilmektedir.
<ol><li>Sahne Isıtma ring için sahipleri ve çıkarılabilir kapak fişi tutucu kaldırarak hazırlayın. Kulak çubuğu sahipleri ve sabit kapak fişi tutucu vidayı gevşetin. Bir parçası olarak kullanılan odada fare için Sahne Alanı'nın merkezi alanına gazlı bez bant.</li>
	<li>Yapıştırıcı ((Bu alt kapak cam olacak) bir silindirik metal tutucu tepesine bir 20 mm çapında cam takmak için Malzemeler tablobkz:). Bir 25 mm cam (Bu üst kapak cam olacaktır) düz metal tutucu altına tutkallayın. Kapak gözlük yaklaşık 2-3 mm metal sahipleri ile örtüşme ve cam kalan yağ ve tutkal serbest kalmasını sağlamak.</li>
	<li>Fareyi üzerine gazlı bez, gergin dizeye dikey sırtında kulak barlar arasında ortalanmış kafa yerleştirin.</li>
	<li>Üst ekstremite cerrahi bant ile sahne alanı'na fare düzeltmek.</li>
	<li>Ardından, dize üst ön kesici kanca ve çene bir yatay konuma ulaşana kadar sıkın. Açılı bir eğri forseps biraz dil nefes kolaylaştırır ağzından dışarı çıkarmak için kullanın.</li>
	<li>Sıkı bir şekilde, ama zorla değil, kuyruk çekin ve Sahne Alanı'na teyp.</li>
	<li>Yaklaşık 30 ° açı bar ve Sahne Alanı'nın kenar arasında elde etmek için kulak çubuklarını hizalayın. Bu açı emin olmak için sağ ve sol 30 derecelik açıyla bir yaprak kağıda çizmek için bir üçgen cetvel kullanın ve şeffaf sahne alanı sahipleri buna göre hizalamak için kağıt üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Çene çene immotile kadar içe doğru hareket ettirerek aynı anda sol ve sağ bar kulak çubuklar arasındaki düzeltmek ve vidayı sıkın. Göğüs hareketi öncesinde, sırasında ve çene sabitleme sonra gözlemlemek. Azaltılmış veya barlar boyun, çene kemiği değil; giderilen nefes yok gösterir Bu durumda, hemen sabitleme yordamı yineleyin.</li>
	<li>Isıtma fareyi örneğin, yakın bir Isıtma lambası ve/veya sahne alanı altında bir Isıtma yastığı yerleştirerek sağlar.</li>
</ol>4. cerrahi maruz kalma bir Stereomicroscope kullanarak Tükürük bezi
Not: Aşağıdaki adımları stereomicroscope, fine forseps ve Cerrahi makas kullanılmasını gerektirir. Yordamı terminal olduğundan, steril çalışma koşulları sağlamak gerekli değildir. Etanol temizlik aletleri yeterli.
<ol><li>Yaklaşık 15 mm Kaudal ağız ve çene hattı 5 mm medial deride hafif bir çıkıntı yaşar sağ SMG LOB yaklaşık konumunu bulun. Çıkıntı ortasında küçük cilt kapağı kaldırın ve oluşturmak için ve açılış yaklaşık 5 mm uzunlukta kesip.</li>
	<li>Hemen bir 4 mm-yüksek halka vakum yağ kesme çevreleyen cilt üzerinde uygulayın. (Bir vakum şırınga yağ dolu bir körelmenin 25 G Hipodermik İğne ile kullanın).</li>
	<li>Yağ halka doku operasyon sırasında nemli kalır emin olmak için serum fizyolojik ile doldurun.</li>
	<li>Stereomicroscope altında aşağıdaki yordamı kullanarak bağ dokusu bozabilir: bir iyi forseps bağ dokusu SMG için doğrudan bağlı bir parça sıkıca tutun ve bu Yırtığı kadar distal bağ dokusu çekmek için ikinci bir forseps kullanır. Bazı bağ dokusu SMG için bağlı kalmasını sağlamak; işleme sağlar beri bu arzu edilir. Bu kanama neden olur bu yana Forseps ile bezi kendisi dokunmayın.</li>
	<li>Tekrarlayın bağ dokusu ilk bezinin üstüne sonra (arasında SMG sağ ve sol LOB) medial tarafında dağıtmak, bu hareket. Hapı submandibular bezi ayırmayın.</li>
	<li>Lateral bağ dokusu çevresinde SMG (Kaudal, distal rostral için için için medial) saat yönünün tersine kaldırmak devam edin.</li>
	<li>Kan akımı, efferent Lenfleribile ve tükürük kanalı, tek bir pakette bezinin kafatası sitesinde bulunan bulunan, değil yırtıldı emin olun.</li>
	<li>Bir kez lateral bağ dokusu bozulur, forseps Kaudal SMG Kaudal sonu yukarı kaldırmaya SMG sonuna kadar bağlı bağ dokusu çekmek için kullanın. Aşağıda SMG LOB bağ dokusu bozabilir Kaudal başlayan ve rostral sonuna doğru hareket.</li>
	<li>SMG tüm sitelere bağ dokusu (büyük besleme/boşaltma kan damarları ve WD rostral sitesiyle hariç) kaldırılana kadar devam edin.</li>
</ol>5. sabitleme bezi
<ol><li>Tuz tutan yağ halka en az 4 mm (bkz. Adım 4.2) yüksek ve değil sızıntı olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Yükleme alt kapak cam (bkz. Adım 3.2) metal çubuk yüksekliği ayarlanabilir onun sahibine ekleme tarafından. Kapak notu sahibi olduğunu konuma ayarlanır ve Sahne Alanı'na bağlı yağ halka dokunmaz emin olun. Kaudal yön sahibinden fare, yaklaşık 60 ° açılı kapak kabaca üçte kapsayan kayma ile (Kaudal ve distal parça) maruz LOB getirin. Cam kadar alt bezi ile temas.</li>
	<li>Yeni tuzlu su deposu oluşturmak için kapak cam üstüne yağ halka tamamlayın.</li>
	<li>Dikkatle üstüne kapak notu SMG LOB Forseps ile ona bağlı bağ dokusu dokunmadan sadece çek (org yukarı bakacak şekilde alt site ile çevrilmiş).</li>
	<li>Yağ yüzük bile bir yüksekliği en az 4 mm ve kaçak değil emin olun. Gerekirse, şırınga 30 G kullanarak tuzlu su deposu dolum salin ile dolu.</li>
	<li>Üst kapak cam için cam tutucu olduğunu konumunda olduğundan emin olun. Vida ile 25 mm üst kapak cam metal sahibi sahibine bağlamak için kullanın. Ayarlanabilir vida yuvasının kapağı cam SMG ortada ortalanacak şekilde konumlandırmak için kullanın.</li>
	<li>Doğrudan SMG kişiler kadar üst kapak cam düşürmek için ayarlanabilir tutucu vidaları kullanın. Şekli ve bu adımı sırasında bezinin boyama gözlemlemek. Bezi yüzey alanı büyük görünür veya boyama (örneğin pembe beyaz), hemen değiştirir kapak cam SMG basıncı azaltmak için daha yüksek bir konuma koymak.</li>
	<li>Kaçakları için tuzlu su deposu hava kabarcıkları ve/veya damla serum havzanın dışında bakarak kontrol edin. Bir sızıntı veya hava kabarcık algılanırsa, kaldırmak kapak fişleri ve tüm yağ ve--dan adım 2 yeniden başlatın.</li>
	<li>Vida tüm fiksasyon vidaları kapatın.</li>
</ol>6. Isıtma yüzük ve sıcaklık probu sabitleme
<ol><li>Göle bir sıcaklık probu takın ve yakın bezi getirin, daha sonra sahneye sonda tel bant.</li>
	<li>Bir yağ yüzük (yağ yüzük çapı Isıtma yüzük çapı için karşılık gelmelidir) Merkezi SMG ile üst kapak notu uygulanır. Isıtma yüzük kapak notu üstüne getirin ve yağ ile kapatın. Isıtma yüzük sahneye boru bant.</li>
</ol>7. görüntüleme
Not: Bir akort Ti:Sa lazer ve su-daldırma 20 X veya 25 X hedefleri ile floresan mikroskop ile donatılmış bir dik iki fotonlu mikroskop sistemi kullanıyoruz. Doku drift düzeltilmesi gerçek zamanlı satın alma sırasında bir otomatik sahne ve VivoFollow19kullanarak uygulanabilir. Bu resim alma kararlılığını geliştirir, ancak gerekli değildir.
<ol><li>Dik mikroskobu sistemi mikroskop üreticisi tarafından sağlanan bir uygun yazılımı kullanarak açın. Ti:Sa lazer 780-900 nm uyarma dalga boyları için ayarlayın.</li>
	<li>Isıtma boru Isıtma Yüzük'e bağlanın. Peristaltik su pompası SMG ısıtmak için halka aracılığıyla sıcak su (80 ° C su banyosu içinde boru parçası batış tarafından ısıtmalı) dolaşır.</li>
	<li>Bir dijital termometre sıcaklık probu takın. Sıcaklık değil 35-39 ° c arasında ise Peristaltik pompa hızını ayarlayın Ne kadar hızlı pompa çalışır, sıcak nesne alır ve ahlak bozukluğu çok yönlü.</li>
	<li>Resim alma işlemine geçmeden önce kan akım hızları görsel bir denetimi gerçekleştirin. Dikkatle lökosit geçit ince kılcal damarlar yoluyla veya floresan dextran enjeksiyon kontrol edin. Not: kan akımı fizyolojik olduğunda intravenöz enjekte floresan dextran hemen tüm SMG damarlara doldurur. Bu hemen hemen her zaman bu yordamdaki durumdur.</li>
	<li>Bağışıklık hücreleri, görüntüleme derinliği genellikle 2nd harmonik üretimi sinyal ile tanımlanan SMG yüzeyinin altında 20-150 µm arasında uygulamaktır. 150-300 µm görüş alanı kayıt görüntü yığınları ile yaklaşık 512 x 512 veya daha yüksek pixel kararlılık ve z-derinliklerine 20-60 µm ile 2-4 µm görüntüler arasında aralığını. Yığın edinme her 20-30 s 20-60 dk toplam süresi için yineleyin.</li>
	<li>Minimum ve maksimum sıcaklık düzeyleri bir görüntü sırası edinimi sonra kontrol etmek için dijital termometre kullanın. Minimum veya maksimum 37 ± aralığı içinde değilseniz görüntü sırası atmak 2 ° C. Amaç görüntü dizileri arasında daldırma için su dolum.</li>
	<li>Görüntüleme oturumun sonunda, CO2 boğulma anestezi altında tarafından fareler ötenazi. Not: Bu hayvan deney İsviçre federal yönergelere uygun olarak. diğer kurallar ötenazi için başka bir yerde geçerli olabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive+System.">Digestive System.</a> Digital Histology. , 101-121 (2005).</li><li>Carpenter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Saliva+in+the+Oral+Processing+of+Food.">Role of Saliva in the Oral Processing of Food.</a> Food Oral Processing. , 45-60 (2012).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).</li><li>Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+CD66a+and+CD117+in+the+mouse+submandibular+gland.">Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland.</a> Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).</li><li>Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+podoplanin+in+the+mouse+salivary+glands.">Expression of podoplanin in the mouse salivary glands.</a> Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).</li><li>Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+salivary+gland+function+by+autonomic+nerves.">Regulation of salivary gland function by autonomic nerves.</a> Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).</li><li>Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Dendritic+Cells+in+Normal+Human+Salivary+Glands.">Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).</li><li>Hofmann, M., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+promotes+accumulation+of+a+unique+memory+CD8+T-cell+population+in+murine+salivary+glands.">E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).</li><li>Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+tertiary+lymphoid+structures,+autoimmunity,+and+exocrine+dysfunction+in+a+novel+model+of+salivary+gland+inflammation+in+C57BL/6+mice.">Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).</li><li>Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+activation+of+the+RANK+signaling+receptor+induces+murine+salivary+gland+tumors.">Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+A+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).</li><li>Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy.">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#181;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:Al_2O_3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#181;m in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier.</a> Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).</li><li>Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+3D+in+vivo+intravital+microscopy+images+with+an+iteratively+refined+soft-tissue+model+for+immunology+experiments.">Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments.</a> Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cervical+spinal+cord+window+preparation+allows+for+two-photon+imaging+of+T-Cell+interactions+with+the+cervical+spinal+cord+microvasculature+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 8, 406 (2017).</li><li>Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), e52607 (2015).</li><li>Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CD4+T+cell+interstitial+migration+in+the+inflamed+dermis.">Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis.</a> J Vis Exp. (109), e53585 (2016).</li><li>Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).</li><li>Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node.">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> J Vis Exp. (60), e3720 (2012).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).</li><li>Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+imaging+subcellular+structures+in+live+mice+expressing+fluorescent+proteins.">Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins.</a> J Vis Exp. (79), e50558 (2013).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li><li>Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+actions+of+distinct+nonmuscle+myosin+II+isoforms+drive+intracellular+membrane+remodeling+in+live+animals.">Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals.</a> J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).</li><li>Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannulation+of+the+mouse+submandibular+salivary+gland+via+the+Wharton's+duct.">Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct.</a> J Vis Exp. (51), e3074 (2011).</li><li>Chen, G. Y., Nu&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+Sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage.</a> Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).</li><li>McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+causes+of+variation+of+body+temperature+in+mice.">Some causes of variation of body temperature in mice.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).</li><li>Baumgart, K., Wagner, F., Gr&#246;ger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+metabolic+effects+of+hypothermia+and+inhaled+hydrogen+sulfide+in+anesthetized+and+ventilated+mice.">Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice.</a> Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).</li><li>Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+area+of+the+murine+aorta+linearly+increases+with+increasing+core+body+temperature.">Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature.</a> Int J Hyperth. , 1-13 (2017).</li><li>Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CMV+infection+induces+the+continuous+production+of+mucosal+resident+T+cells.">Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells.</a> Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).</li><li>Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li><li>Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).</li><li>Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+interactive+two-photon+photoconversion+of+recirculating+lymphocytes+for+discontinuous+cell+tracking+in+live+adult+mice.">Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice.</a> J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).</li><li>Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).</li><li>Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging.">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).</li><li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+lipid+bilayers+with+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Bu iletişim kuralı için in vivo düşsel bezlerinin fare çene ve sublingual tükürük kez İmmünoloji alanında kullanılan dik doğrusal olmayan mikroskobu kullanarak basit bir yaklaşım sunmaktadır. Yöntem diğer ekzokrin bezleri baş ve boyun bölgesinde görüntüleme için adapte edilebilir. Örneğin, laboratuarımıza gözyaşı bezinin görüntüleme (gösterilmez) benzer bir şekilde sahne aldı.
Kaza sonucu doku hasarı oluşabilir SMG etrafında bağ dokusunu bu Pr...

Tükürük gıda yağlamak, ağız yolu Mukozal yüzeylerin korumak ve sindirim enzimleri gibi antibakteriyel maddeler1,2teslim ekzokrin bezleri tarafından salgılanan. Sözlü submukoza içinde serpiştirilmiş küçük tükürük bezleri yanı sıra göre onların konumu1,2büyük bezleri parotid, dil ve çene, tanımlanan üç ikili kümesi vardır. Epitel hücreleri, Piramit şeklinde düzenlenen şişesi şeklindeki kesesi (acini) veya myoepithelial hücreleri ve bir membran, çevrili demilunes tükürük1seröz ve müköz bileşenleri salgılar. Acini akmak içine onlar sonunda bir tek boşaltım kanalı1' e katılmak kadar hangi çizgili kanalları birleştirmek ara kanalları dar luminal space. SMG ana boşaltım kanalı Wharton'ın kanal (WD) denir ve sublingual caruncle3,4açılır. SMG epitel yuvası bu nedenle son derece arborized bir yapı a bohça-in üzüm1,5,6benzeyen manifold terminal bitiş noktaları ile temsil eder. SMG interstitium kan ve lenf damarları parasempatik sinirler8 ve hücre dışı matriks5içeren bağ dokusu7 içinde gömülü oluşur. Normal insan ve kemirgen tükürük bezleri de T hücreler, makrofajlar ve dendritik hücreler9immünglobulin salgılar plazma hücreleri tükürük9içine,10(IgA) yanı sıra, içerir. Sağlığı ve hastalıkları çok yönlü işlevleri nedeniyle, SMG Biyolojik araştırma diş hekimliği4, İmmünoloji11, Onkoloji12, fizyoloji8ve hücre biyolojisi dahil olmak üzere, birçok alan için ilgi bir konudur 3.
Görüntüleme dinamik hücresel süreçler ve etkileşimleri, Biyolojik araştırma13,-14güçlü bir araçtır. Saçılma veya birden çok fotonlar emilimini örnek tarafından güvenen, doğrusal olmayan optik (NLO), temel derin doku görüntüleme ve yenilikler inmicroscopes gelişimini doğrudan hücresel süreçler karmaşık doku13 incelemek için izin verdi ,15. Birden çok fotonlar emilimini düşük enerji fotonlar, hangi sınırları fluorophore uyarma için odak düzlem tarafından teslim toplam uyarma enerji gerektirir ve böylece daha derin doku penetrasyonu düşük duyarlilik ve odak dışından gürültü ile sağlar uyarma13,15. Bu ilke İki fotonlu mikroskobu (2 PM) tarafından istihdam ve floresan örneklerin en fazla 1 mm15,16derinliklerinde görüntüleme sağlar. Kurulumları kullanıcı dostu ve güvenilir hale gelmiştir piyasada bulunan 2 de dikkatli bir şekilde ortaya çıkarmak ve imzalat fareler, hedef organ özellikle görüntüleme serisi zaman sukut için stabilize etmek üzere intravital görüntüleme için büyük sorun olduğunu. Veri toplama olmuştur sonra dijital drift düzeltme için birkaç yöntem17,18 yayınlandı ve "VivoFollow", gerçek zamanlı kullanarak yavaş doku drift zıt bir otomatik düzeltme sistemi en son geliştirdiğimiz bir Bilgisayarlı sahne19. Bu seçenek ancak, yüksek kaliteli doku hareket, özellikle hızlı hareketler nefes ya da kalp atışı19neden en aza indirmek için görüntüleme için hala önemlidir. Hazırlık ve stabilization yordamlar omurilik20, karaciğer21, Cilt22, akciğer23ve lenf nodu24de dahil olmak üzere birden fazla organ için yayınlanmıştır. Ayrıca, fare Tükürük bezi görüntüleme modellerinde gelişmiş3,25 edilmiş ve daha yüksek çözünürlüklü bir ters mikroskop Kur-26, SMG uyarlanmış antikorundan intravital görüntüleme için rafine 27 , 28.
Burada, İmmünoloji alanında intravital görüntüleme için yaygın olarak kullanılır dik doğrusal olmayan mikroskobu kullanarak fare SMG intravital görüntüleme için pratik ve uyarlanabilir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, popliteal lenf nodu hazırlıkları kullanılan yaygın istihdam immobilizasyon sahne değiştiren.

<table><tbody><tr><td>Narketan 10 %&amp;nbsp; (Ketamine) 20ml (100 mg/ml)</td><td>Vetoquinol</td><td>3605877535982</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)</td><td>Bayer</td><td>680538150144</td><td></td></tr><tr><td>Saline NaCl 0.9%</td><td>B. Braun</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml)</td><td>Fatro</td><td>6805671900029</td><td></td></tr><tr><td>Electric shaver</td><td>Wahl</td><td>9818L</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Hair removal cream</td><td>Veet</td><td>4002448090656</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>Super glue Ultra gel, instantaneous glue</td><td>Pattex, Henkel</td><td>4015000415040</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1343/ 631-1344</td><td></td></tr><tr><td>Grease for laboratories 60 g glisseal N</td><td>Borer (VWR supplier)</td><td>DECO514215.00-CA15</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T )</td><td>14090-09</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T )</td><td>11252-20</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Migros</td><td>617027988254</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Gauze Gazin 5 x 5 cm</td><td>Lohmann and Rauscher</td><td>18500</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Texas Red dextran 70kDa</td><td>&amp;nbsp;Molecular Probes</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Cascade Blue dextran 10kDa</td><td>invitrogen</td><td>D1976</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon system</td><td>LaVision Biotec</td><td>TrimScope I and II</td><td>or similar</td></tr><tr><td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>or other water immersion objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital thermometer</td><td>Fluke</td><td>95969077651</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy

Submandibular Tükürük bezi (SMG) üç büyük tükürük bezleri biridir ve biyolojik araştırma, hücre biyolojisi, Onkoloji, diş hekimliği ve İmmünoloji dahil olmak üzere birçok farklı alanlar için ilgi olduğunu. SMG salgı epitel hücreleri, myofibroblasts, endotel hücreleri, sinirler ve hücre dışı matriks ekzokrin bir bezdir. Fare ve fare SMG dinamik hücresel süreçler daha önce görüntüsü, çoğunlukla kullanarak çoklu foton mikroskop sistemleri ters. Burada, cerrahi hazırlanması ve istikrar için in vivo düşsel dik çok foton mikroskop sistemleri ile imzalat farelerde fare SMG için basit bir protokol açıklayın. Endojen temsilcisi intravital görüntü kümesi sunmak ve adoptively floresan hücreleri, kan damarları veya tükürük kanalları ve fibriler kollajen görselleştirmek için ikinci harmonik üretimi etiketleme de dahil olmak üzere aktarılır. Özetle, bizim iletişim kuralı İmmünoloji alanında intravital görüntüleme için yaygın olarak kullanılan dik mikroskobu sistemlerindeki fare tükürük bezleri cerrahi hazırlanması için izin verir.

Bu iletişim kuralı neredeyse tüm dorsal veya ventral yan SMG görüntüleme sağlar. Görüş alanı genellikle biraz SMG hücresel kompozisyon4farklıdır sublingual Tükürük bezi de içerir. Her iki bezleri tarafından fibriler kollajen kapsüllenir ve loblar bölünmüştür. Çoğu 2 de fibriler kollajen etiket içermeyen bir görüntüsünü 2nd harmonik sinyali ölçerek sistemleri oluşturabilir ancak genellikle floresan moleküller hücre ve...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy at JoVE.com

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

Biz cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve fare submandibular Tükürük bezi dik intravital mikroskobu kullanılarak intravital görüntüleme için stabilize etmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı diğer ekzokrin bezleri için baş ve boyun bölgesinin fareler ve diğer küçük kemirgen kolayca uyarlanabilir.

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Görüntüleme.  University of Bern. Biz cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve fare submandibular Tükürük bezi dik intravital mikroskobu kullanılarak intravital görüntüleme için stabilize etmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı diğer ekzokrin bezleri için baş ve boyun bölgesinin fareler ve diğer küçük kemirgen kolayca uyarlanabilir.

Video: Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

Wharton Kanalı üzerinden Fare Submandibular Tükürük Bezi kanülasyonu

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Tıp

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Fare Submandibular bezi Retroductal nanopartikül enjeksiyon

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Biyomühendislik

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

Tükürük hipofonksiyonunun bir Sıçan Modelinde Retroductal Submandibuler Bezi damlatma ve yerelleştirilmiş fraksiyonlara Işınlama

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Biyoloji

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Fare tükürük işlevsel değerlendirme Pilokarpin stimülasyon aşağıdaki yolu ile radyasyon şeker

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Fare Submandibular Bez Rejenerasyonunun Gerçek Zamanlı Canlı Görüntülenmesi

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Yazar Spotlight: Yaralanma Sonrası Tükürük Bezi Rejenerasyonunda Makrofaj-Epitel Hücre Etkileşimlerinin İncelenmesi 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

Dik Intravital mikroskopi için fare Submandibular Tükürük bezi hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Wharton Kanalı üzerinden Fare Submandibular Tükürük Bezi kanülasyonu

Fare Submandibular bezi Retroductal nanopartikül enjeksiyon

Tükürük hipofonksiyonunun bir Sıçan Modelinde Retroductal Submandibuler Bezi damlatma ve yerelleştirilmiş fraksiyonlara Işınlama

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Fare tükürük işlevsel değerlendirme Pilokarpin stimülasyon aşağıdaki yolu ile radyasyon şeker

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması