Name: preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy
Uploaded: 2018-05-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy at JoVE.com

この作品は、スイス国立財団 (SNF) プロジェクト助成金 31003A_135649、31003A_153457 と (合弁会社) に 31003A_172994 とレオポルジナ親睦 LPDS 2011-16 (BS) の資金を供給されました。この作業を「顕微鏡イメージング センター」(MIC) ベルン大学光セットアップから恩恵を受けて。

すべての動物の仕事を動物実験のための州委員会によって承認されており、連邦政府のガイドラインに従って実施します。
1. マウスを麻酔します。
<ol><li>白衣、手袋など保護具を着用します。</li>
	<li>ケタミン、キシラジンと作業濃度 20 mg/mL と 1 mg/mL の生理食塩水をそれぞれ混ぜます。在庫を腹腔内注入 (i. p.) 8-10 μ L/マウスの g で。ケージに戻るには、マウスを置きます。 注: このプロトコルは、C57BL/6 背景を持つ 6-40 週齢の雌雄マウスのテストされています。</li>
	<li>2.5 mg/ml アセプロマジン ソリューションを準備し、30 μ L i. p.、(75 μ g/マウス) ケタミン ・ キシラジン投与後 15 分を注入します。</li>
	<li>5-15 分後に、、反射など足や角膜反射の逃避反射を制御することにより十分な麻酔と鎮痛を確認します。</li>
	<li>実験の全体の持続期間の間約 30 分毎に制御反射します。ケタミン ・ キシラジンを皮下注入 1.5 μ L/g マウス、すべて 60 分またはそれ以前の場合、反射は正。 注: イソフルランなどの吸入麻酔はマウスの固定のため、このプロトコルでは使用できません。</li>
</ol>2. 動作領域から毛皮を削除します。
<ol><li>約 5 mm 両方の耳に向かって顎伸びる前足に向かって口の尾から展開された領域を剃る電気かみそりを使用します。</li>
	<li>脱毛クリームを綿棒で剃毛エリアに適用されます。慎重かつ徹底的にウェットティッシュで拭くことによって、例えば、3 分後削除します。</li>
</ol>3 段階のマウスを修正します。
注: このプロトコルを使用して、カバー スリップ (ネジでステージに 1 つ、上に完全に固定された他) の 2 つの自由に調節可能なホルダーを備えたカスタマイズされたステージ (図 1)調節可能な定位イヤバーねじで締めることができる文字列自由に調節可能な金属製のリングを加熱マウスの胴体を配置する上げられた区域。この段階は、追加された定位ホルダーと外在化した SMG を押し下のカバー スリップのサポート膝窩リンパ節段階から変更されます。詳細な計画やステージの引用符のリクエストも承ります。
<ol><li>加熱リング用ホルダー、取り外し可能なカバー スリップ ホルダーを外してステージを準備します。耳バー ホルダー ・固定カバー スリップ ホルダーのネジを緩めます。マウスのための寝具として、ステージの中央の領域に新しいガーゼをテープします。</li>
	<li>接着剤を使用 (材料の表を参照) (下のカバーガラスになります) 円筒金属ホルダーの上部に 20 mm 直径のカバーガラスを添付します。(上のカバーガラスになります) 平らな金属ホルダーの下に 25 mm カバーガラスを接着します。金属ホルダーと約 2-3 mm をカバー メガネに重複のグリースや接着剤、ガラスの残りの部分が空いてを確認します。</li>
	<li>耳バー間の中央に頭をガーゼ、弦に対して垂直に背中にマウスを配置します。</li>
	<li>サージカル テープでステージ上にマウスの上肢を修正します。</li>
	<li>次に、文字列をフック フロント上顎、顎は水平位置までを締めます。少し呼吸を容易に口から舌を抜くカーブ鉗子を使用します。</li>
	<li>しっかりと、しかし、強制的に、しっぽを引っ張るし、ステージにテープします。</li>
	<li>バーとステージの端の間約 30 ° の角度を達成するために耳のバーを配置します。この角度を確保するため、三角定規を使用して、紙のシート上左右 30 ° の角度で描画してそれに応じて所有者に合わせて紙の上に透明な段階を置きます。</li>
	<li>顎は運動となるまで同時に左と右のバーを移動することによって耳バーの間顎を修正し、ネジを締めます。前に、中と顎を固定した後、胸の動きを観察します。減少または呼吸欠席バーがない顎の骨に、首で固定されることを示します。この場合、すぐに固定の手順を繰り返します。</li>
	<li>マウスには、例えば、近くに暖房ランプおよび/または下にステージ加熱パッドを配置することによって暖房を提供します。</li>
</ol>4. 手術手技、顕微鏡を使用して唾液腺の
メモ: 次の手順は、実体顕微鏡、微細鉗子、手術用はさみの使用を必要。手順は端末なので、滅菌の動作状態を維持する必要はありません。エタノール洗浄器で十分です。
<ol><li>約 15 mm の口とあごのラインの 5 mm 内側の尾の皮膚にわずかな膨らみを探して右の SMG 葉のおおよその位置を検索します。膨らみの中心に小さな皮膚のひだを持ち上げ、それを作成して約 5 mm の開口部をカットします。</li>
	<li>すぐにカットを周囲の皮膚に真空用グリースの 4 mm 高リングを適用します。(鈍化 25 G 注射針による真空グリース充填注射器を使用)。</li>
	<li>組織の操作中に湿ったまま確保するため生理食塩水でグリース リングを入力します。</li>
	<li>次の手順を使用して結合組織を妨害、実体顕微鏡下で: SMG に直接接続されている結合組織の部分をしっかりと持つこと 1 つの微細鉗子を使用し、それが破裂するまで遠位の結合組織をプルする 2 番目の鉗子を使用します。いくつかの結合組織の SMG に接続されているを確保します。それは処理を可能にするので、これが望ましいです。これは出血を引き起こすので、鉗子で腺自体を触れないでください。</li>
	<li>腺上に、内側 (SMG の右と左葉) の間の結合組織をまず中断のこの動きを繰り返します。舌下腺は、顎下腺から分離しません。</li>
	<li>横方向の結合組織 (吻側への遠位に、尾の内側) の SMG の反時計回りの削除を続行します。</li>
	<li>血液供給、遠心性リンパ管、唾液管腺の頭蓋のサイトの束にあるすべてはない破裂したことを確認します。</li>
	<li>外側の結合組織を破壊すると、一度は、SMG の尾の端を持ち上げて上方向に SMG の尾側に付着した結合組織をプルするのに鉗子を使用します。SMG の葉の下の結合組織を混乱させる、尾から始まって、吻側端に向かって移動します。</li>
	<li>(主な供給/排出血管と WD 吻側のサイトを除く) SMG のすべてのサイトに結合組織が削除されるまで続行します。</li>
</ol>5. 腺を修正
<ol><li>生理食塩水を保持しているグリース リングが少なくとも 4 mm 高く、そして、漏れ (手順 4.2 を参照) であることを確認します。</li>
	<li>下部カバー ガラス (3.2 を参照) インストールと高さ調節可能なホルダーの金属製のバーを接続することによって。カバー スリップ ホルダーを最大限の位置調整、グリース リング ステージにアタッチしたときに触れないことを確認します。カバー スリップ カバー約 3 分の 2 (尾と遠位部分) 露出の葉とマウスに約 60 ° の角度で尾側方向からホルダーを配置します。それまでカバー ガラスを下げる腺との接触します。</li>
	<li>新しい生理食塩水の貯水池を形成するカバーガラスの上にグリース リングを完了します。</li>
	<li>それに付着した結合組織に触れるだけ、鉗子、カバー スリップの上に SMG 葉を慎重に引き出します (器官は上を向いて下サイトに反転ことができます)。</li>
	<li>グリース リングも高さは 4 mm 以上、漏れていないことを確認します。必要に応じて、リフィル シリンジ 30 G を用いた生理食塩水の貯留層は、生理食塩水でいっぱい。</li>
	<li>上部カバー ガラス カバー ガラス ホルダーがその最大限の位置にあることを確認します。ネジを使用してホルダー 25 mm 上部カバー ガラスとメタル ホルダーを取り付けます。途中で SMG を中心に配置するには、カバー ガラス ホルダーの調節ネジを使用します。</li>
	<li>SMG は、直接接触するまでトップ カバー ガラスを下げる調節可能なホルダーのネジを使用します。形状とこの手順中に腺の色を確認します。腺の表面積が大きく、表示されますやカラーリング変更 (例えばから白にピンク)、すぐに場合は、SMG の上の圧力を緩和するために高い位置にカバーガラスを置きます。</li>
	<li>タンク外生理食塩水の滴や、空気の泡をお探ししてリークを生理食塩水の貯水池を確認します。漏れや空気の泡が検出された場合を削除カバー スリップとすべてのグリースし、手順 2 から再開します。</li>
	<li>ネジは、すべての固定ネジをシャット ダウンします。</li>
</ol>6. 加熱リング、温度プローブの固定
<ol><li>貯水池の温度プローブの挿入し腺の近くに位置し、ステージにプローブのワイヤーをテープします。</li>
	<li>(グリース リングの直径は加熱リングの直径に対応する必要があります) センターで SMG とトップのカバー スリップにグリース リングを適用します。カバー スリップの上に加熱リングを置き、グリースでシールします。ステージに加熱リングのチューブをテープします。</li>
</ol>7. イメージング
注: 我々 は波長可変 Ti:Sa レーザと水浸漬 20 X、25 X 目標と蛍光顕微鏡を備えた直立二光子励起顕微鏡システムを使用します。集録中に組織のドリフトのリアルタイム補正は、自動ステージと VivoFollow19を使用して実装できます。これは画像取得の安定性の向上が必須ではありません。
<ol><li>顕微鏡メーカーによって提供される適切なソフトウェアを使用して直立した顕微鏡システムを入れます。Ti:Sa レーザー 780-900 nm の励起波長を調整します。</li>
	<li>加熱管を加熱リングに接続します。蠕動ポンプは、SMG を暖かくリングをお湯 (80 ° C の水浴のチューブの一部を水没によって加熱) を循環します。</li>
	<li>デジタル温度計には、温度プローブを接続します。温度は 35-39 ° c. の間にない場合、蠕動運動型ポンプの速度を調整します。ポンプの高速動作、オブジェクトを取得しますが暖かい、およびその逆。</li>
	<li>画像の取得を開始する前に血流速のビジュアル コントロールを実行します。細い毛細血管や蛍光デキストラン注入による白血球の通路を入念にチェックします。 注: 血流が生理学的な静脈内注入蛍光デキストランは全体の SMG 血管を記入すぐに。これは事実上常にこの手順の場合です。</li>
	<li>免疫細胞に従う、イメージング深さは通常 2nd高調波発生信号によって識別される SMG の表面の下 20-150 μ m の間。約 512 x 512 以上のピクセルの解像度で 150-300 μ m の視野の記録画像のスタックと画像間の 2-4 μ m の間隔で 20-60 μ m の z-深さ。20-60 分の合計時間に対してスタックの取得すべての 20-30 秒を繰り返します。</li>
	<li>デジタル温度計を使用して、1 つのイメージ シーケンスの取得後最小値と最大温度レベルを制御します。最小値または最大値が 37 ± の範囲にない場合は、イメージ シーケンスを破棄 2 ° c.イメージ シーケンスの間の目的の浸漬のための水を補充します。</li>
	<li>撮像セッションの最後に、麻酔下で CO2窒息によってマウスを安楽死させます。 注: これは動物実験; スイス連邦政府のガイドラインに基づき、します。安楽死に関する他のガイドラインは、別の場所にあります。</li>
</ol>

<ol>
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C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+area+of+the+murine+aorta+linearly+increases+with+increasing+core+body+temperature.">Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature.</a> Int J Hyperth. , 1-13 (2017).</li><li>Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CMV+infection+induces+the+continuous+production+of+mucosal+resident+T+cells.">Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells.</a> Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).</li><li>Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li><li>Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).</li><li>Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+interactive+two-photon+photoconversion+of+recirculating+lymphocytes+for+discontinuous+cell+tracking+in+live+adult+mice.">Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice.</a> J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).</li><li>Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).</li><li>Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging.">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).</li><li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+lipid+bilayers+with+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

このプロトコルでは、免疫学の分野でよく使用されます直立の非線型顕微鏡を用いたマウスの顎下腺と舌下腺唾液腺の生体内イメージングのための簡単な方法を提供しています。メソッドは、頭頸部領域の他の外分泌腺のイメージングのために合わせることができます。例えば、私たちの研究室は (図示せず) 類似している方法で、涙腺のイメージングを実行しています。
<p class="jov...

唾液は消化酵素として抗菌物質1,2を提供する食品を注油、口腔管の粘膜の表面を保護する外分泌腺から分泌されます。口腔粘膜に散在の小唾液腺、に加えて、位置1,2によると主要な腺、舌下腺, 顎下腺, 耳下腺, として識別の 3 つの両側セットがあります。ピラミッド状の上皮細胞がフラスコ状嚢 (腺) に編成または筋上皮細胞と基底膜に囲まれた demilunes 唾1の漿液性と粘液の成分を分泌します。彼らは最終的に単一の排泄ダクト1に参加するまで横紋筋性ダクトに結合する介在部に腺下水管の狭い内腔領域。SMG の主排泄管ウォートンのダクト (WD) と舌下涙丘3,4に表示されます。SMG 上皮区画は、したがって、マニホールド ターミナル エンドポイント、ブドウ1,5,6のバンドルに似た高い葉状構造を表します。SMG 間質は、副交感神経神経8と細胞外マトリックス5を含む結合組織7に埋め込まれた血液やリンパ容器で構成されます。通常の人間と齧歯動物の唾液腺には、T 細胞、マクロファージ、樹状細胞9と同様、免疫グロブリンを分泌する形質細胞 (伊賀) 唾9,10にも含まれます。健康と病気、その多面的な機能のため、SMG は生物学的研究、細胞生物学、生理学8、腫瘍12免疫11歯科4などの多くの分野の関心の対象3。
細胞の動的過程と相互作用のイメージングは、生物学研究13,14の強力なツールです。複雑な組織13 の細胞プロセスを直接調べるの深部組織イメージングと革新的な inmicroscopes 非線形光学 (固定) に基づく、散乱またはサンプルによって複数の光子の吸収を利用する開発ができました、15。複数の光子の吸収低エネルギー光子、焦点面にどの範囲蛍光励起によって合計励起エネルギーの配信を含みより深い組織浸透還元生成やフォーカスの外からのノイズをできるように励起13,15。この原則は 2 光子励起顕微鏡 (14) で採用されている、まで 1 mm15,16の深さにおける蛍光試料のイメージングできます。市販 14 ユーザーフレンドリーかつ信頼性の高い設定となっている、生体イメージングのための主要な挑戦は慎重に公開し、イメージング時系列経過のため特に麻酔下マウスの臓器を安定させます。デジタル ドリフト補正データ集録後のいくつかのメソッド公開17,18と我々 は最近"VivoFollow"、リアルタイムを使用して遅い組織ドリフトを打ち消す自動補正システムを開発、コンピューター化されたステージ19。ただし、まだ高画質化組織運動、呼吸や鼓動19によって引き起こされる特に高速な動きを最小限に抑えるために重要です。準備および安定化の手順は、脊髄20、肝21、皮膚22、23肺リンパ節24など、複数の臓器に発行されています。さらに、ラット唾液腺イメージングのためのモデル開発3,25をされているし、さらに洗練された高解像度 SMG に合わせて、倒立顕微鏡セットアップ26,マウスの生体イメージング27,28。
ここでは、免疫学の分野で生体イメージングに用いられる直立非線形顕微鏡を用いたしてマウス SMG の生体イメージングのための実用的かつ適応プロトコルを提示します。このため、膝窩リンパ節の準備に使用される広く使用されている固定ステージを変更しました。

<table><tbody><tr><td>Narketan 10 %&amp;nbsp; (Ketamine) 20ml (100 mg/ml)</td><td>Vetoquinol</td><td>3605877535982</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)</td><td>Bayer</td><td>680538150144</td><td></td></tr><tr><td>Saline NaCl 0.9%</td><td>B. Braun</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml)</td><td>Fatro</td><td>6805671900029</td><td></td></tr><tr><td>Electric shaver</td><td>Wahl</td><td>9818L</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Hair removal cream</td><td>Veet</td><td>4002448090656</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>Super glue Ultra gel, instantaneous glue</td><td>Pattex, Henkel</td><td>4015000415040</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1343/ 631-1344</td><td></td></tr><tr><td>Grease for laboratories 60 g glisseal N</td><td>Borer (VWR supplier)</td><td>DECO514215.00-CA15</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T )</td><td>14090-09</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T )</td><td>11252-20</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Migros</td><td>617027988254</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Gauze Gazin 5 x 5 cm</td><td>Lohmann and Rauscher</td><td>18500</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Texas Red dextran 70kDa</td><td>&amp;nbsp;Molecular Probes</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Cascade Blue dextran 10kDa</td><td>invitrogen</td><td>D1976</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon system</td><td>LaVision Biotec</td><td>TrimScope I and II</td><td>or similar</td></tr><tr><td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>or other water immersion objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital thermometer</td><td>Fluke</td><td>95969077651</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy

顎下腺の唾液腺 (SMG) は、生物学的研究、細胞生物学、腫瘍学、歯科学、免疫学などの様々 な分野の関心の 3 つの大唾液腺の一つです。SMG は外分泌腺の分泌の上皮細胞、芽、血管内皮細胞、神経、細胞外マトリックスで構成されています。ラット、マウス SMG の動的な細胞プロセス イメージが以前作成された、逆多光子顕微鏡システムを用いた主。ここでは、直立した多光子顕微鏡システムを生体内イメージングのための麻酔下のマウスのマウスの SMG の安定化と手術の準備のための簡単なプロトコルについて述べる。我々 は内因性の代表的な生体画像セットを提示し、に対して転送蛍光細胞、血管や唾液管フィブリル型コラーゲンを視覚化する第 2 高調波発生のラベルを含みます。合計では、私達のプロトコルは生体イメージング免疫学の分野でよく使用される正立顕微鏡システムでマウス唾液腺の手術準備のためことができます。

このプロトコルでは、ほぼ全体背や腹側の SMG の画像をことができます。また、ビューのフィールドには、細胞構成4の SMG とは少し異なります舌下腺の唾液腺も含まれています。両方の腺はフィブリル型コラーゲンによってカプセル化され、葉に細分されます。ほとんど 14 システム 2nd高調波信号を測定することによってフィブリル型コラー?...

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Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K ビュー.  University of Bern. 手術を公開し、直立した生体顕微鏡を用いた生体イメージングのマウス顎下腺唾液腺を安定させるためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、頭部および頸部マウスの他の小さい齧歯動物の他の外分泌腺に容易に適応です。

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Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

ワルトン管を経由してマウス顎下唾液腺のカニュレーション

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

医学

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

生物工学

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

生物学

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

マウス顎下腺再生のリアルタイムライブイメージング

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

著者スポットライト:損傷後の唾液腺再生におけるマクロファージ-上皮細胞相互作用の研究 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

マウス顎下腺唾液腺の直立した生体顕微鏡検査のための準備

要約

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ワルトン管を経由してマウス顎下唾液腺のカニュレーション

マウス顎下腺への Retroductal ナノ粒子注入

唾液機能低下のラットモデルにおけるRetroductal顎下腺点滴とローカライズされた分割照射

唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

ピロカルピン刺激次を介してマウス唾液機能的アセスメント分別放射線

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)