Name: preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy
Uploaded: 2018-05-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy at JoVE.com

이 작품은 스위스 국가 재단 (SNF) 프로젝트 그랜트 31003A_135649, 31003A_153457 및 31003A_172994 (JVS), 하와 Leopoldina 친목 LPDS 2011-16 (BS)에 의해 투자 되었다. 이 작품 "현미경 이미징 센터의" (마이크) 베른 대학교의 광학 설정에서 benefitted.

모든 동물 일 동물 실험에 대 한 Cantonal 위원회에 의해 승인 되었습니다 있으며 연방 정부의 지침에 따라 실시.
1. 마우스 anesthetize
<ol><li>실험실 외 투, 장갑 등 개인 보호 장비를 착용 하십시오.</li>
	<li>케 타 민, xylazine, 및 20 mg/mL 및 1 mg/mL 작업 농도에 염 분을 각각 혼합. Intraperitoneally 작업 사진 주사 (i.p.) 마우스의 8-10 µ L/g에. 감 금 소에 다시 마우스를 놓습니다. 참고:이 프로토콜 C57BL/6 배경 6에 40-주-오래 된 남성 및 여성 쥐에 대 한 테스트 되었습니다.</li>
	<li>2.5 mg/mL에서 acepromazine 솔루션을 준비 하 고 30 µ L i.p., 15 분 (75 µ g/마우스) 케 타 민-xylazine 주입 후 주입.</li>
	<li>5-15 분 후 반사, 예를 들면, 발 또는 각 막 반사의 철수 반사를 제어 하 여 적절 한 마 취와 진통에 대 한 확인 합니다.</li>
	<li>제어 반사에 대 한 약 30 분 마다 실험의 전체 기간 동안. 피하 주사 마 취 제/xylazine 1.5 µ L/g 마우스, 모든 60 분 또는 이전 경우의 반사는 긍정적인. 참고: 흡입 마 취와 isoflurane 같은 마우스의 고정 때문이 프로토콜을 사용할 수 없습니다.</li>
</ol>2. 운영 영역에서 모피를 제거
<ol><li>전기 면도기를 사용 하 여 약 5 mm의 양쪽 귀 쪽으로 턱을 통해 스트레칭 앞 다리 쪽으로 입 꼬리에서 확장 영역을 면도.</li>
	<li>제 모 크림 면봉으로 면도 영역에 적용 됩니다. 신중 하 고 철저 하 게 젖은 티슈로 닦아 하 여 예를 들어, 3 분 후 제거 합니다.</li>
</ol>3. 스테이지에서 마우스 수정
참고:이 프로토콜 사용 하 여 사용자 지정된 단계 (그림 1) 커버 전표 (나사와 단계에 연결 된 하나, 다른 그것에 영구적으로 고정);에 대 한 두 명의 자유롭게 조정 가능한 홀더 장착 조정 가능한 정위 적 귀 바; 나사; 강화 될 수 있는 문자열 자유롭게 조정 가능한 금속 난방 반지; 그리고 마우스의 몸통을 배치에 지정 제기 지역. 이 단계는 추가 정위 적 보유자와 exteriorized SMG 들고 낮은 커버 슬립에 대 한 지원 오 금 림프절 단계에서 수정 됩니다. 상세한 계획 또는 따옴표는 무대의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
<ol><li>이동식 커버 슬립 홀더 난방 반지 홀더를 제거 하 여 무대를 준비 합니다. 귀 바 홀더 및 고정된 커버 슬립 홀더의 나사를 풉니다. 마우스에 대 한 침구도 무대의 중심 영역에 거 즈의 조각 테이프.</li>
	<li>접착제를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 원통형 금속 홀더 (올 낮은 커버 유리)의 상단에 20 m m 직경 커버 유리를 연결할. 편평한 금속 홀더 (올 상단 커버 유리)의 바닥에 25 m m 커버 유리 접착제. 커버 유리 금속 소지자와 약 2-3 mm 겹치는 고 유리의 나머지 그리스와 접착제의 무료 남아 확인 하십시오.</li>
	<li>귀 바 사이 중심으로 머리와 거 즈, 수직으로 뻗어 문자열에 그것의 뒤에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>외과 테이프와 함께 무대에 마우스의 위 사지를 수정 합니다.</li>
	<li>다음, 상단 전면 앞 니에 문자열을 연결 하 고 턱에는 수평 위치를 도달할 때까지 조입니다. 각된 곡선된 집게를 사용 하 여 약간 호흡을 용이 하 게 입에서 혀를 꺼내.</li>
	<li>단단히, 하지만 하지 강제로, 꼬리를 당겨 하 고 무대에 테이프.</li>
	<li>귀 바 바와 스테이지 가장자리 간의 약 30 °의 각도 달성 하기 위해 맞춥니다. 이 각도 되도록 삼각형 눈금자를 사용 하 여 종이, 시트에 좌우 30 °의 각도 그릴 하 고 소유자에 따라 맞게 종이에 투명 한 무대를 놓습니다.</li>
	<li>안쪽까지 턱 운동, 동시에 왼쪽 및 오른쪽 막대를 이동 하 여 귀 바 사이의 턱을 해결 하 고 나사를 조이십시오. 전에, 하는 동안, 그리고 턱을 고정 시킨 후 가슴 움직임을 관찰 합니다. 감소 또는 호흡에 결 석 바는 아니라 턱 뼈; 목에 고정 하는 것을 나타냅니다 이 경우에, 즉시 고정 절차를 반복 합니다.</li>
	<li>근처 난방 램프 또는 무대 아래 난방 패드를 배치 하 여, 예를 들어, 마우스를 난방을 제공 합니다.</li>
</ol>4. 수술 노출은 Stereomicroscope를 사용 하 여 침 샘의
참고: 다음 단계는 stereomicroscope와 미세 집게, 수술가 위 사용을 해야합니다. 이후 절차는 터미널, 살 균 동작 상태를 유지 하기 위해 필요는 없습니다. 에탄올 청소 기기 충분합니다.
<ol><li>피부 약 15 m m 입과 턱 선의 5 m m 중간의 꼬리에 약간의 돌출을 찾아서 오른쪽 SMG 엽의 대략적인 위치를 찾습니다. 돌출의 중앙에 작은 피부 겹을 들어올린 만들려고 그것과 약 5mm 길이의 오프닝 컷.</li>
	<li>즉시 상처 주변 피부에 진공 그리스의 4 m m 고리를 적용 합니다. (무딘된 25 G 피하 주사 바늘으로 진공 기름 가득 주사기 사용).</li>
	<li>유지 조직 습 한 작업 중에 염 분으로 기름 반지를 채우십시오.</li>
	<li>Stereomicroscope에서 다음 절차를 사용 하 여 결합 조직 방해: 한 미세 집게를 사용 하 여 단단히 잡기는 서울시에 직접 연결 하는 결합 조직의 조각 하 고 그것은 파열 때까지 원심 결합 조직을 두 번째 집게를 사용 하 여. 일부 결합 조직 유지; 서울시에 연결 된 이것은 처리 수 있기 때문에 바람직하다입니다. 이 출혈을 일으킬 것입니다 때문에, 집게와 선 자체를 만지지 마십시오.</li>
	<li>선, 위에 다음 (SMG의 오른쪽과 왼쪽 엽) 사이 중간 측에 먼저 결합 조직 방해의이 동작을 반복 합니다. 삶의 submandibular 동맥에서 분리 하지 마십시오.</li>
	<li>(꼬리, 원심 rostral 하 하 하 중간) SMG 주위 반대 측면 결합 조직 제거를 계속 합니다.</li>
	<li>혈액 공급, 원심 lymphatics 고 침 덕트 모두에 있는 동맥의 두개골 사이트에서 번들, 파열 되지 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>측면 결합 조직 중단 되 면 집게를 사용 하 여 당겨 위쪽으로 리프트는 SMG의 꼬리 끝에 서울시의 꼬리 끝에 연결 하는 결합 조직. SMG 엽 아래 결합 조직 방해는 꼬리에서 시작 하 고 rostral 끝 쪽으로 이동.</li>
	<li>(주요 먹이/배출 혈관와 WD rostral 사이트 제외)는 서울시의 모든 사이트에 결합 조직 제거 될 때까지 계속 합니다.</li>
</ol>5. 고정 선
<ol><li>식 염 수를 들고 그리스 링 4mm 이상 높은 그리고 새 (단계 4.2 참조) 확인 합니다.</li>
	<li>설치 (단계 3.2 참조) 낮은 커버 유리 금속 막대의 높이 조절 가능한 홀더를 연결 하 여. 커버 슬립 홀더 최상의 위치로 조정 되 고 그리스 링 무대에 연결 될 때 터치 하지 않습니다 확인 합니다. 커버 슬립 덮고 대략 3 분의 2 (꼬리와 말 초 부분) 노출된 엽의와 마우스, 약 60 °의 각도에서 꼬리 방향에서 홀더를 배치 합니다. 그것까지 커버 유리를 낮은 선 접촉 하 게.</li>
	<li>새로운 염 저수지를 커버 글라스 위에 그리스 반지를 완료 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 내 커버 슬립 위에 SMG 엽 집게만 만지고 그것에 연결 하는 결합 조직 (기관 위쪽으로 향하게 하는 아래 사이트와 뒤집힌 수 있습니다).</li>
	<li>그리스 링 4mm 이상도 높이, 누설 하지 않습니다 확인 하십시오. 필요한 경우 리필 30 G을 사용 하 여 염 분 저수지 주사기 염 분으로 가득 합니다.</li>
	<li>커버 유리 홀더 상단 커버 유리에 대 한 최상의 위치에 있는지 확인 합니다. 나사를 사용 하 여 소유자를 25 m m 상단 커버 유리 금속 홀더를 연결. 소유자의 조절 나사를 사용 하 여 중간에 SMG를 중심으로 커버 유리를 위치.</li>
	<li>조정 가능한 홀더 나사를 사용 하 여 직접 서울시를 연결 하는 그것 때까지 상단 커버 유리를 낮은. 모양 및이 단계는 동맥의 색을 관찰 합니다. 체 표면적 나타납니다, 또는 착 색 (예를 들어 흰색 분홍색)에서 즉시 변경 하는 경우 서울시에 압력을 완화에 더 높은 위치에 커버 유리를 넣어.</li>
	<li>공기 방울 나 방울 저수지 밖 염 분의 보고 누수에 대 한 식 염 수 저수지를 확인 합니다. 누설 또는 공기 거품을 감지 하는 경우 제거 모두 커버 실수할 하 고는 모든 그리스 및 2 단계에서 다시 시작.</li>
	<li>나사 고정 나사를 모두 종료 하십시오.</li>
</ol>6. 고정 난방 반지 및 온도 프로브
<ol><li>저수지에 온도 프로브를 삽입 하 고 선, 가까운 위치 다음 단계로 프로브 와이어 테이프.</li>
	<li>(그리스 링의 직경 난방 반지의 직경에 해당) 센터에서 서울시와 상단 커버 슬립을 그리스 링을 적용 합니다. 커버 슬립 위에 난방 반지를 놓고 그리스와 함께 인감. 무대에 난방의 배관 테이프.</li>
</ol>7입니다. 영상
참고: 우리는 직 립 2 광자 현미경 시스템 가변 Ti:Sa 레이저와 물 침수 또는 25 X 20 X 목표와 형광 현미경을 사용 합니다. 중 조직 드리프트의 실시간으로 보정 된 자동화 된 단계 및 VivoFollow19를 사용 하 여 구현할 수 있습니다. 이미지 수집의 안정성을 향상 시키지만 필요 하지 않습니다.
<ol><li>현미경 제조업체에서 제공 하는 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 똑바로 현미경 시스템을 켭니다. 780-900 nm 여기 파장에 Ti:Sa 레이저 조정.</li>
	<li>난방 배관 난방 반지에 연결 합니다. 연동 펌프는 SMG를 따뜻하게 반지를 통해 뜨거운 물 (80 ° C 물 목욕에서 튜브의 부분을 물속에 의해가 열)를 순환.</li>
	<li>디지털 온도계를 온도 프로브를 연결 합니다. 온도가 사이 35-39 ° c.의 경우 연동 펌프의 속도 조정 빨리 펌프 작동, 온 열 장치 개체가 되 면 반대로.</li>
	<li>이미지 수집을 시작 하기 전에 혈액 흐름 속도의 시각적 컨트롤을 수행 합니다. 신중 하 게 백혈구 통로 형광 dextran 주입 또는 얇은 모 세관을 통해 확인 합니다. 참고: 정 맥으로 주입 된 형광 dextran 채울 것입니다 즉시 전체 서울시 맥 관 구조에 밖으로 혈액 흐름은 생리 할 때. 이것은 거의 항상이 절차의 경우입니다.</li>
	<li>따라 면역 세포, 이미징 깊이 일반적으로 20-150 µ m 2차 고조파 생성 신호를 구분 하는 SMG의 표면 아래. 픽셀 해상도 약 512 x 512 이상, 150-300 µ m 시야의 기록 이미지 스택 그리고 z 이미지 사이 2-4 µ m의 간격을 가진 20-60 µ m의 깊이. 20-60 분의 총 시간에 대 한 스택 수집 모든 20-30 s를 반복 합니다.</li>
	<li>디지털 온도계를 사용 하 여 하나의 이미지 시퀀스의 취득 후 최소 및 최대 온도 레벨을 제어. 최소 또는 최대 37 ±의 범위에 있지 않은 경우 이미지 시퀀스를 삭제 2 ° c. 이미지 시퀀스 간의 목표의 침수 물 리필.</li>
	<li>이미징 세션의 끝에, 쥐를 마 취 CO2 질 식에 의해 안락사. 참고: 이것은 동물 실험;의 스위스 연방 정부의 지침에 따라 안락사에 대 한 다른 지침 다른 곳에서 적용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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(79), e50558 (2013).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li><li>Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+actions+of+distinct+nonmuscle+myosin+II+isoforms+drive+intracellular+membrane+remodeling+in+live+animals.">Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals.</a> J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).</li><li>Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannulation+of+the+mouse+submandibular+salivary+gland+via+the+Wharton's+duct.">Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct.</a> J Vis Exp. (51), e3074 (2011).</li><li>Chen, G. Y., Nu&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+Sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage.</a> Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).</li><li>McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+causes+of+variation+of+body+temperature+in+mice.">Some causes of variation of body temperature in mice.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).</li><li>Baumgart, K., Wagner, F., Gr&#246;ger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+metabolic+effects+of+hypothermia+and+inhaled+hydrogen+sulfide+in+anesthetized+and+ventilated+mice.">Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice.</a> Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).</li><li>Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+area+of+the+murine+aorta+linearly+increases+with+increasing+core+body+temperature.">Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature.</a> Int J Hyperth. , 1-13 (2017).</li><li>Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CMV+infection+induces+the+continuous+production+of+mucosal+resident+T+cells.">Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells.</a> Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).</li><li>Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li><li>Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).</li><li>Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+interactive+two-photon+photoconversion+of+recirculating+lymphocytes+for+discontinuous+cell+tracking+in+live+adult+mice.">Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice.</a> J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).</li><li>Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).</li><li>Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging.">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).</li><li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+lipid+bilayers+with+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 프로토콜 murine submandibular 고 설 침 샘을 면역학의 분야에서 자주 사용 하는 직 립 비 선형 현미경 검사 법을 사용 하 여의 비보에 이미징에 대 한 간단한 접근을 제공 합니다. 메서드는 머리와 목 지역에 다른 전 샘의 이미징에 대 한 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 실험실 (표시 되지 않음)는 유사한 방식으로 눈물 샘의 이미지를 수행 하고있다.
SMG 주위 결합 ?...

타 액은 음식에 기름칠을, 구두 관의 점 막 표면 보호 항균 물질1,2뿐 아니라 소화 효소를 제공 하 고 전 분 비에 의해 은닉 된다. 구두 submucosa에 산재 된 작은 침 샘은 귀 밑, 설, 그리고 submandibular로 확인 하는 주요 동맥의 3 개의 양자 세트 그들의 위치1,2에 있습니다. 플라스 크 모양의 낭 (acini)으로 구성 된 피라미드 모양의 상피 세포, myoepithelial 세포 및 지하실 막에 의해 포위 된다 demilunes 분 비 타 액1의 장 액 및 점액 구성 요소 또는. 그들은 마침내 단일 배설 덕트1에 가입 때까지 전기 덕트에 결합 삽입 된 덕트로 acini 빼낸의 좁은 luminal 공간. 서울시의 주요 배설 덕트와 튼의 덕트 (WD) 이라고 하 고 설 caruncle3,4로 열립니다. SMG 상피 구획은 따라서 끝점과 매니폴드 터미널, 포도1,,56의 번들을 닮은 높은 arborized 구조를 나타냅니다. SMG interstitium 혈액과 림프 혈관 결합 조직7 8 부 교감 신경 신경 및 세포 외 매트릭스5에 포함 된 구성 됩니다. 일반 인간과 설치류 침 샘은 또한 T 세포, 대 식 세포, 및 수지상 세포9, 뿐만 아니라 플라즈마 세포 분 비 면역 글로불린 (IgA)는 타 액9,10에 포함 되어 있습니다. 건강과 질병에서의 다각적인 기능, SMG은 치과4, 면역학11, 종양학12, 생리학8, 세포 생물학 등 생물학 연구의 많은 분야에 대 한 관심의 대상이 3.
동적 세포질 프로세스와 상호 작용의 이미징 생물학 연구13,14에서 강력한 도구입니다. 깊은 조직 이미징 및 혁신 inmicroscopes 비선형 광학 (NLO)에 따라 산란 또는 샘플에서 여러 개의 광자의 흡수에 의존 하는 개발 복잡 한 조직13 에서에서 세포 프로세스를 직접 검사를 수 있다 15. 여러 개의 광자의 흡수 낮은 에너지 광자, 초점면에 어떤 경계 fluorophore 여기에 의해 총 여기 에너지의 납품의를 포함 하 고 따라서 초점에서 잡음 감소 photodamage와 깊은 조직 침투 수 있습니다. 여기13,15. 이 원리 2 광자 현미경 (2 분)에 의해 고용 하 고 최대 1 m m15,16의 깊이에 형광 표본의 이미징에 대 한 수 있습니다. 사용자 친화적이 고 믿을 수 있는 셋업 되 상용 2 오후 동안 intravital 이미징에 대 한 주요 도전 신중 하 게 노출 하 고 특히 시간 경과 시리즈의 이미지에 대 한 마 취 쥐의 대상 기관 안정입니다. 디지털 드리프트 보정 후 데이터 수집을 위한 여러 가지 방법을 게시17,18 그리고 우리는 최근에 "VivoFollow", 실시간으로 사용 하 여 느린 조직 드리프트를 중화 하는 자동된 보정 시스템 개발을 컴퓨터 단계19. 그러나, 그것은 여전히 고품질 이미징 조직 운동, 호흡 또는 하트 비트19기인 특히 빠른 움직임을 최소화 하기 위해 중요 합니다. 준비 및 안정화 절차 척수20, 간21, 피부22,23, 폐 및 림프 노드24를 포함 하 여 여러 장기에 대 한 출판 되었습니다. 또한, 쥐 침 샘 이미징 모델 개발된3,25 되었고 더 높은 해상도 intravital 이미징 murine SMG는 거꾸로 한 현미경 설치26, 에 맞게의 세련 된 27 , 28.
여기, 선물이 murine SMG의 intravital 이미징에 대 한 실용적이 고 적응력 프로토콜 intravital 이미징 면역학 분야에서 일반적으로 사용 되는 직 립 비선형 현미경을 사용 하 여. 이 위해, 우리는 오 금 림프절 준비에 사용 되는 널리 고용된 immobilization 무대 수정.

<table><tbody><tr><td>Narketan 10 %&amp;nbsp; (Ketamine) 20ml (100 mg/ml)</td><td>Vetoquinol</td><td>3605877535982</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)</td><td>Bayer</td><td>680538150144</td><td></td></tr><tr><td>Saline NaCl 0.9%</td><td>B. Braun</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml)</td><td>Fatro</td><td>6805671900029</td><td></td></tr><tr><td>Electric shaver</td><td>Wahl</td><td>9818L</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Hair removal cream</td><td>Veet</td><td>4002448090656</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td><td>Durapore (3M)</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>Super glue Ultra gel, instantaneous glue</td><td>Pattex, Henkel</td><td>4015000415040</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>631-1343/ 631-1344</td><td></td></tr><tr><td>Grease for laboratories 60 g glisseal N</td><td>Borer (VWR supplier)</td><td>DECO514215.00-CA15</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T )</td><td>14090-09</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T )</td><td>11252-20</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cotton swab</td><td>Migros</td><td>617027988254</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Gauze Gazin 5 x 5 cm</td><td>Lohmann and Rauscher</td><td>18500</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Texas Red dextran 70kDa</td><td>&amp;nbsp;Molecular Probes</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>Cascade Blue dextran 10kDa</td><td>invitrogen</td><td>D1976</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon system</td><td>LaVision Biotec</td><td>TrimScope I and II</td><td>or similar</td></tr><tr><td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective</td><td>Olympus</td><td>n/a</td><td>or other water immersion objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital thermometer</td><td>Fluke</td><td>95969077651</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy

Submandibular 침 샘 (SMG) 3 개의 주요 침 샘의 하나 이며 생물학 연구, 세포 생물학, 종양학, 치과, 면역학 등의 다양 한 분야에 대 한 관심의 이다. 서울시는 전 선 분 비 상피 세포, myofibroblasts, 내 피 세포, 신경, 세포 외 매트릭스의 구성 이다. 쥐와 쥐 SMG에서 동적 세포질 과정 몇 군데 이전 있다, 주로 사용 하 여 거꾸로 다중 광자 현미경 시스템. 여기, 우리는 수술 준비와 똑바로 다중 광자 현미경 시스템 이미징 비보에 마 취 쥐에서 murine SMG의 안정화에 대 한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 우리 생의 대표적인 intravital 이미지 세트를 제시 하 고 adoptively 형광 세포, 혈관 또는 침 덕트 및 원 콜라겐 시각화를 둘째로 고조파 생성의 라벨을 포함 하 여 전송. 합계에서는, 우리의 프로토콜 intravital 이미징 면역학 분야에서 일반적으로 사용 되는 직 립 현미경 시스템에서 마우스 침 샘의 수술 준비를 위해 수 있습니다.

이 프로토콜에는 거의 전체 등 또는 복 부 측면의 SMG의 영상 수 있습니다. 보기의 필드 일반적으로 또한 세포질 구성4서울시에서 약간 다릅니다 설 침 샘을 포함 한다. 두 샘 원 콜라겐에 의해 캡슐화 되며 돌출부를 세분화. 대부분 오후 2 시스템 2차 고조파 신호를 측정 하 여 원 콜라겐의 레이블 없는 이미지를 생성할 수 있습니다 하지만 일반적?...

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Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

우리는 수술 노출 하 고 안정화 murine submandibular 침 샘 intravital 이미징 똑바로 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 머리와 목 지역 쥐 및 다른 작은 설치류의 다른 전 동맥에 쉽게 적응 합니다.

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K 조회수.  University of Bern. 우리는 수술 노출 하 고 안정화 murine submandibular 침 샘 intravital 이미징 똑바로 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 머리와 목 지역 쥐 및 다른 작은 설치류의 다른 전 동맥에 쉽게 적응 합니다.

비디오: Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their head and neck regions for cancer treatment. Both groups of patients experience symptoms such as xerostomia (dry mouth), dysphagia 
(impaired chewing and swallowing), severe dental caries, altered taste, oro-pharyngeal infections (candidiasis), mucositis, pain and discomfort.
One innovative approach of regenerative medicine for the treatment of salivary gland hypo-function is speculated in RS Redman, E Mezey 
et al. 2009: stem cells can be directly deposited by cannulation into the gland as a potent method in reviving the functions of the impaired organ. Presumably, 
the migrated foreign stem cells will differentiate into glandular cells to function as part of the host salivary gland. Also, this cannulation technique is an 
expedient and effective delivery method for clinical gene transfer application.
Here we illustrate the steps involved in performing the cannulation procedure on the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct 
(Fig 1). C3H mice (Charles River, Montreal, QC, Canada) are used for this experiment, which have been kept under clean conventional conditions at 
the McGill University animal resource center. All experiments have been approved by the University Animal Care Committee and were in accordance with the 
guidelines of the Canadian Council on Animal Care.
For this experiment, a trypan blue solution is infused into the gland through the opening of the Wharton's duct using a 
insulin syringe with a 29-gauge needle encased inside a polyethylene tube. Subsequently, the mouse is dissected to show that the infusions migrated 
into the gland successfully.

A protocol for the cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct is described. For this experiment, the trypan blue solution is used as a dyer to demonstrate how this technique effectively delivers infusions into the targeted gland, and to suggest the reliability of this new approach as a potential clinical drug/cell therapy for the regeneration of salivary glands.

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 Cannulation

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

연구

의학

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Retroductal 나노 Murine Submandibular 동맥에 주입

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

생체공학

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. Irreparable cell damage results in a chronic loss of salivary function that impairs basic oral activities, and increases the risk of oral infections and dental caries. Salivary hypofunction and its complications gravely impact a patient's comfort. Current symptomatic management of the condition is ineffective, and newer therapies to assuage the condition are needed. 
Salivary glands are exocrine glands, which expel their secretions into the mouth via excretory ducts. Cannulation of these ducts provides direct access to the glands. Retroductal delivery of a contrast agent to major salivary glands is a routine out-patient procedure for diagnostic imaging. Using a similar procedure, localized treatment of the glands is feasible. However, performing this technique in preclinical studies with small animals poses unique challenges. In this study we describe the technique of retroductal administration in rat submandibular glands, a procedure that was refined in Dr. Bruce Baum's laboratory (NIH)1, and lay out a procedure for local gland irradiation.

Salivary gland hypofunction, a major adverse effect of head and neck radiotherapy diminishes a patient's quality of life. The demonstration of efficacy of new therapies in animal models is a prerequisite before clinical transition. This protocol describes retroductal administration and local irradiation of rat submandibular glands.

타액 기능 저하의 쥐 모델에서 Retroductal 턱밑 글 랜드 점적 및 현지화 된 분획 조사

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

생물학

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In these cases, questions remain regarding disease pathogenesis and effective interventions. An optimized technique that allows functional assessment of the salivary glands is invaluable for investigating exocrine gland biology, dysfunction, and therapeutics. Here, we present a step by step approach to performing pilocarpine stimulated saliva secretion, including tracheostomy and the dissection of the three major murine salivary glands. We also detail the appropriate murine head and neck anatomy accessed during these techniques. This approach is scalable, allowing for multiple mice to be processed simultaneously, thus improving the efficiency of the work flow. We aim to improve the reproducibility of these methods, each of which has further applications within the field. In addition to saliva collection, we discuss metrics for quantifying and normalizing functional capacity of these tissues. Representative data are included from submandibular glands with depressed salivary gland function 2 weeks following fractionated radiation (4 doses of 6.85 Gy).

We present a detailed approach to performing saliva collection, including murine tracheostomy and the isolation of three major salivary glands.

Pilocarpine 자극 다음 통해 murine 침 기능 평가 분류 한 방사선

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

마우스 턱밑샘 재생의 실시간 실시간 이미징

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

저자 스포트라이트: Studying Macrophage-Epithelial Cell Interactions in Salivary Gland Regeneration After Injury(부상 후 타액선 재생에서 대식세포-상피세포 상호작용 연구) 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

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Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

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