Biz yararlı tartışmalar için Drs. Victoria Bautch ve Joshua Boucher teşekkür ederim ve standart boncuk en iyi duruma getirme konusunda tavsiye tahlil koşulları ve filizlenen bir tahlil Protokolü boyama, çimlenme. S.H.A. kısmen bir hibe--dan ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü altında tarafından desteklenen 5T32 GM007092 ödül.

1. gün:
1. geçici Transfection endotel hücrelerinin
<ol><li>İstenirse, geçici transfection, insan göbek damar endotel hücreleri (gen düzenleyici oligonucleotides (örneğin mikro RNA'lar veya küçük müdahale RNA (siRNA)) ve uygun lipofectamine reaktif göre kullanarak HUVEC) gerçekleştirmek prosedürü yerine getirin. Not: Bu protokol özel siRNA dizileri ve ticari transfection reaktifi (bkz: malzemeler tablo) ile ters transfections gerçekleştirme büyük başarı elde etti. Yazarlar diğer transfection protokolleri ve Kimyasalları bu tahlil ile test etmedim. Listelenen reaktifler kullanarak geriye doğru transfection için adımlar şunlardır:</li>
	<li>Liyofilize çift veya mikroRNA'lar nükleaz boş su 20 µM bir konsantrasyon, yeniden oluşturma.</li>
	<li>Transfection çözümleri aşağıdaki oranında olun: siRNA veya mikroRNA 9 µL ile 1 mL serum Ücretsiz medya.</li>
	<li>Çözüm tahrik ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya sağlar.</li>
	<li>Transfection reaktif 18 µL ekleyin ve kışkırtmak.</li>
	<li>20-40 dk, çözüm kışkırtmaktan için oda sıcaklığında her 10-15 dk kuluçka süresi için kuluçkaya çözüm izin verin.</li>
	<li>Transfection çözüm kuluçka iken, bir hücre dekolmanı çözümü (örneğin, Accutase) kullanarak HUVEC bağlantısını kesin. Bir T175 şişesi için 10 mL, fosfat tamponlu tuz (PBS), ile şişeye yıka ve hücre dekolmanı çözümü 5 mL ekleyin ve şişeye 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Komple medya 5 mL T175 şişeye ekleyin, hücre süspansiyon şişesi ve 3 dak için 1200 rpm'de santrifüj kaldırın.</li>
	<li>Bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet EGM2 mL başına 1 X 106 hücre yoğunluğu, resuspend. Not: Bu protokol endotel hücre büyüme standart büyüme faktörü kurşun kiti yanı sıra ek bir % 10 içeren orta (EGM2) kullanarak büyük bir başarı olmuştur FBS.</li>
	<li>Transfection çözüm kuluçka tamamladığında, 1 mL çözeltisi 10 cm plaka plaka ve HUVEC süspansiyon 1 mL üstüne ekleyin.</li>
	<li>Son hacim için 9 mL 10 cm tabak içinde getirmek için tam ortam bir ek 7 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücre yeterince hücre tahlil'sonraki adımlarında için kullanılabilir olduğundan emin olmak her transfection koşul için en az iki 10 cm tabak oluşturur. Not: Bu koşullar gen düzenleyici Oligonükleotid 20 son çalışma konsantrasyon içinde yol nM. Yazarlar bu koşullar % 60-80'i nakavt hedeflerine ilgi için gen ifadesinin neden bulduk. Diğer araştırmacılar transfection koşulları deneysel onların ihtiyaçlarına göre en iyi duruma getirmek gerekir.</li>
	<li>SiRNA kompleksleri ile taze komple medya medya 4-6 h mesaj ilavesi değişimi. Not: Bu protokol geçişi kullanarak geliştirilmiştir 1-2 HUVEC.</li>
</ol>2. gün
2. Microcarrier boncuk endotel hücreleri ile kaplanması
<ol><li>Microcarrier boncuk (örneğin, Cytodex 3) 60.000 boncuk/mL PBS ve basınçlı kap bir konsantrasyon, yeniden oluşturma. Not: microcarrier boncuk bir konsantrasyon yaklaşık 3 x 106 boncuk gram başına gelir. Sulandırmak boncuk boncuk boncuk yoğunluğu yaklaşık 60.000 boncuk/mL ile almak için PBS mL başına 20 mg oranında.</li>
	<li>Yuvarlak popolu Floresans aktif hücre sıralama (FACS) tüpler için istediğiniz sayıyı tam medya aliquot 1 mL.</li>
	<li>Microcarrier boncuk süspansiyon, 20 µL pipet (Boncuk çözüm de pipetting önce resuspended emin olmak için göz kulak) her tüpün içine. Not: Büyük olasılıkla olacak dramatik değişkenlik son çalışma konsantrasyon boncuk bir verilen microcarrier boncuk süspansiyon mevcut. Boncuk boncuk konsantrasyon çözüm büyük ölçüde değiştirebilir plastik ve cam kapları kenarlarına kolayca uygun. FACS tüp microcarrier boncuk süspansiyon, her toplu iş için eklenen boncuk çözüm en uygun hacmi ampirik olarak araştırmacı tarafından belirlenecektir gerekir. Burada gösterilen sayilar daha bir başlangıç noktası olarak hizmet etmek içindir. İdeal olarak, 10-20 boncuk 24 iyi plaka tahlil sonunda iyi başına fibrin jel içinde gömülü böylece koşulları optimize edilmelidir. Tahlil için boncuk numaraları duruma getirilmesi ile ilgili olarak aşağıda tartışma bölümünde daha fazla tartışma bakın.</li>
	<li>Transfected HUVEC 24 s yazı transfection hücre dekolmanı çözümü aşağıdaki gibi kullanarak bağlantısını kesin:<ol>
<li>Hücreleri PBS, 5 mL ile her 10 cm tabak yıkama ve hücre dekolmanı çözümü 2 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
		<li>1 X 106 hücre/mL tam medyada bir konsantrasyon hücreleri resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre süspansiyon (Yani 1 X 106 HUVEC) 1 mL boncuk içeren her FACS tüp ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça FACS tüpler her 20 dk boyunca 4 37 ° C (3,4 adıma devam değilse) veya 2.5-3 h h (3.2 adıma devam eğer) tahrik. Not: Bu süre ve sıklıkta ajitasyon ampirik olarak belirledi tahlil çimlenme temel boncuk optimize önceki araştırmacılar tarafından. 4 Ajitasyon diğer frekansları ve boncuk kaplama adım sürelerini yazarlar tarafından sınanmamıştır.</li>
</ol>3. perisitlerden HUVEC kaplı Microcarrier boncuk üzerinde sıralı kaplama
<ol><li>Hücre dekolmanı çözümü (tripsin) aşağıdaki gibi kullanarak 10T1/2 hücreleri (perisitlerden) ayırma başlar:<ol>
<li>PBS, 10 mL ile T175 şişeye yıka o zaman tripsin 5 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>2 X 105 hücreleri/0.5 mL tam medyada bir konsantrasyon, 10T1/2 resuspend. Not: Hücreler Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) üzerinden satın alındı. Not: Kültür 10T1/2 hücre içinde en az gerekli orta (MEM) penisilin streptomisin %10 FBS ve % 1 ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tantanacı boncuk + HUVEC çözüm, 2.5-3 h sonra boncuk ve serbest yüzer HUVEC tüp altına yerleşmek izin vermek için 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>0.5 mL tam medya P1000 pipet kullanarak her tüpünden kaldırın ve 2 x 105 10T1/2 0.5 mL hacminde tam medyada her FACs tüp ekleyin. Hücre ve boncuk çözüm tahrik ve 37 ° C'de kuluçkaya devam Boncuk 4 h toplam için heyecanlı kadar her 20 dk kışkırtmak devam edin. Not: 5 HUVEC oranı: boncuk üzerinde 1 pericyte uygun pericyte kapsama damarlarının korumak için önemlidir. Not: Aşağıdaki alternatif adımlar yerine protokol bu noktada izlenebilir:</li>
	<li>Boncuk ve HUVEC sadece 4 h için tahrik.</li>
	<li>HUVEC kaplama microcarrier boncuk 4 h tamamlandıktan sonra son kez tüpler kışkırtmak, 30-60 s bekleyin sonra derhal 1,5-1,75 mL çözeltisi FACS tüpünden kaldırın. Not: Bu çoğu medya birçok serbest yüzer HUVEC kaldırılacak iken yerleşmek için boncuk için yeterli zaman izin vermelidir.<ol>
<li>2 X 105 10T1/2 tam medya ekleyin ve FACS hacmi getirmek 2 mL tüp.</li>
		<li>Yavaşça FACS tüpler her 20 dakikada bir ek saat için tahrik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tantanacı tamamlandıktan sonra yavaşça tüpler son kez kışkırtmak ve hemen tüm çözüm (2 mL) kaldırın ve 6 cm plakasına ekleyin. Komple medya bir ek 3 mL her plakasına eklemek ve tabakları da 37 ° C kuluçka makinesine gecede yerleştirin.</li>
</ol>3. gün
4. Fibrin jel çözümleri hazırlanması
<ol><li>Çalışma çözümleri konsantrasyonu 1 mg/mL PBS, aprotinin ve Trombin 50 adet/mL, hazır olun. Not: Bu çözümlerin her biri büyük bir hisse senedi yapılan ve en az bir yıl için 4 ° C'de depolanan.</li>
	<li>Fibrinojen taze bir çözüm 2 mg/mL konsantrasyonu olun. Çözüm heyecanlı FACS tüp başına 2.5 mL için yeterli bir çözüm yapmak.<ol>
<li>Çözüm çözüm gitmek fibrinojen izin vermek üzere 10 dk 37 ° C su banyosunda ısıtın.</li>
		<li>37,5 µL aprotinin çözüm başına 1 mL fibrinojen çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Steril-filtre çözümü ve oda sıcaklığında kenara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. boncuk jel implantasyon için hazırlanması
<ol><li>Tüm boncuk endotel hücreleri tarafından yeterince kaplı olduğunu emin olmak için 20 X objektif kullanma mikroskop altında microcarrier kaplı boncuk içeren yemekler inceleyin.</li>
	<li>Şiddetle onları 6 cm plaka ayırmak ve çözüm bir tüpün içine yerleştirmek için hücre kaplama çözüm pipette. Plaka 2 X ek kez komple medya ve plaka şeklinde olması gereken tüm kalıntı boncuk toplamak için tüp transferi ile yıkayın.<ol>
<li>Hava kabarcıkları tanıtımı önlemek ve p1000 pipet endotel hücre kaplı boncuk kesme stresi en aza indirmek için kullanın.</li>
		<li>SiRNA devirme verimliliği endotel hücrelerinde değerlendirirken, adım 2, gerektiğinde salt HUVEC kaplı boncuk bir plaka var emin olun. O zaman bu adımda (5.2), boncuk bağlantısını kesin ve HUVEC plaka RNA izolasyon ve qPCR çözümleme bağlı kalan toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Boncuk çözüm tüp altına yerleşmek için izin vermek için 3 dakika bekleyin.</li>
	<li>P1000 pipet ucu kullanarak boncuk Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın (vakum aspiratör kullanmayın).</li>
	<li>Her tüpün tam medya 1 mL ekleyin ve boncuk resuspend.</li>
	<li>Boncuk altına yerleşmek izin vermek için 30-60 s bekle. Sonra büyük bir kısmını mümkün P1000 pipet boncuk Pelet bozmadan kullanmakla süpernatant kaldırın. Yanlışlıkla boncuk Pelet kaldırma olasılığı büyük ölçüde artırılır bir vakum aspiratör kullanmayın.</li>
	<li>5.5 veya 5.6 iki ek kez arasındaki adımları yineleyin. Daha fazla 6 cm plaka mümkün olduğunca çok fazla HUVEC kaplı boncuk FACS tüpünde yüzen hücreleri daha hızlı bir şekilde yerleşmek kaldırılırken değil ayırdıktan serbest yüzer HUVEC kaldırmak için hedeftir.</li>
	<li>1 mL tam medya için boncuk ekleyin.</li>
</ol>6. katıştırma Fibrin jel boncuklar kaplı
<ol><li>P1000 pipet kullanarak her FACS tüp boncuk Pelet bozmadan mümkün olduğu kadar medya kaldırın.</li>
	<li>Boncuk 2.5 mL fibrinojen çözüm resuspend.</li>
	<li>Her şey bir 24-şey cam popolu tabak istenen içine Trombin çözüm 13 µL pipet. Kaplama cam popolu bir tabak içinde filizi en uygun görüntüleme etkinleştirmek için gereklidir. Not: birden fazla 5-10 dk önce bir sonraki adım için iyi oturan Trombin bırakmayın.</li>
	<li>Her şey için 0.5 mL boncuk/fibrinojen çözeltisi ekleyin.<ol>
<li>Her zaman çözüm pipetting önce de boncuk çözüm resuspend emin olun.</li>
		<li>Dikkatle doğrudan kuyuda zaten mevcut Trombin pipet için dikkatli. Yavaş yavaş aşağı yukarı 2 - 3 kez için pipet herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat çekici çözüm, iyice karıştırın.</li>
		<li>Pipet ucu kuyular arasında değiştirdiğinizden emin olun.</li>
		<li>Taşımak ya da herhangi bir hareket jel oluşumu engel olabilecek gibi pıhtılaşma, ilk fibrin sırasında herhangi bir noktada plaka rahatsız değil dikkatli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mahalle için oda sıcaklığında 30 dk içinde oturan plaka bırakın.</li>
	<li>Dikkatle plaka 37 ° C kuluçka jel tamamen kuvvetlendirmek izin vermek ek bir 1,5-2 h için transfer</li>
</ol>7. fibroblastlar Fibrin jel üstüne kaplama
<ol><li>Son 30 jel güçlendirilerek, min sırasında Normal insan akciğer fibroblastlar (NHLF) aşağıdaki şekilde bağlantısını kesin:<ol>
<li>Hücreleri bir T175 şişesi PBS, 10 mL ile yıkayın sonra hücre dekolmanı çözümü 5 mL ekleyin ve 10 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>20.000 hücre/mL tam medyada bir konsantrasyon, NHLF resuspend. Not: NHLF hücreleri ile Dulbecco modifiye kartal orta (%10 FBS ve % 1 ile DMEM) kültürlü penisilin streptomisin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NHLF hücre Süspansiyon Jel her şey üzerine 1 mL plaka ve kuluçka makinesine koyun.</li>
	<li>Komple medya tahlil süresince her gün değiştirin.</li>
</ol>8. fibrin jel boncuk implantasyon 2-7 gün boyunca çimlenme izleyin. Çimlenme için gereken sürenin uzunluğu HUVEC geçit ve çok sayısına bağlı olacaktır.
9. fiksasyon tahlil çimlenme
<ol><li>Bir kez yeterli çimlenme tedavi grupları arasındaki fenotipik farkı belirlemek, Bütün wells PBS 2 mL ile bir kez yıkamak için oluştu.</li>
	<li>Her şey için hücre dekolmanı çözümü 0.5 mL ekleyin ve 5 min için 37 ° C kuluçka plaka yerleştirin.</li>
	<li>Plaka da kuluçka kaldır ve plaka tarafında dokunun. Not: Bu adımın amacı olabildiğince fazla fibrin jel antikor penetrasyon jel gibi görüntüleme jel içine kolaylaştırmak mümkün olduğunca üst üste büyüyen NHLF hücrelerinin kaldırmaktır. Hücre dekolmanı çözümü toplam kuluçka zamanla NHLF kaldırma optimize etmek için ayarlanması gerekebilir. Araştırmacılar hücre dekolmanı çözümü jel nüfuz ve endotel yapıları içinde engellemeden başlar gibi jel aşırı süreler için kuluçkaya değil için uyardı.</li>
	<li>Bir kez NHLF hücreleri yeterli miktarda çıkarmak, hücre dekolmanı çözümü 1 mL tam medya ile gidermek.</li>
	<li>Müstakil NHLF ve bir vakum aspiratör kullanarak medya Aspire edin ve wells bir kez PBS 1 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Her şey için PBS içinde 300 µL % 2 paraformaldehyde çözüm ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>% 2 paraformaldehyde çözümü kaldırmak ve her biri de 3 kez PBS 1 mL 3 dakika oda sıcaklığında yıkayın. Not: Lütfen % 2 paraformaldehyde çözüm çevre sağlığı ve güvenliği (EHS) yönergeleri doğrultusunda uygun şekilde atın.<ol>
<li>Her şey ve 4 ° C'de hazır kadar leke veya lahanası resim depolamak için PBS 1 mL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. tahlil çimlenme boyama
<ol><li>Triton-X 100 her PBS'iyi ve 30-45 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya % 0,5 300 µL ekleyin.</li>
	<li>Bir vakum aspiratör kullanarak, Triton-X100 kaldırın ve 3 kez her 5 min için PBS içinde yıkayın.</li>
	<li>Her jel çözüm engelleme 500 µL ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Engelleme çözüm aşağıdaki bileşenlerden oluşur: %1 sığır serum albumin (BSA), %5 FBS, % 0,1 ara-20 ve % 1 Anti-serum (ikincil antikorlar türetildiği aynı tür) PBS içinde.</li>
	<li>Engelleme çözüm her kuyudan kaldırın ve her şey için birincil antikor içeren boyama çözümün 300 µL ekleyin. Not: Boyama çözüm engelleme çözüm olarak, ancak mevcut anti-serum aynıdır. Yazarlar, 1: 200 1: 400 için dilutions birincil antikorlar ile kuluçka başarıya sahiptir.</li>
	<li>4 ° C'de 24 h için çözüm boyama içinde birincil antikorlar kuluçkaya</li>
	<li>Birincil antikor çözüm Aspire edin ve 3 kez TBS içinde % 0.5 ara 20 dk her oda sıcaklığında hafif sallanan ile yıkayın. Üçüncü yıkama sonra taze yıkama arabellek ile tekrar yerine ve gecede 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 2 h için çözüm boyama içinde seyreltilmiş floresan antikor ikincil 1: 1000 ile kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor boyama çözümü kaldırmak ve 5 kez 20 dk için her oda sıcaklığında hafif sallanan ile % 0.5 arayı içeren TBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS nükleer leke sulandırmak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Bu protokol PBS seyreltilmiş Höchst 1:10000 ile büyük bir başarı olmuştur. Not: Görüntüleme önce nükleer boyama çözümü kaldırmak için gerek yoktur.</li>
	<li>Görüntü en uygun floresan sinyal yakalamak için boyama tamamlama bir kaç gün içinde.</li>
</ol>11. tahlil Quantification çimlenme
<ol><li>Filizi yansıma sonra görüntü dosyaları ImageJ almak ve Brüksel lahanası saymak için sayma aracı veya Filiz uzunlukları ölçmek için Çizgi aracını kullanın. Not: Lahanası endotel çıkıntılar uzunluğu sıfırdan büyük veya eşit hangi onlar çimlenme boncuk çapı olarak tanımlanır. 11 Filiz uzunluğu Filiz Filiz ucuna boncuk kapalı çıkıntılı başlar noktadan mesafe olarak ölçülebilir. Ortalama uzunluğu boncuk başına Filiz ve filizi boncuk başına ortalama sayısı angiogenez çimlenme gen damping fenotipik etkiler değerlendirmek için yararlı ölçümlerdir. Tedavi grubu başına en az bir filiz içeren boncuk ortalama sayısı da bir ölçü olarak çimlenme sağlamlık değerlendirmek için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders.">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li><li>Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurorestorative+therapies+for+stroke:+underlying+mechanisms+and+translation+to+the+clinic.">Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic.</a> Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis.">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).</li><li>Sims, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pericyte--a+review.">The pericyte--a review.</a> Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Tattersall, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+endothelial+interaction+with+macrophages+and+pericytes+demonstrates+Notch+signaling+function+in+the+vascular+microenvironment.">In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment.</a> Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).</li><li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+tumor+vasculature:+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy.">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li><li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+angiogenesis+and+its+assays.">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li><li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis.">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li><li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis:+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation.">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı için karmaşık aşamaları ve araştırmacı ayrıntılı mekanik soruşturma yapma genetik ve görüntüleme yaklaşımlar istihdam sağlayarak angiogenez çimlenme heterotypic hücresel etkileşimlerin karakterize bir yöntem sunuyor. Tahlil gerçekleştirirken, verimli endotel kaplama boncuk boncuk sırasında ajitasyon adımlar yer alır gereklidir. Zavallı endotel kaplama boncuklar bir golf topu gibi pütürlü yüzeyi jel implantasyon öncesinde ertesi sabah olması ve bunun yerine tamamen d...

Angiogenez uygun embriyo ve yara iyileşmesi için hayati önem taşımaktadır ve bu da kanser ilerleme1 ve koroner arter hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda hastalıklarda kilit rolü oynar. 2 , 3 daha iyi anlamak nasıl angiogenez normal gelişim sırasında oluşur ve nasıl patolojik bağlamlarda yeniden sahip roman, etkili tedavi gelişimi için önemlidir. Önemli aşamaları ve hücre tipleri angiogenez vivo içinde içinde yer alan özetlemek sadık vitro modelleri araştırmacılar daha iyi angiogenez sürüş moleküler mekanizmaları karakterize ve yeni keşifler yapmak için izin vermek için gerekir endotel yönetmelikte.
Nakatsu ve Hughes angiogenez çimlenme, çok bilinen aşamaları uğrar göstermiştir filizlenen bir boncuk tahlil optimize. 4 , 5 burada sunulan yöntemin amacı parakrin ve juxtracrine rollerinin çimlenme endotel hücre duvar hücrelerinin içinde dahil edilebilir Nakatsu ve Hughes tarafından perictyes tahlil içine dahil ederek optimize tahlil üzerine inşa etmektir roman angiogenez çalışmalar. Perisitlerden kendi içinde damar membran gömülü nedeniyle endotel hücreleri ile fiziksel temas korumak hücreleri kapatmak gibi onların rol tarafından tanımlanan duvar hücrelerdir. 6 perisitlerden ve endotel hücreleri karmaşık çapraz-hadis yollar çentik dahil olmak üzere sinyal aracılığıyla sinyal, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ ve diğer pek çok meşgul. 7 , 8 fare modelleri bu sinyal yollar eksik embriyogenez, zavallı vasküler remodeling için önde gelen damarlara ve işlevsel olmayan damarlara geliştirme zavallı pericyte kapsama göstermektedir. 7 Ayrıca, önemli ama oftentimes altında takdir perisitlerden patolojik angiogenez rolü vardır. Örneğin, bir benzersiz tümör damarlara damarları daha olgunlaşmamış, sızan ve zavallı pericyte kapsamı nedeniyle işlevsiz özelliğidir. 9 perisitlerden olup önemli ölçüde tümör kan damarlarının fenotip etkileri ve yanıt anjiogenik ve antitümör tedaviler önemli bir arabulucu olduğunu önerilmiştir. 9 böylece, vitro deneyleri perisitlerden rolü dahil olmak üzere daha eksiksiz endotel Yönetmeliğin önemli mekanizmalar yakalamak için anahtardır.
Şu anda angiogenez çalışmaya istihdam birçok vitro ve ex vivo deneyleri olmakla birlikte, her göz önünde bulundurulacak eksiklikler bulunmaktadır. Endotel proliferasyon ve endotel geçiş deneyleri, gibi bazı aşırı Basitleştirilmiş ve odak üzerinde doku kültürü plastik yalıtılmış bir ortamda bir endotel fonksiyonları üzerine. 10 Matrigel tüp oluşumu tahlil,10 ama bu deneyleri hala oversimplified ve daha fazla göç ve de novo vasküler endotel hücreleri yeteneği üzerinde odaklanmak gibi diğer deneyleri bir daha fazla 3 boyutlu (3D) ayarı, ortaya yapıları, önceden varolan damarlara çimlenme aksine. Ayrıca, bu deneyleri hiçbiri duvar hücre tipleri dahil. Perisitlerden ana organ mevcut dahil ex vivo modeli yüzük aort tahlil gibi ama bu modellerin genetik manipülasyon olduğunu çok daha nakavt veya transgenik fare modelleri üreten gerekliliği nedeniyle zor yollar ilgi. Endotel çimlenme, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve 3D matris bile anastomoz ve Lümen oluşumunda modelleri çünkü tahlil çimlenme boncuk idealdir. 4 tahlil Sadakatle çimlenme, hala doğrudan genetik değişiklik endotel hücreleri veya daha kontrollü bir ortamda perisitlerden için izin verirken birçok farklı aşamalarında mekanik değerlendirmesini sağlar. Çimlenme boncuk içeren fibrin pıhtısı kolayca sabit, lekeli ve çimlenme farklı aşamalarında görüntüsü; Bu lahanası da çimlenme, gerçek zamanlı görüntüleme gerçekleştirmek için canlı bir görüntüleme odasında yerleştirilebilir. Burada sunulan metodoloji angiogenez derinlik fenotipleme ile temel mekanizmaları ve anjiogenezi sırasında aktif yollar ayrıntılı analizi eğitimi için idealdir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>HUVEC Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11095114</td>
			<td>10T1/2 Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td>NHLF Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-grade PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>For lifting HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15050065</td>
			<td>For lifting 10T 1/2 and NHLF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customs siRNAs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10T 1/2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHLF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex 3 microcarrier beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>t9549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>a3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator and hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well glass bottom plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G1.513F</td>
			<td>Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtration Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay

Angiogenez önceden varolan damarlara yeni gemileri büyüme ve oküler ve kardiyovasküler hastalıklar ve embriyo ve geliştirme, yara iyileşmesi, tümör büyüme ve metastaz, gibi birçok biyolojik süreçleri önemli bir bileşenidir. Biyoloji angiogenez özetlemek etkili vitro modelleri uygun şekilde bu işlem çalışma ve sonuçta hedeflenebilir düzenleme mekanizmaları için yeni tedavi stratejileri belirlemek için gereklidir. Boncuk angiogenez tahlil daha önce birden fazla aşamalarında endotel çimlenme özetlemek için göstermiş olduğu tüp bebek. Ancak, bu testin bir sınırlama bir olmaması, endotel – duvar hücre etkileşimleri, endotel hücre moleküler ve fenotipik Yönetmeliği anahtarıdır vivoişlev. Burada verilen protokol duvar hücreleri birleşme boncuk angiogenez tahlil içine bir metodoloji sunar ve sıkı Derneği endotel hücreleri ve perisitlerden çimlenme içinde vitrosırasında gösterir. Protokol Ayrıca siRNA endotel hücrelerinde mekanik çalışmaları için kullanarak hedef genlerin etkili susturulması için bir metodoloji ayrıntıları. Özet olarak, bu iletişim kuralı daha uygun farklı hücre tipleri angiogenez çimlenme dahil modelleri ve terapötik değerlendirme ve roman keşfi için daha fizyolojik-alakalı bir platform sağlayan bir vitro tahlil sağlar angiogenez düzenleme mekanizmaları.

Bu iletişim kuralı iki hücre türleri in vitro sıkı bir Derneği için izin verir ve perisitlerden varlığı çimlenme (şekil 1A, B) oluşumunu tamamlar. Sağlayan protokol Ayrıca etkili susturmak (örneğin RNA müdahale yoluyla) bir genin bir hücre tipi faiz (özellikle de endotel hücreleri VEGFA) veya perisitlerden PDGFRβ gibi7,12 ilgi tahlil sırasınd...

Watch this Scientific Journal Video about Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay at JoVE.com

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

incorporating-pericytes-into-an-endothelial-cell-bead-sprouting-assay

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.9K Görüntüleme.  University of North Carolina at Chapel Hill. Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Video: Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.