Wir danken Dr. Victoria Bautch und Joshua Boucher für hilfreiche Gespräche und Beratung bei Optimierung standard Wulst sprießen Assay-Bedingungen und eine sprießende Assay Färbeprotokoll. S.H.A. wurde teilweise unterstützt durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences unter 5T32 GM007092 zu vergeben.

Tag 1:
(1) transiente Transfektion von Endothelzellen
<ol><li>Falls gewünscht, führen Sie eine transiente Transfektion der menschlichen Nabelschnur Vein Endothelial Zellen (HUVECS) mit gen-regulatorische Oligonukleotide (z. B. Mikro-RNAs oder kleine interferierende RNA (SiRNA)) und das entsprechende Lipofectamine Reagenz nach Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Dieses Protokoll hat großen Erfolg reverse Transfektionen mit benutzerdefinierten SiRNA-Sequenzen und einem kommerziellen Transfection Reagens (siehe Materialtabelle) durchführen. Die Autoren haben nicht andere Transfektion Protokolle und Reagenzien mit dieser Assay getestet. Die Schritte für die umgekehrte Transfektion mit den Reagenzien aufgeführt sind wie folgt:</li>
	<li>Wiederherzustellen Sie lyophilisierter SiRNAs oder Micro-RNAs in einer Konzentration von 20 µM im freien Wasser Nuklease.</li>
	<li>Machen Transfektion Lösungen im folgenden Verhältnis: 1 mL Serum freie Medien mit 9 µL SiRNA oder MicroRNA.</li>
	<li>Rühren Sie die Lösung und lassen Sie es für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>18 µL Transfection Reagens der Projektmappe hinzufügen und rühren.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung alle 10 bis 15 min bei Raumtemperatur für 20-40 min, rühren die Lösung für die Dauer der Inkubation auszubrüten.</li>
	<li>Während die Transfektion Lösung Inkubation ist, lösen Sie HUVECS mit einer Zelle Ablösung Lösung (z.B.Accutase). Waschen Sie für eine Flasche T175 die Flasche mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und dann fügen Sie 5 mL der Zelle Ablösung Lösung und inkubieren Sie den Kolben bei 37 ° C für 10 min.</li>
	<li>T175-Flasche fügen Sie 5 mL komplette Medien hinzu, entfernen Sie die Zellsuspension vom Kolben und Zentrifuge bei 1200 u/min für 3 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuum-Sauger und Aufschwemmen der Zelle Pellet bei einer Dichte von 1 X 106 Zellen pro mL in EGM2. Hinweis: Dieses Protokoll hatte großen Erfolg mit Endothelial Zelle Wachstum (EGM2)-haltigem Medium der standard Wachstumsfaktor-Kugel-Kit sowie zusätzlich 10 % FBS.</li>
	<li>Sobald die Transfektion Lösung Inkubation beendet, 1 mL der Lösung in einer 10-cm-Platte-Platte, und fügen Sie 1 mL der Suspension HUVECS an der Spitze.</li>
	<li>Fügen Sie eine zusätzliche 7 mL komplette Medien bringen das Endvolumen in der 10-cm-Platte auf 9 mL.</li>
	<li>Mindestens zwei 10 cm Platten einen Wert von Zellen für jede Transfektion Bedingung um sicherzustellen, dass für spätere Schritte in der Probe gibt es genügend Zellen bilden. Hinweis: Diese Bedingungen führen zu eine Endkonzentration von Arbeiten von gen regulatorischen Oligonukleotid von 20 nM. Die Autoren haben diese Bedingungen ergeben einen Zuschlag von 60-80 % der Genexpression für ihre Ziele von Interesse gefunden. Andere Forscher müssen möglicherweise Transfektion Bedingungen experimentell bedarfsgerecht zu optimieren.</li>
	<li>Tauschen Sie die Medien 4-6 h Post Zugabe von SiRNA-komplexe mit frischen komplette Medien. Hinweis: Dieses Protokoll wurde entwickelt mit Durchgang 1-2 HUVECS.</li>
</ol>Tag2
2. Beschichtung von Microcarrier Perlen mit Endothelzellen
<ol><li>Bereiten Sie Microcarrier Perlen (z.B., Cytodex 3) in einer Konzentration von 60.000 Perlen/mL PBS und Autoklaven. Hinweis: Microcarrier Perlen kommen in einer Konzentration von ca. 3 x 106 Perlen pro Gramm. Bereiten Sie die Perlen in einem Verhältnis von 20 mg Perlen pro mL PBS eine Perle-Dichte von ungefähr 60.000 Perlen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Aliquoten 1 mL der komplette Medien in die gewünschte Anzahl von runden Talsohle Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACS) Röhren.</li>
	<li>Pipette 20 µL Microcarrier Wulst Suspension in jedem Röhrchen (Achten Sie darauf, sicherzustellen, dass die Perle Lösung gut vor dem Pipettieren Nukleinsäuretablette ist). Hinweis: Es werden wahrscheinlich dramatische Variabilität in die Endkonzentration Arbeiten aus Perlen in einer bestimmten Microcarrier Wulst Suspension vorhanden. Perlen können leicht an den Seiten des Kunststoff- und Glasbehältnissen haften die Wulst-Konzentration in der Lösung stark verändern können. Das am besten geeignete Volumen der Wulst Lösung hinzugefügt, um die FACS-Röhre für jede Charge Microcarrier Wulst Aussetzung müssen durch den Prüfarzt empirisch ermittelt werden. Die hier vorgestellten Zahlen sollen mehr als Ausgangspunkt dienen. Im Idealfall sollten Bedingungen optimiert werden, so gibt es 10-20 Perlen eingebettet in das Fibrin-Gel pro Bohrloch in der 24-well-Platte am Ende des Tests. Sehen Sie weitere Diskussion im Diskussion Abschnitt unten zur Optimierung der Perlen-Nummern für den Assay.</li>
	<li>Lösen Sie transfizierten HUVECS 24 h Post Transfektion mit der Zelle Ablösung Lösung wie folgt:<ol>
<li>Jede 10-cm-Platte von Zellen mit 5 mL PBS, waschen und dann 2 mL der Zelle Ablösung Lösung hinzufügen und die Zellen bei 37 ° C für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Die Zellen in einer Konzentration von 1 X 106 Zellen/mL in komplette Medien aufzuwirbeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Zellsuspension (d. h. 1 X 106 HUVECS) zu jedem FACS-Röhrchen mit Perlen.</li>
	<li>Schütteln Sie sanft die FACS-Rohre alle 20 min für die Dauer von 4 h bei 37 ° C (wenn in Schritt 3.4 ausgehend) oder 2,5 bis 3 h (Wenn Schritt 3.2). Hinweis: Diese Dauer und Häufigkeit der Agitation empirisch festgestellt wurde von früheren Forschern, die das grundlegende Korn sprießen Assay optimiert haben. 4 Andere Frequenzen Agitation und Dauer der Wulst Beschichtung Schritt wurden von den Autoren nicht getestet.</li>
</ol>(3) sequentielle Beschichtung von Perizyten auf HUVECS-beschichtete Microcarrier Perlen
<ol><li>Begin 10T1/2 Zellen (Perizyten) mit der Zelle Ablösung Lösung (Trypsin) wie folgt lösen:<ol>
<li>Waschen Sie eine T175-Flasche mit 10 mL PBS, dann fügen Sie 5 mL Trypsin und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.</li>
		<li>10T1/2 in einer Konzentration von 2 X 105 Zellen/0,5 mL in komplette Medien aufzuwirbeln. Hinweis: Zellen wurden von der amerikanischen Art Kultur Sammlung (ATCC) erworben. Hinweis: 10T1/2 Zellkulturen im Minimum wesentliches Medium (MEM) ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Warten Sie nach 2,5 bis 3 h rühren die Perle + HUVECS Lösung 5 min um die Perlen und frei schwebenden HUVECS sich an der Unterseite des Rohres zu ermöglichen.</li>
	<li>Jedes Rohr mit einer Pipette P1000 0,5 mL der komplette Medien entnehmen und jedes FACs-Rohr 2 x 105 10T1/2 komplette Medien in ein Volumen von 0,5 mL hinzufügen. Die Zelle und Wulst Lösung schütteln und dann weiterhin bei 37 ° c inkubieren Weiter alle 20 Minuten rühren, bis die Perlen für eine Gesamtmenge von 4 h aufgeregt worden sind. Hinweis: Das Verhältnis von 5 HUVECS: 1 Pericyte auf den Perlen unbedingt geeignete Pericyte Abdeckung der Schiffe zu erhalten. Hinweis: Die folgenden alternativen Schritte können stattdessen an dieser Stelle im Protokoll verfolgt werden:</li>
	<li>Schütteln Sie Perlen und HUVECS nur für 4 h.</li>
	<li>Sobald die 4 h der HUVECS Beschichtung der Microcarrier Perlen abgeschlossen ist, rühren Sie die Rohre ein letztes Mal, warten Sie 30-60 s, dann umgehend entfernen Sie 1,5-1,75 mL der Lösung aus der FACS-Tube. Hinweis: Dies sollte genügend Zeit für den Großteil der Perlen zu begleichen, während viele freischwebende HUVECS in den Medien entfernt werden können.<ol>
<li>2 X 105 10T1/2 komplette Medien und bringen das Volumen der FACS Rohr bis zu 2 mL.</li>
		<li>Schütteln Sie sanft die FACS-Rohre alle 20 min eine weitere Stunde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach Abschluss der Rühren sanft agitieren Sie die Rohre ein letztes Mal sofort entfernen Sie die gesamte Lösung (2 mL) und eine 6-cm-Platte hinzufügen. Jede Platte eine zusätzliche 3 mL komplette Medien hinzu, und legen Sie die Platten in den Inkubator 37 ° C über Nacht.</li>
</ol>Tag3
4. Vorbereitung der Fibrin-Gel-Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie funktionierende Lösungen von Aprotinin in einer Konzentration von 1 mg/mL in PBS und Thrombin 50 Einheiten/ml. Hinweis: Ein großer Vorrat an jede dieser Lösungen kann gemacht und bei 4 ° C für mindestens ein Jahr gespeichert.</li>
	<li>Machen Sie eine frische Lösung von Fibrinogen, in einer Konzentration von 2 mg/mL. Machen Sie genug Lösung 2,5 mL Lösung pro aufgeregt FACS-Röhre haben.<ol>
<li>Wärmen Sie die Lösung im Wasserbad 37 ° C für 10 min damit alle Fibrinogen in Lösung gehen.</li>
		<li>Fügen Sie 37,5 µL Aprotinin Lösung pro 1 mL Fibrinogen-Lösung.</li>
		<li>Steril-Filter die Lösung und bei Zimmertemperatur beiseite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung Perlen Gel Implantation
<ol><li>Untersuchen Sie die Speisen mit Microcarrier beschichteten Perlen unter dem Mikroskop mit 20 X Objektiv um sicherzustellen, dass alle Perlen von Endothelzellen ausreichend beschichtet sind.</li>
	<li>Energisch pipette die vergoldete Lösung von Zellen zu trennen sie von der 6-cm-Platte, legen Sie die Lösung in ein Gefäß. Waschen Sie die Platte 2 X weitere Male mit komplette Medien und Transfer in das Rohr, alle restliche Perlen zu sammeln, die die Platte eingehalten werden kann.<ol>
<li>Vermeiden Sie Einführung von Luftblasen zu und mit einer Pipette p1000 um Schubspannung auf die endothelialen Zellen beschichtet Perlen zu minimieren.</li>
		<li>Wenn Bewertung SiRNA Knockdown Effizienz in den endothelialen Zellen, werden Sie in Schritt 2 erforderlich ist, achten Sie darauf, einen Teller mit nur HUVECS beschichtete Perlen haben. Dann während dieses Schrittes (5.2), lösen Sie die Perlen und sammeln Sie den Rest, die, den HUVECS auf den Teller für RNA Isolation und qPCR Analyse beigefügt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Warten Sie 3 min um die Perlen in die Lösung, sich an der Unterseite des Rohres zu ermöglichen.</li>
	<li>Entfernen Sie so viel des Überstands wie möglich ohne zu stören die Wulst Pellet mit einer Pipettenspitze p1000 (Vakuum-Sauger nicht verwenden).</li>
	<li>Jedes Rohr 1 mL der komplette Medien hinzufügen und erneut die Perlen.</li>
	<li>Warten Sie 30-60 s um die Perlen sich nach unten zu ermöglichen. Dann entfernen Sie so viel des Überstands wie möglich mit Hilfe einer Pipette P1000 ohne störende Wulst Pellet. Verwenden Sie ein Vakuum-Sauger nicht, da die Wahrscheinlichkeit, dass versehentlich entfernen die Wulst Pellet erheblich erhöht wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6 zwei weitere Male. Ziel ist es, so viel von den frei schwebenden HUVECS zu entfernen, die abgetrennt haben kann von der 6-cm-Platte wie möglich, beim Entfernen nicht zu viele HUVECS-beschichtete Perlen, die in der FACS-Röhre schneller als freischwebende Zellen begleichen sollte.</li>
	<li>Die Perlen 1 mL der komplette Medien hinzufügen.</li>
</ol>(6) einbetten Perlen in einem Fibrin-Gel beschichtet
<ol><li>Entfernen Sie so viele Medien wie möglich ohne zu stören die Wulst Pellet in jedem FACS-Röhrchen mit einer Pipette P1000.</li>
	<li>Die Perlen in 2,5 mL Fibrinogen Lösung aufzuwirbeln.</li>
	<li>Pipette 13 µL Thrombin-Lösung in jedem Wunsch auch von einer 24-Well-Platte Glasboden. Beschichtung in einem Glasbodenboot Teller unbedingt ermöglichen optimale Bildgebung der Sprossen. Hinweis: Lassen Sie nicht Thrombin sitzen in einem gut für mehr als 5 bis 10 min vor dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>0,5 mL Korn/Fibrinogen-Lösung in jede Vertiefung hinzugeben.<ol>
<li>Achten Sie darauf, die Perle Lösung gut vor dem Pipettieren der Lösung jedes Mal erneut.</li>
		<li>Vorsicht, sorgfältig pipette direkt in das Thrombin bereits in den Brunnen vorhanden. Langsam pipette rauf und runter 2-3mal mischen Sie die Lösung, wobei Vorsicht, keine Luftblasen einzuführen.</li>
		<li>Achten Sie darauf, die Pipettenspitze zwischen Brunnen zu ändern.</li>
		<li>Vorsicht nicht verschieben oder die Platte an jedem beliebigen Punkt während der anfänglichen Fibrin, die Blutgerinnung, stören, jede Bewegung die Gelbildung gestört werden kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Platte sitzt in der Haube für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Übertragen Sie sorgfältig die Platte in einem 37 ° C Inkubator für weitere 1,5-2 h, das Gel vollständig erstarren lassen</li>
</ol>7. Beschichtung Fibroblasten auf das Fibrin-Gel
<ol><li>Während der letzten 30 min Gel erstarren lösen Sie normale menschliche Lunge Fibroblasten (NHLF) wie folgt:<ol>
<li>Waschen eine T175-Flasche von Zellen mit 10 mL PBS, dann fügen Sie 5 mL der Zelle Ablösung Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 10 min.</li>
		<li>NHLF in einer Konzentration von 20.000 Zellen/mL in komplette Medien aufzuwirbeln. Hinweis: NHLF Zellen können werden kultiviert mit Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte 1 mL der NHLF Zellsuspension auf das Gel der jedes gut und setzen Sie wieder in den Inkubator.</li>
	<li>Komplette Medien täglich für die Dauer des Tests zu wechseln.</li>
</ol>8. beachten Sie sprießen im Laufe von 2-7 Tagen nach der Implantation der Wulst in das Fibrin-Gel. Die Länge der Zeitaufwand für die Keimung hängt von der Passage und viele Anzahl von HUVECS.
9. Befestigung von sprießen Assay
<ol><li>Sobald ausreichend sprießen aufgetreten ist, um einen phänotypischen Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen bestimmen zu können, waschen Sie alle Brunnen einmal mit 2 mL PBS.</li>
	<li>Jedes gut 0,5 mL der Zelle Ablösung Lösung hinzu und legen Sie die Platte in einem Inkubator 37 ° C für 5 Minuten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und tippen Sie auf den Seiten der Platte. Hinweis: Dieser Schritt soll möglichst viele der NHLF Zellen auf das Fibrin-Gel wie möglich Antikörper Eindringen in das Gel sowie Bildgebung des Gels zu erleichtern zu entfernen. Die gesamte Inkubationszeit mit Zelle Ablösung Lösung müssen möglicherweise angepasst werden, um NHLF Entfernung zu optimieren. Forscher sind gewarnt, nicht das Gel für übermäßig lange Zeit brüten, wie die Zelle Ablösung Lösung kann in das Gel dringen und beginnen, stören die endothelialen Strukturen innerhalb.</li>
	<li>Sobald eine ausreichende Menge an NHLF Zellen entfernt wurden, stillen Sie Zelle Ablösung Lösung mit 1 mL komplette Medien.</li>
	<li>Aspirieren Sie, freistehende NHLF und Medien mit einer Vakuum-Sauger, und waschen Sie der Brunnen einmal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Jedes gut 300 µL 2 % Paraformaldehyd Lösung mit PBS-Puffer hinzu und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die 2 % Paraformaldehyd Lösung und waschen Sie jeweils gut 3 Mal mit 1 mL PBS für 3 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Bitte entsorgen Sie 2 % Paraformaldehyd Lösung entsprechend im Einklang mit Umwelt und Gesundheit und Sicherheit (EHS) Richtlinien.<ol>
<li>Fügen Sie 1 mL PBS jeweils gut und bei 4 ° C bis zu färben oder die Sprossen-image speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Färbung der Assay sprießen
<ol><li>Fügen Sie 300 µL 0,5 % Triton X-100 mit PBS-Puffer für jeden gut und 30 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Mit Hilfe einer Vakuum-Sauger, Triton-X100 und waschen Sie 3 Mal für 5 min in PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Lösung für jedes Gel zu blockieren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Die Sperre Lösung setzt sich aus folgenden Komponenten: 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 5 % FBS, 0,1 % Tween-20 und 1 % Antiserum (verwenden der gleichen Spezies, von denen Ihr Sekundärantikörper abgeleitet sind) mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Blockierende Lösung aus jedem Bohrloch entfernen und Hinzufügen von 300 µL der Färbelösung mit Primärantikörper in jede Vertiefung. Hinweis: Die Färbelösung ist dasselbe wie die blockierende Lösung, aber ohne das Antiserum vorhanden. Die Autoren hatten Erfolg brüten mit Primärantikörpern bei Verdünnungen von 1: 200 bis 1: 400.</li>
	<li>Inkubieren Sie Primärantikörper in Färbelösung für 24 Stunden bei 4 ° c</li>
	<li>Aspirieren Sie Primärantikörper Lösung und waschen Sie 3 Mal in TBS mit 0,5 % Tween 20 min bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln zu. Nach der dritten Wäsche mit frischen Waschpuffer wieder zu ersetzen, und über Nacht bei 4 ° C lagern.</li>
	<li>Mit fluoreszierenden Sekundärantikörper verdünnt 1: 1000 in Färbelösung für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie Sekundärantikörper Färbelösung zu und waschen Sie 5 Mal für 20 min mit TBS mit 0,5 % Tween bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln.</li>
	<li>Nukleare Fleck in PBS verdünnen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Dieses Protokoll hatte großen Erfolg mit Hoechst verdünnt 1: 10000 mit PBS-Puffer. Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit, nukleare Färbelösung vor Bildgebung zu entfernen.</li>
	<li>Bild innerhalb weniger Tage der Vollendung, die Färbung um optimale Fluoreszenzsignal zu erfassen.</li>
</ol>11. sprießen Assay Quantifizierung
<ol><li>Nachdem die Sprossen abgebildet haben, ImageJ importieren Sie die Image-Dateien und verwenden Sie das Zählungswerkzeug um die Anzahl der Sprossen oder Linienfunktion, sprießen Längen zu messen. Hinweis: Sprossen sind definiert als endotheliale Vorsprünge mit einer Länge größer als oder gleich dem Durchmesser des Wulstes, aus denen sie sprießen. 11 Sprout Länge kann als der Abstand zwischen dem Punkt gemessen werden, bei dem die sprießen beginnt ragt aus der Perle an der Spitze der Sprosse. Durchschnittliche Länge pro Korn sprießen und durchschnittliche Anzahl der Sprossen pro Perle sind nützliche Metriken zu phänotypische Auswirkungen der Gen-silencing in sprießen Angiogenese zu beurteilen. Die durchschnittliche Anzahl der Perlen, enthält mindestens ein Sprößling pro behandelten Gruppe kann auch als Metrik verwendet werden, um zu beurteilen, die Robustheit der sprießen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis.">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders.">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li><li>Zhang, Z. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Charakterisierung der komplexen Phasen und Zellkulturmodells zellulären Interaktionen von sprießen Angiogenese durch die Aktivierung des Forschers, genetische und bildgebende Methoden eingehende mechanistische Untersuchungen zu beschäftigen. Bei der Durchführung des Tests muss effizient endotheliale Beschichtung der Perlen während der Wulst Agitation Schritte stattfindet. Armen endotheliale Beschichtung erfolgt offensichtlich, wenn die Perlen nicht angezeigt werden, haben ein...

Angiogenese ist wichtig, entsprechende Embryogenese und Wundheilung, und es spielt auch Schlüsselrollen bei zahlreichen Erkrankungen einschließlich Krebs Fortschreiten1 und koronare Krankheit. 2 , 3 ein besseres Verständnis der wie Angiogenese auftritt während der normalen Entwicklung, und wie es in pathologischen Situationen reaktiviert wird ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger, wirksame Therapeutika. Treu in-vitro- Modelle, die die wichtigsten Stationen und Zelltypen Angiogenesis in Vivo beteiligt rekapitulieren sind notwendig, um Forscher besser charakterisieren die molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu fahren und neue Entdeckungen machen lassen in Endothelzellen Verordnung.
Nakatsu und Hughes haben eine sprießende Wulst-Assay optimiert, die sie gezeigt haben, die vielen bekannten Phasen der Angiogenese sprießen erfährt. 4 , 5 die hier vorgestellte Methode soll bauen auf den Test von Nakatsu und Hughes durch die Einbeziehung von Perictyes in der Probe, so optimiert, dass die parakrine und Juxtracrine Rollen der Fototapete Zellen in Endothelzellen sprießen einbezogen werden können neuartige Angiogenese Studien. Dadurch werden Fototapete Zellen, die durch ihre Rolle definiert sind, wie Zellen, die pflegen Körperkontakt mit Endothelzellen durch ihre Einbettung in die vaskuläre Basalmembran schließen. 6 Perizyten und Endothelzellen betreiben komplexe Übersprechen über Signalwege einschließlich Kerbe Signaltechnik, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ und viele andere. 7 , 8 -Maus-Modellen einen Mangel an diese Signalwege zeigen schlechte Pericyte Abdeckung Gefäßsystem in Embryogenese, führt zu schlechten Gefäße Umgestaltung und dysfunktionalen Gefäßsystem zu entwickeln. 7 darüber hinaus ist die Rolle der Perizyten im pathologischen Angiogenese wichtig, aber oft unterschätzt. Ein einzigartiges Merkmal des Tumors Gefäßsystem ist beispielsweise, dass die Schiffe unreif, undichte und dysfunktionalen aufgrund schlechter Pericyte Abdeckung sind. 9 es wurde vorgeschlagen, dass das Vorhandensein oder Fehlen von Perizyten dramatisch wirkt sich auf den Phänotyp von Tumor-Blutgefäßen und ein wichtiger Vermittler der Reaktionen auf Anti-angiogenetische und Antitumor-Therapien ist. 9 so ist Schlüssel zu mehr vollständige Erfassung der wichtigen Mechanismen der endothelialen Verordnung einschließlich der Rolle der Perizyten in in-vitro- Tests.
Zwar gibt es viele in-vitro- und Ex-Vivo Tests beschäftigt, Angiogenese zu studieren, gibt es Mängel in jedem betrachten. Einige, wie endotheliale Proliferation und endotheliale Migration Assays werden übermäßig vereinfacht und konzentrieren sich auf eine endotheliale Funktion in einer isolierten Umgebung auf Gewebekultur Kunststoff. 10 andere Assays treten in eine weitere 3 dimensionale (3D) Einstellung, wie Matrigel Rohr Bildung Assay,10 aber diese Tests immer noch stark vereinfacht sind und konzentrieren sich mehr auf die Fähigkeit der Endothelzellen zu migrieren und bilden de Novo vaskuläre Strukturen, im Gegensatz zu sprießen aus bereits bestehenden Gefäßsystem. Darüber hinaus enthalten keines dieser Assays Wandbild Zelltypen. Es gibt ex Vivo Modelle wie die Ring-Aorta-Assay, die Perizyten im Host-Orgel zu integrieren, zu tun, aber genetische Manipulation dieser Modelle ist viel schwieriger, wegen der Notwendigkeit der Generierung von Knockout oder transgenen Mausmodellen von der Wege von Interesse. Das Korn sprießen Assay ist ideal, weil es Endothelzellen sprießen, Proliferation, Migration und sogar Anastomose und Lumen Bildung in einer 3D Matrix Modelle. 4 der Assay erlaubt treu mechanistischen Bewertung von den vielen verschiedenen Phasen des sprießen, wobei noch für direkte genetische Modifikation von Endothelzellen oder Perizyten in einer mehr kontrollierten Umgebung. Das Fibrin gerinnt, enthält die sprießenden Perlen leicht fixiert, gefärbt, und abgebildet in verschiedenen Stadien der Keimung; Diese Sprossen können auch in einer live imaging Echtzeit-Bildgebung von Keimen führen platziert werden. Die hier vorgestellte Methodik ist ideal für das Studium der grundlegenden Mechanismen der Angiogenese durch in Tiefe Phänotypisierung und gründliche Analyse der Wege bei der Angiogenese aktiviert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile Pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>HUVEC Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11095114</td>
			<td>10T1/2 Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965118</td>
			<td>NHLF Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-grade PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>For lifting HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15050065</td>
			<td>For lifting 10T 1/2 and NHLF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customs siRNAs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C2517A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10T 1/2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHLF</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytodex 3 microcarrier beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>t9549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>a3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture incubator and hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well glass bottom plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P24G1.513F</td>
			<td>Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Filtration Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

incorporating pericytes into an endothelial cell bead sprouting assay

Angiogenese ist das Wachstum neuer Gefäße aus bereits bestehenden Gefäßsystem und ist ein wichtiger Bestandteil von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Embryogenese und Entwicklung, Wundheilung, Tumorwachstum und Metastasierung, und Augen und Herz-Kreislauf-Krankheiten. Wirksam in-vitro- Modelle, die die Biologie der Angiogenese rekapitulieren sind erforderlich, entsprechend diesen Prozess zu studieren und Mechanismen der Regulierung, die letztlich ausgerichtet werden können für neue therapeutische Strategien zu identifizieren. Die Perle-Angiogenese-Assay, der mehrere Phasen der Endothelzellen sprießen rekapitulieren zuvor nachgewiesen in-vitro-. Eine Einschränkung des Assays besteht jedoch ein Mangel von Endothel-Funktion Wandbild Zell-Interaktionen, die Schlüssel für die molekulare und phänotypische Regulierung der Endothelzellen sind in Vivo. Das Protokoll hier stellt eine Methodik für die Einbeziehung der Fototapete Zellen in der Wulst-Angiogenese-Assay und zeigt eine enge Vereinigung von Endothelzellen und Perizyten während der Keimung in Vitro. Das Protokoll enthält auch eine Methode zur effektiven verstummen der Zielgene mit SiRNA in Endothelzellen für mechanistische Studien. Insgesamt bietet dieses Protokolls einen in-vitro- Test, der passender Modelle der verschiedenen Zelltypen sprießen Angiogenese beteiligt, und bietet eine physiologisch relevanten Plattform für therapeutische Beurteilung und neuartige Entdeckung Mechanismen der Angiogenese-Verordnung.

Dieses Protokoll ermöglicht eine enge Verbindung von zwei Zelle Arten in-vitro- und das Vorhandensein von den Perizyten ergänzt das Auftreten von Keimen (Abb. 1A, B). Das Protokoll ermöglicht auch effektiv zum Schweigen (z.B. über RNA-Interferenz) eines Gens von Interesse in einer Zelle Art von Interesse wie (VEGFA speziell in Endothelzellen) oder PDGFRβ in Perizyten7,<sup class="xref"...

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Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

incorporating-pericytes-into-an-endothelial-cell-bead-sprouting-assay

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.9K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.

Serie: Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.