Leon Tai Illinois Üniversitesi Chicago başlangıç ​​fonlarıyla finanse edilir.

Tüm deneyler Illinois Üniversitesi, Chicago Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi protokollerini takip etmektedir. 1. Genel Hazırlık NOT: Beyin mikrovasküler endotel hücresi hattı (hCMEC / D3), yoğun şekilde karakterize edilmiş, ölümsüzleştirilmiş insan BEC hattı 14 , 15 , 16 , 18 , 19&#39;dur . Bazal Endotel Büyümesi Bazal Ortamda, kolajen Tip I (buzağı derisi, Ca 2+ ve Mg 2+ içeren Hank&#39;in Dengeli Tuz Çözeltisinde (HBSS)% 0.1 çözeltinin 1:20 seyreltimi) ile kaplanmış doku kültürü şişeleri üzerinde hCMEC / D3 hücrelerini kültürleyin 500 mL medyaya göre% 2-5 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 10 askorbik asit,% 10 gentamisin sülfat,% 25 hidrokortizon ve sağlanan büyüme faktörü takviyelerinin toplam hacminin ¼&#39;ünü içeren bir antikor (EBM-2) Vasküler endotelyum gr(VEGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ve insan temel fibroblastik büyüme faktörü (bFGF), bakınız Malzeme Listesi]. NOT: EBM-2 orta FBS ve büyüme faktörleri olan &quot;EBM-2 komple&quot; olarak geçmektedir. FBS ve ek içermeyen EBM-2, &quot;EBM-2 bazal&quot; olarak anılır. Tam konfluans durumunda, hCMEC / D3 hücreleri ~ 1 x 105 hücre / cm2 &#39;dir. <ol><li> Önce 5 dakika süreyle 5 mL tripsin / EDTA (% 0.25) ile ayrıldıktan sonra Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın 3 dakika boyunca HBSS ile inkübe ederek hCMEC / D3 hücrelerini 1: 5 oranında geçirin. Tripsini EBM-2 komple (1: 1 nötralizasyon) kullanarak nötralize edin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de santrifüjleyin; Süpernatanı atın. Peleti EBM-2&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin ve 1: 5 oranında plakaya tekrar koyun. </li><li> Birincil insan perisitlerini ve astrositleri tedarikçinin protokolüne göre kültürleyin [ Malzeme Listesi ]. KültürE percyte bazal ortamda perisitler FBS ve perisit büyüme takviyesi ile. </li><li> Astrosit büyüme faktörleri içeren astrosit ortamında insan astrositlerini kültürleyin. Hücre yapışması için 3 mL poli-L-lisin (PLL) ile kaplı doku kültürü şişeleri içindeki perisitleri ve astrositler hem pasajlar 2 ve 5 arasındaki hücreleri kullanır. </li><li> 7 fare euthanize ve beyin sapları ve cerebella forseps ile çıkarın; Beynini dikkatlice gazlı bezle sallayarak çıkarın. Kalan beyin dokusunu, HEPES (beyin başına 5 mL) ile Minimal Esansiyel Ortamdaki (MEM) bir Petri kabında, steril traş bıçağı ile konsantre edin. Birinci fare BEC&#39;lerini, referans ağıdaki protokole göre 2 aylık C57BL / 6J farelerden ayırabilirsiniz 20 . </li><li> Kıyılmış beyin dokusunu 15 mL&#39;lik konik bir tüp içine aktarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve dokuyu bir papain (her beyinde 833.33 μL) ve DNaz (beyin başına 41.7 μL) içinde kuluçkaya yatırın.Çözelti, 37 ° C&#39;lik bir su banyosunda 1 saat boyunca dokuyu sindirmek için. </li><li> Homojenat sırayla 19 ve 21 gauge iğneleri ile triturate,% 22 Bovine Serum Albumin (BSA) çözeltisi ile 1: 1 oranında karıştırın ve 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1360 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Nihai pelleti 1 mL EBM-2&#39;de tekrar süspanse edin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 290 xg&#39;de santrifüjleyin. 1 mL EBM-2&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin ve kollajen ile kaplanmış 6 oyuklu plakalarda (oyuk başına 1 beyin) hücreleri (1 mL / çukur) yerleştirin. </li><li> Ortamı 24 saat sonra, 4 μg / mL puromisin hidroklorür içeren EBM-2 komple ile değiştirin; 2 gün sonra EBM-2 ile tamamlayın. Birincil BEC&#39;ler hCMEC / D3 hücreleri için olduğu gibi kültürlenirler ve 1 x 105 hücre / cm2&#39;de tam birleşmiş durumdadırlar. </li><li> Testten 24 saat önce 100 uM oAp hazırlayın. NOT: oAβ, A&#39;nın hastalıkla ilişkili formu olarak düşünülür. OAβ için Dahlgre tarafından tanımlanan iyi karakterize edilmiş preparatları kullanınN ve ark. 21 . </li><li> Bazal membran stok solüsyonu gece boyunca 4 ° C&#39;de çözülür ve tüp başına 140 uL taban zarında steril PCR tüp şeritlerine (8 tüp) alikuotu yıkayın. Her bir şeridi tekrar -80 ° C&#39;de muhafaza edin. Deneyden 24 saat önce 4 ° C&#39;de 96 oyuklu plaka başına bir şerit çözülür. Katılaşmayı önlemek için pipet uçlarını önceden soğutun. NOT: Hızlı katılaşmayı önlemek için temel zarı matrisinin tümü buzda olmalıdır. Testin yapıldığı gün bazal zarın her bir kuyucuğunda 10 mcL kullanıldığından, her şerit bir 96 oyuklu plak için yeterlidir. </li><li> Tam uyumlu BEC&#39;leri, deneyden 24 saat önce EBM-2 bazalinde kuluçkalayın. NOT: Gerekçe şöyledir: EBM-2 komple, optimal hücre büyümesini teşvik etmek amacıyla desteklenmiş faktörler ve FBS içerir; Bununla birlikte, hücre büyümesini teşvik eden aynı moleküler yollar, beyin endotel hücre kapsamı ve dinamikleri için gerek var ve gerekse de önemlidirBir stresörün. Dolayısıyla serum ve ek, hücresel sinyal yolaklarının artık aktifleşmesinin karıştırıcı etkisini azaltmak için BEC&#39;leri aç kaldık. Not, hücreler, deneyden önce tripsinize edilmiş hücrelerin nötrleştirilmesi sırasında kısa bir süre (5 dakika) FBS&#39;ye maruz bırakılır. BEC&#39;lerin aksine, perisitler ve astrositler, büyüme için farklı faktörlerin ve serum açlığın- dan yanıt olarak bu hücre tiplerinin göreceli olarak kararsızlığı nedeniyle, serum aç kalmamış değildir (Tai laboratuarı, yayınlanmamış gözlemler). NOT: EBM-2 bazal, tek ve üçlü kültür ağı oluşumu ve parçalama deneyleri için deneme sırasında kullanılır. Bu, stres faktörünü karıştıran veya tedavi bağımlı sinyal vermeyi önlemek açısından kritik önem taşır. </li></ol> 2. Mesh-benzeri Oluşum ve Parçalanma Testleri <ol><li> Tek BEC kültürü tahlilleri: NOT: BEC&#39;lerin tek kültürleri için üç farklı paradigma Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir </strong&gt;. Her paradigma, çeşitli gemi kapsama modellerinde BEC&#39;lerin tepkilerini değerlendirecek şekilde tasarlanmıştır. Paradigma 1 ağ oluşumudur. Bu paradigma, stresörlerin ve / veya tedavilerin anjiyogenez ve ağ oluşumu üzerindeki etkilerini incelemek üzere tasarlanmıştır. BEC&#39;ler, oAβ ve tedaviler plakaya 0 saat zaman noktasına eklenir. Paradigma 2, örgü parçalarının kesilmesini önlemektir. Hücreler, bir büyüme faktörü veya ilacın varlığında kaplanır ve ağ-yapı benzeri yapılar oluşturmak için 4 saat inkübe edilir. Bu durumda bir oAβ olan bir stres faktörü, 4 saat sonra eklenir. Bu paradigma, bir tedavinin, önceden oluşturulmuş ağ-yapıya benzer yapılara uygulanan stres kaynaklı hasarını önleme yeteneğini değerlendirir. Paradigma 3, ağ örgüsünün bozulmasının eş zamanlı olarak muamele edilmesidir. Hücreler kaplanır ve 4 saat ağ gözenekli yapılar oluşturmaya bırakılır. Ardından tedaviler ve oAβ, önceden oluşturulmuş hücre ağı ile çeşitli tedavilere cevap verme yeteneğini değerlendiren 4 saat zaman noktasında eşzamanlı olarak eklenir. Tüm paradigmalarTedavi ekleme zamanlamasındaki farklılıklar hariç, benzer genel adımları izleyin. <ol><li> Analizin yapıldığı gün, 96-çukurlukların tabanına 10 mcL / çukurdaki bazal membran matrisini pipetleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;ye ayarlanmasına izin verin. </li><li> 10 mM&#39;lik bir stok çözeltisi üretmek için 10 μL DMSO içinde liyofilize yeşil hücre izleme boya ( Malzeme Tablosuna bakın) askıya alın ve EBM-2 bazal 10 uM (1: 1000) için inceltin. Ortamı tamamen bir araya getiren şişeden çıkarın ve yeşil hücre izleme boya içeren EBM-2 bazalıyla değiştirin (75 cm 2 lik bir şişe için 5 mL). Deneyin başlangıcından 20 dakika önce BEC&#39;leri yeşil hücre izleme renklendiricisiyle önceden yükleyin. </li><li> Hücreleri, 37 ° C&#39;de 20-30 dakika inkübe edin, hücre izleme boya maddesi ile ortamı alın ve Adım 1.1&#39;de açıklandığı gibi hücreleri ayırın. Ortamı% 10 FBS içeren EBM-2 ile nötralize edin ve 4 ° C&#39;de 5 dakika, 240 xg&#39;de santrifüjleyin. Pellet 1 mL EBM-2 bazal süspansiyon haline getirilir. </li><li> BEC&#39;leri 96 oyuklu plakada EBM-2 bazalında (tüm paradigmalarda 0 saat zaman noktası) 10,000 hücre / oyukla kaplayın. NOT: Kullanılan paradigmaya bağlı olarak, belirtilen zaman noktalarında tedaviler, stresörler veya araç kontrolleri eklenir. Tüm paradigmalarda, ortam sonraki analizler ( örn., ELISA analizi) için hasat edilir ve hücreler, fosfat tamponlu serumda (PBS) yeni hazırlanmış% 4 paraformaldehitle 24 saat sabitlenir. OAβ&#39;nın meş oluşumu üzerindeki etkilerini belirlemek için alternatif bir yaklaşım olarak, protokol OAp ile konfluent hücre kültürü şişelerini ön inkübe etmek için modifiye edilebilir ve daha sonra ağ örgüsü oluşum paradigmalarını (+/- oAβ) gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. NOT: Bütün paradigmalar için her kuyunun son hacmi 70 mcL&#39;dir. Tüm tedaviler (oAβ, EGF, vb. ) Ilgili oyuklara 1:20 seyreltme, yani her muamele başına 3.5 mcL ilave edilir. Paradigma 1 için, hücreler 63 μL / w&#39;de bir hücre süspansiyonu çözeltisine eklenirell. Hemen oAp, arzu edilen tedaviler ve kontroller toplam 3.5 mcL / oyuk eklenerek toplam 70 mcL verilir. Paradigma 2 için, 0 saat zaman noktasında 63 μL hücre süspansiyonu ve 3.5 μL tedavi ( örn., 100 ng / mL EGF) eklenir. 4 saat inkübasyondan sonra 3.5 μL bir oAβ stoğu eklenir ( örn. , 100 nM son oAp konsantrasyonu, 3.5 uL 2 uM oAβ stoğu için). Paradigma 3 için 63 μL hücre süspansiyonu, 0 saat zaman noktasında eklenir ve 4 saat sonra, oAp ve istenen tedaviler, her biri 3.5 mcL / çukurda eklenir ve toplam 70 mcL verilir. Bu ciltler tedavilere göre ayarlanabilir. Örneğin, tek bir tedavi gerekiyorsa, hücre süspansiyonu hacmi 66.5 uL&#39;ye ayarlanıp (10,000 hücre / kuyuyu muhafaza eder) tedavi hacmi 3.5 uL&#39;de kalabilir. </li></ol></li><li> Üçlü kültür tahlili: NOT: BEC&#39;lerin tek kültür deneylerine ek olarak,Önceden oluşturulmuş şebekelerdeki BEC&#39;lerin, perisitlerin ve astrositlerin ilgili stresörlere ( örn., OAβ) yanıtını belirlemek için üçlü bir kültür analizi paradigması hazırladılar ( Şekil 1B ). BEC&#39;ler istenen tedavilerin varlığında 0 saat boyunca kaplanır. 4 saat sonra, perisitler nazikçe plakaya eklenir. 7 saat sonra, astrositler plakaya ilave edilir ve onu takiben 11 saate bir stres verici katılır. Hücreler daha sonra 24 saat zaman noktasına kadar inkübe edilir. NOT: Üçlü kültür deneyleri için, tüm hücrelerin aynı anda birleşeceğinden emin olmak için zamanlamanın değerlendirilmesi önemlidir. İnsanlardaki astrositler ve perisitler deneyden 1 hafta önce kültüre alınırken, hCMEC / D3 hücrelerinin deney tarihinden 4-5 gün önce plakalanması veya pasajlanması gerekir. Ayrıca, fenotipik sürüklenmeyi önlemek için düşük geçit (2-5) primer hücrelerin kullanılması önemlidir. <ol><li> Deney başlamadan 20 dakika önce hCMEC / D3 hücrelerine yeşil hücre izleme solüsyonu çözeltisi ekleyin. HCMEC / D3 hücrelerini 10, 000 hücre / çukur EBM-2 bazal (0 saat zaman noktası). Kullanılan hacimler 45 μL hücre süspansiyonu ve 3.5 μL muamele ( yani 20 kat daha yoğun olan stoklardan 50 ng / mL, 100 ng / mL veya 1000 ng / mL son EGF konsantrasyonları) şeklindedir. </li><li> 37 ° C&#39;de 3.5 saat inkübasyondan sonra insan primer perisitlerine mavi hücre izleme boya çalışma solüsyonunu (EBM-2 bazalda 10 uM hücre izci mavisi) ekleyin. 4 saatlik zaman noktasında (hücre izleme boya ile 30 dakika inkübasyon), hCMEC / D3&#39;ü içeren plakaya 6 mcL / çukur hacminde nazikçe 2.000 perissit / kuyu ekleyin. </li><li> İnsan primer astrositlerine ek 2.5 saat inkübasyon (0 saat zaman noktasından toplam 6.5 saat) takiben turuncu hücre izleme boya çalışma solüsyonunu (EBM-2 bazalda 10 uM hücre izci turuncu) ekleyin. 7 saatlik zaman noktasında, 12 mcL hacimdeki plakaya hafifçe 10.000 astrosit / kuyu ekleyin. Bu nedenle, endotel hücreleri için genel hücre oranı: perişitler: astrositler iS 5: 1: 5. Dahası, bu noktaya ulaşan hacim 66.5 uL&#39;dir. </li><li> 4 saat sonra oAβ (3.5 uL, 100 uM stok) ekleyin (0 saat zaman noktasından toplam 11 saat). </li><li> Hücreleri 13 saat sonra taze hazırlanmış% 4 paraformaldehid PBS içinde sabitleyin. Dikkat: paraformaldehidi tutarken koruyucu giysi, eldiven ve gözlük takın. </li></ol></li></ol> 3. Nicelleştirme <ol><li> Bir diseksiyon mikroskopu kullanarak% 50 maksimum güçle 2 saniyelik pozlama süresiyle 1.6 kat büyütmede 96 oyuklu plakanın tüm kuyusunun floresans görüntülerini yakalayın. NOT: Eşdeğer mikroskoplar kullanılabilir; Ancak, kapsamlı analiz için bütün kuyuyu yakalamak kritik önem taşır. </li><li> Kantitatif analiz için, şube sayısını, kafeslerin sayısını ve toplam hücre uzunluğunu ölçmek için ImageJ anjiyojenez analizörü eklentisi 22&#39;yi kullanarak görüntüleri işleyin (bu okumalar otomatik olarak softwa ile tablolaştırılırYeniden) aşağıda tarif edildiği gibi. Bu adımın ayrıntılı bir görsel protokolü Şekil 2&#39;de verilmektedir . <ol><li> Fiji ImageJ&#39;yi yazılım simgesini tıklayarak açın. </li><li> Araç çubuğunun ucundaki çift kırmızı öne oklara tıklayın, ardından &quot;Anjiyogenez Analiz Cihazı&quot; na tıklayın. </li><li> Resim dosyalarıyla klasörü seçin, &quot;Aç&quot; ı tıklayın. </li><li> &quot;Analiz için ayarlar&quot; kutusu göründüğünde, &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> İşlenecek görüntü sayısını belirten &quot;görüntüleri işleme&quot; kutusu göründüğünde, &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Tahmini işleme süresini gösteren &quot;toplu ilerleme penceresi&quot; kutusu göründüğünde. Bu süre zarfında program, dal sayısı, kafes sayısı ve toplam hücre uzunluğu gibi çıktıları nicelleştirir. NOT: Tüm görüntüler niceleyildikten sonra, sonuçlar dosyası orijinal resim klasöründe e-tablo belgesi olarak görünür. </li><li> seçmekSonuçları içeren elektronik tablo dosyası ve gruplar arasındaki dal sayısı, kafesler ve toplam hücre uzunluğu karşılaştırılır. NOT: Üçlü kültür deneyinde ImageJ, perisit / astrosit kapsamını ve sayısını analiz etmek için ayrıca kullanılmaktadır. Görüntüler körü kör bir deneyci tarafından sınırlanmış ve okunmaları oluşturmak için &quot;parçacıkları analiz&quot; işlevi kullanılmıştır. Sabit hücreler ve tüp benzeri yapılar ayrıca Aβ 17 veya diğer markerler için immüno-lekelendi. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery.">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).</li><li>Engelhardt, B., Liebner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+development+and+maintenance+of+the+blood-brain+barrier.">Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Pardridge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+protein+and+gene+medicines+through+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier.</a> Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer's+disease.">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-beta+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+amyloid+angiogenic+activity+in+vitro+and+in+vivo.">Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo.</a> Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).</li><li>Paris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+angiogenesis+in+a+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).</li><li>Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+beds+are+decreased+in+Alzheimer's+disease,+but+not+in+Binswanger's+disease.">Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease.</a> Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).</li><li>Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vascular+Perturbations+in+an+Abeta-Injected+Animal+Model+and+in+AD+Brain.">Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain.</a> Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).</li><li>Donnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+peptides+accelerate+the+senescence+of+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo,+impairing+angiogenesis.">Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis.</a> FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).</li><li>Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+occludin+down-regulation+and+increased+permeability+in+human+brain+endothelial+cells+is+mediated+by+MAPK+activation.">Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).</li><li>Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+and+breast+cancer+resistance+protein+restrict+apical-to-basolateral+permeability+of+human+brain+endothelium+to+amyloid-beta.">P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+P-glycoprotein+expression+by+the+immortalised+human+brain+endothelial+cell+line,+hCMEC/D3,+restricts+apical-to-basolateral+permeability+to+rhodamine+123.">Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123.</a> Brain Res. 1292, 14-24 (2009).</li><li>Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+oligomeric+amyloid-beta+induced+angiogenesis+deficits+in+vitro.">Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+brain+endothelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).</li><li>Dahlgren, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+and+fibrillar+species+of+amyloid-beta+peptides+differentially+affect+neuronal+viability.">Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability.</a> J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+Analyzer.">Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li><li>Thomas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+APOE4+and+amyloid-beta-induced+cognitive+and+cerebrovascular+deficits+in+female+mice.">Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroangiogenesis:+a+vascular+basis+for+Alzheimer's+disease+and+cognitive+decline+during+aging.">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tarif edilen yöntemler, serebrovasküler kapsama alanı ile ilgili çeşitli temel biyolojik soruları çözmek için kullanılabilir 24 . Spesifik olarak hangi reseptörlerin ve sinyal yollarının anjiyogenez, kanser dokusunda gemi kapsama alanı ve beynin ilgili olduğu periferik endotel hücrelerinde rol oynadığını tespit edebilirler. Örnekler, anjiyojenik büyüme faktörü reseptörleri, nitrik oksit, mitojen aktive protein kinaz sinyali ve kalsiyum sinyali 25 ...

<html> Serebral kılcal damarların kan-beyin bariyeri (BBB), kan-beyin temasının en büyük arayüzüdür ve merkezi sinir sistemi (SSS) 1 , 2&#39;nin homeostazında merkezi bir rol oynar. BBB&#39;deki dinamik işlemler, istenmeyen moleküllerin kandan alınmasını önler, atık ürünleri MSS&#39;den uzaklaştırır, gerekli besin maddelerini ve CNS&#39;ye sinyal moleküllerini gönderir ve nöroinflamasyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5 modüle eder. Yaşlanma sırasında BBB hasarı ve Alzheimer hastalığı (AD), multipl skleroz ve inme 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ve 6&#39;yı içeren çeşitli nörodejeneratif bozukluklar görülür.Ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu terapötik bir hedef de dahil nörodejeneratif bozukluklarda önemli bir rol oynayabilir. Gemi kapsama alanının korunması BBB&#39;nin homeostatik işlevleri için önemlidir. Bununla birlikte, in vivo ve in vitro veriler, nörodejeneratif bozukluklardaki süreçlerin özellikle AD&#39;de 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 yüksek veya düşük BBB kapsama alanına sahip olup olmadığı konusunda çatışma oluşturmaktadır. Bu nedenle, BBB kapsama alanının dinamiklerini daha kapsamlı olarak anlamak ve değerlendirmek için ilgili hücre tiplerini kullanan in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir gerekçe vardır. Beyin kılcal damarları, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücrelerinden (BEC&#39;ler) oluşur. <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Tüm hücre tipleri yapısal destek vasıtasıyla ve parakrin ve otokrin benzeri modda hareket eden anjiyojenik büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinler gibi efektör moleküllerin salgılanması yoluyla BBB&#39;nin işlevine katkıda bulunur. Bununla birlikte, BBB&#39;nin efektör hücreleri BEC&#39;lerdir3. Genel olarak, BBB fonksiyonunu değerlendirmek için hücre kültürü teknikleri, hem stresörlerin 14 , 15 , 16 eklenmesinden sonra, filtre ekleri üzerinde büyütülen hücreler üzerinde gerçekleştirilen geçirgenlik testleri veya anahtar BEC proteinlerinin seviyelerini değerlendirmektir. Önemli olmasına rağmen, bu testler serebrovasküler kapsama odaklanmaz. Burada önceki yöntemlerimiz, ölümsüzleştirilen insan BEC&#39;lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC&#39;lerin tek kültürleri ve bir hümanize üçlü kültür kullanılarak BEC kapsamı ve ağ-yapı benzeri yapıları değerlendirmek için ayrıntılı olarak verilmektedirModel (BEC&#39;ler, astrositler ve perisitler). Amaç, AD progresyonuna önemli katkıda bulunan oAβ&#39;nın zararlı etkisini BEC kapsamı üzerine göstermekti. Epidermal büyüme faktörünün (EGF) koruyucu etkisi, tekniğin terapötik bir tarama aracı olarak potansiyelini vurgular. Teknik, temel ve uygulamalı araştırmalar için çeşitli geniş uygulamalara sahiptir: 1) anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki spesifik yolların rolünün belirlenmesi, 2) hastalık ve yaşlanmayla ilişkili faktörlerin anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki etkilerinin değerlendirilmesi ve 3) farmakolojik hedefler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">hCMEC/D3 cells</td>
			<td style="width:183px;">Milipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC066</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">EBM-2 basal media&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Collagen Type 1</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A1064401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5% FBS</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Ascorbic acid</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Gentamycin sulphate</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25% Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="78">
			<td height="78" style="height:78px;width:379px;">1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin hydrochloride</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">80503-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">MEM-HEPES&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12360-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td>
			<td style="width:183px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Human pericytes</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Pericyte basal media</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Pericyte growth supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Human Astrocytes</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Astrocyte media</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Astrocyte growth supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>1852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Angiogenesis m-plates (96-well)</td>
			<td style="width:183px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">89646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Human Epidermal growth factor&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Shenendoah Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker green&#160;</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker orange</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td>C34551</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTracker blue&#160;</td>
			<td style="width:183px;">ThermoFisher</td>
			<td>C2110</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Poly-l-lysine</td>
			<td style="width:183px;">Sciencell</td>
			<td>0403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT5012-60ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">C57BL mice</td>
			<td style="width:183px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">PCR tube strips</td>
			<td style="width:183px;">GeneMate</td>
			<td style="width:119px;">T-3014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

Kan-beyin bariyeri (BBB) ​​kapsama merkezi sinir sisteminin (CNS) homeostazında merkezi bir rol oynamaktadır. BBB, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücreleri (BEC&#39;ler) tarafından dinamik olarak muhafaza edilir. Burada, ölümsüzleştirilmiş insan BEC&#39;lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC&#39;lerin tek kültürleri ve BBB&#39;nin bir hümanize üçlü kültür modeli (BEC&#39;ler, astrositler ve perisitler) kullanarak BBB kapsama alanını değerlendirecek yöntemleri ayrıntılı olarak inceliyoruz. Tahlillerin hastalık durumlarına uygulanabilirliğini vurgulamak için, Alzheimer hastalığının (AD) ilerlemesine önemli katkıda bulunan oligomerik amiloid-β&#39;nın (oAβ) BBB kapsamı üzerindeki etkisini tanımlıyoruz. Ayrıca, tekniklerdeki ilaç tarama potansiyelini aydınlatmak için epidermal büyüme faktörünü (EGF) kullanıyoruz. Sonuçlarımız, tek ve üçlü kültürlenmiş BEC&#39;lerin temel koşullar altında ağ gibi yapılar oluşturduğunu ve oAβ&#39;nın bu hücre ağ oluşumunu bozar ve önceden oluşturulmuş örgü yapılarını dejenere ettiğini,Ancak EGF bu aksama engeller. Bundan dolayı, tarif edilen teknikler, BBB kapsama alanını modüle eden temel ve hastalığa bağlı süreçleri ayırmada önemlidir.

Tek kültürlerde hem hCMEC / D3 hücreleri ( Şekil 3A ) hem de birincil fare BEC&#39;ler ( Şekil 3B ), kuyu boyunca ağ örgüsü benzeri yapılar oluşturmaktadır. Yapılar, birbirine bağlı düğümlerin ağ tarafından karakterize edilmiştir ( Şekil 3 ). Açıklanan tüm paradigmalarda ( Şekil 1 ), ağ örgüsü benzeri yapılar kontrol gruplarında 24 saat s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago.  Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. 

Video: In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Sıçan Modelinde Transkraniyal Odaklanmış Ultrason kullanarak Kan-beyin bariyeri MRG eşliğinde bozulması

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Tıp

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Ambliyopi içinde Bastırma Ölçme ve Tedavisi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

An<em&gt; In vivo</emKan Gemi Geçirgenlik Test&gt; Test

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Kalıcı Serebral Gemi Tıkanıklığı<em&gt; Ile</em&gt; Çift Ligature ve transeksiyonu

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

İnsan vücudunun fizyolojisini bütünleştiren 4 damarlı Örnekleme Yaklaşımı<emIn vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...