Bu araştırma, Bilim ve BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Gıda Araştırma Enstitüsü'nün (KFRI) Ana Araştırma Programı (E0210702-03) tarafından desteklenmiştir.

1. Bakteri aşısının hazırlanması
<ol><li>-80 °C'de saklanan gliserol stok şişesini çıkarın.</li>
	<li>Steril bir pipet ucu kullanarak bakteri suşunu (2-10 μL) flakondan çıkarın. NOT: Bu protokolde Acinetobacter suşları, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ve A. ursingii (24-1) kullanılmaktadır.</li>
	<li>Piyasada bulunan bir kanlı agar plakasını (% 5 koyun kanı ile desteklenmiş triptik soya agarı, Malzeme Tablosuna bakınız) bakterilerle aşılayın. NOT: Besleyici agar veya MacConkey agar gibi diğer ortamlar da kullanılabilir.</li>
	<li>Agar yüzeyini inceltmek için aralıklı alevli steril bir halka kullanarak çizin.</li>
	<li>Agar plakasını bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de 20-24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Steril bir iğne ile bakteri kültürünün tek bir kolonisini seçin ve kültürle birlikte 5 mL steril beyin kalp infüzyon suyunu (BHI, Malzeme Tablosuna bakınız) aşılayın.</li>
	<li>Aşılanmış suyu 30 °C'de çalkalayan bir inkübatörde gece boyunca 20-24 saat yaklaşık 150 rpm'de inkübe edin.</li>
	<li>Gece kültürünün 1 mL'sini steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve gece kültürünü oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Bir girdap kullanarak, peleti 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>RT'de 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Pelet, 600 nm'de yaklaşık 0.1'lik bir optik yoğunluğa kadar vorteks kullanarak steril on kat seyreltilmiş BHI'de yeniden süspanse edin. NOT: Yaklaşık 0.1'lik optik yoğunluk yaklaşık 107 CFU/mL'ye eşdeğerdir.</li>
</ol>2. Kristal viyole kullanarak biyofilm ölçümü
<ol><li>Steril polistiren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL inokulum ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve iç kuyucukların kurumasını önlemek için en dıştaki kuyucukların her birine 200 μL deiyonize su ekleyin15.</li>
	<li>Negatif kontrol olarak aynı plakanın her bir oyuğuna 200 μL on kat seyreltilmiş BHI ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın. NOT: Çok kanallı pipet genellikle birden fazla numune için daha uygundur.</li>
	<li>Her bir oyuğa dikkatlice 300 μL PBS ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. NOT: Çok kanallı pipet genellikle birden fazla numune için daha uygundur.</li>
	<li>Adım 2.5'i iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Her bir oyuğa 200 μL kristal viyole çözeltisi (% 1) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2.4-2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Her oyuğa 200 μL mutlak etanol ekleyin ve RT'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Her kuyucuktan 100 μL elüsyon yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 595 nm'de ölçün (bkz.</li>
	<li>Absorbans 2.0'ı aştığında, numunenin mutlak etanolde absorbansın 2.0'ın altına kadar uygun bir şekilde seyreltilmesini sağlayın ve adım 2.11'deki gibi ölçün. Ardından, gözlemlenen değeri seyreltme faktörü ile çarparak numunenin absorbansını (nihai değer) hesaplayın.</li>
	<li>Negatif kontrolün ortalama değerini, aynı kuyu plakasındaki test numunelerinin her bir oyuğunun değerinden çıkararak numunelerin gerçek absorbansını hesaplayın.</li>
</ol>3. Biyofilm canlılık sayımı
<ol><li>Steril polistiren 12 oyuklu plakanın15 her bir oyuğuna 1 mL inokulum (adım 1) ekleyin. Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Her bir oyuğa dikkatlice 1.5 mL steril PBS ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. Her kuyucuğa 1 mL steril PBS ekleyin.</li>
	<li>Takılı hücre sıyırıcıları kullanarak kuyunun alt ve duvar yüzeylerini kazıyın.</li>
	<li>Hasat edilen hücre süspansiyonunu 9 mL salin (%0.85 NaCl) ve 10-20 cam boncuk içeren steril bir plastik tüpe (10-1) aktarın (bkz. NOT: Kuyunun alt yüzeyinde kalan artık biyofilm kalıntılarını toplamak için, 10-1 tüpünden salin kullanılarak pipetle yeniden süspanse edilebilir ve aktarılabilir.</li>
	<li>10-1 tüpü maksimum hızda 60 saniye boyunca vorteksleyin.</li>
	<li>10-7'ye kadar 9 mL salin (% 0.85 NaCl) içeren bir sonraki steril tüpe (10-2) 1 mL aktararak 10 kat seri seyreltme yapın.</li>
	<li>Acinetobacter agar üzerine her seyreltmeden 100 μL yayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve agar plakalarını 30 °C'de 24-42 saat inkübe edin.</li>
	<li>Her plakadaki tipik kırmızı kolonilerin sayısını 10 ile 250 arasında manuel olarak sayın.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak her bir kuyucuğun biyofilmindeki canlı hücre sayısını hesaplayın: Canlı hücreler = Koloni sayısı × Seyreltme faktörleri × 10</li>
</ol>4. Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanılarak biyofilm görselleştirme
<ol><li>Mikroskobik analiz için amaçlanan steril 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL inokülum ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 25 °C'de 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa dikkatlice 300 μL filtre ile sterilize edilmiş deiyonize su ekleyin ve süpernatanı bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Adım 4.4'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Filtreyle sterilize edilmiş deiyonize suda sırasıyla 10 μM ve 60 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş SYTO 9 ve propidyum iyodür karışımını ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın.</li>
	<li>Karışımı her bir oyuğa 200 μL'de ekleyin ve plakayı karanlıkta RT'de 20-30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>4.3-4.4 arasındaki adımları tekrarlayın</li>
	<li>Sırasıyla 488 nm ve 561 nm uyarma dalga boyuna ve 499-535 nm ve 568-712 nm emisyon dalga boyu aralığına sahip CLSM kullanarak alt yüzeye bağlı biyofilmleri görselleştirin.</li>
</ol>

Acinetobacter Biyofilm Oluşumunun Değerlendirilmesi ve Biyofilmlerin Karakterizasyonu

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter:+an+old+friend,+but+a+new+enemy.">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li><li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens:+Norovirus,+Clostridium+difficile,+and+Acinetobacter+species.">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix:+multitasking+in+a+shared+space.">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment.">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).</li><li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157:H7.">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li><li>McConnell, M. J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Açıklanan protokol kullanılarak, değişen derecelerde Acinetobacter izolatlarının biyofilm oluşumu ölçüldü, görselleştirildi ve biyofilmlerdeki canlı hücreler tahmin edildi (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3).
Bu protokolde Acinetobacter'in büyümesi için 30 °C ve biyofilm oluşumu için 25 °C olmak üzere iki farklı sıcaklık kullanılmıştır. 30 °C kullanıldı, ç...

Acinetobacter'in hastane enfeksiyonlarına neden olduğu bilinmektedir ve özellikle sağlık tesislerinde insan enfeksiyonu giderek daha fazla bildirilmektedir1. Hastanelerde, sağlık tesislerinde ve gıda ile ilişkili ortamlarda yaygındır 2,3,4. Yatak korkulukları, komodinler, vantilatörlerin yüzeyleri ve lavabolar gibi hastane yüzeyleri dahil ortamlarda uzun süre hayatta kalabilir4. Çevresel yüzeylerde bu tür bir kalıcılık, Acinetobacter4'ün hastane enfeksiyonlarına katkıda bulunan önemli faktörlerden biri olabilir.
Biyofilm, mikrobiyal yaşamın bir şeklidir ve canlı mikrobiyal hücrelerden ve hücrelerden hücre dışı polimerik maddelerden (EPS) oluşan mikrobiyal bir matristir5. Mikrobiyal hücreler matrise gömülüdür ve genellikle ısı, tuzlar, kuruluk, antibiyotikler, dezenfektanlar ve kesme kuvvetlerigibi çevresel streslere karşı oldukça dirençlidir 6,7.
Acinetobacter yüzeylerde biyofilmler oluşturabilir, bu da hastane yüzeyleri de dahil olmak üzere çevresel yüzeylerde uzun süreli sağkalıma ve antibiyotik tedavisinekarşı direncin artmasına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir 8,9. Ek olarak, Acinetobacter'in biyofilm oluşumu, insan klinik sonuçlarıyla yüksek oranda ilişkili olabilir8. Bu nedenle, Acinetobacter suşlarının biyofilm şekillendirilebilirliği, çevresel sağkalımı ve insan enfeksiyonlarını tahmin etmede göstergelerden biri olabilir 8,10.
Yüzeye bağlı biyofilmler, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için ölçülebilir ve görselleştirilebilir. Yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek için, biyofilmler normalde kristal viyole gibi biyofilm boyama boyaları ile boyanır ve boyalar çözelti içinde ayrıştırılır ve optik yoğunluk11 için ölçülür. Biyofilmlerin görselleştirilmesi, biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirmek için başka bir iyi yaklaşımdır11. Floresan boyalar kullanılarak özgüllüğü kullanan konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) görselleştirme yöntemi, SEM12,13 gibi diğer tekniklere kıyasla biyofilm morfolojisini karakterize etmek için daha yararlı olabilir.
Biyofilmlerdeki canlı hücreler, biyofilmlerdeki canlı hücrelerin sayısını tahmin etmek için sayılabilir11. Biyofilmlere gömülü canlı hücreler ayrılır, seyreltilir, agar plakalarına yayılır, inkübe edilir ve numaralandırılır. Daha fazla sayıda hücrenin enfeksiyöz dozu karşılaması muhtemel olduğundan, hücre sayısı13,14 ile ilişkili enfeksiyon potansiyelleri gibi biyofilmler hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlayabilir.
Bu makale, (1) yüzeye bağlı biyofilmleri ölçmek, (2) biyofilmlerdeki canlı hücreleri saymak ve (3) Acinetobacter'in CLSM'sini kullanarak biyofilmleri görselleştirmek için adım adım protokoller sunmaktadır. Sunulan protokoller, Acinetobacter izolatlarının biyofilm şekillendirilebilirliğini değerlendirme ve biyofilmlerini karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

Acinetobacter hastane enfeksiyonlarına neden olur ve biyofilm oluşumu hastane ortamları gibi kuru yüzeylerde sağkalıma katkıda bulunabilir. Bu nedenle, biyofilm ölçümü ve görselleştirme, Acinetobacter suşlarının hastane enfeksiyonlarına neden olma potansiyelini değerlendirmek için önemli yöntemlerdir. Mikroplakanın yüzeyinde oluşan biyofilmler, hacim ve hücre sayıları açısından ölçülebilir. Biyofilm hacimleri, kristal viyole kullanılarak boyanarak, yıkanarak, etanol kullanılarak leke çıkarılarak ve ardından bir mikroplaka okuyucu kullanılarak çözündürülmüş boyanın ölçülmesiyle ölçülebilir. Biyofilmlere gömülü hücrelerin sayısını ölçmek için, biyofilmler hücre sıyırıcılar kullanılarak sıyrılır, tuzlu suda hasat edilir, cam boncukların varlığında kuvvetlice çalkalanır ve Acinetobacter agar üzerine yayılır. Daha sonra plakalar 30 °C'de 24-42 saat inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, biyofilmlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için kırmızı koloniler numaralandırılır. Bu uygulanabilir sayım yöntemi, karışık tür biyofilmlerdeki Acinetobacter hücrelerini saymak için de yararlı olabilir. Acinetobacter biyofilmleri, floresan boyalar kullanılarak görselleştirilebilir. Biyofilm oluşturmak için mikroskobik analiz için tasarlanmış ticari olarak temin edilebilen bir mikroplaka kullanılır. Daha sonra, alt yüzeye yapıştırılan biyofilmler SYTO9 ve propidyum iyodür boyaları ile boyanır, yıkanır ve daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu ile görselleştirilir.

Acinetobacter is known to cause nosocomial infections, and its human infection, especially in healthcare facilities, is increasingly reported1. It is widespread in hospitals, healthcare facilities, and food-associated environments2,3,4. It can survive for a long period in environments including hospital surfaces such as bed rails, bedside tables, the surface of ventilators, and sinks4. Such persistence on environmental surfaces may be one of the significant factors contributing to the nosocomial infections of Acinetobacter4.
Biofilm is a form of microbial life and is a microbial matrix composed of live microbial cells and extracellular polymeric substances (EPS) from the cells5. The microbial cells are embedded in the matrix and are often highly resistant to environmental stresses such as heat, salts, dryness, antibiotics, disinfectants, and shear forces6,7.
Acinetobacter can form biofilms on surfaces, suggesting that it may contribute to extended survival on environmental surfaces, including hospital surfaces, and enhanced resistance to antibiotic treatment8,9. In addition, the biofilm formation of Acinetobacter could be highly associated with human clinical outcomes8. Therefore, the biofilm formability of Acinetobacter strains could be one of the indicators in predicting environmental survival and human infections8,10.
The surface-attached biofilms can be quantified and visualized to assess biofilm formability. To quantify surface-attached biofilms, the biofilms are normally stained by biofilm-staining dyes such as crystal violet, and the dyes are eluted in solution and measured for optical density11. Visualization of biofilms is another good approach to assess biofilm formability11. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) visualization method employing specificity using fluorescent dyes could be more useful to characterize biofilm morphology compared to other techniques such as SEM12,13.
The viable cells in biofilms can be counted to estimate the number of viable cells in biofilms11. The viable cells embedded in biofilms are detached, diluted, spread on agar plates, incubated, and enumerated. Because the higher number of cells is likely to meet the infectious dose, it can provide more detailed information on biofilms, such as infection potentials associated with the number of cells13,14.
This article presents step-by-step protocols to (1) quantify surface-attached biofilms, (2) count viable cells in the biofilms, and (3) visualize the biofilms using CLSM of Acinetobacter. The presented protocols describe the methods to assess the biofilm formability of Acinetobacter isolates and characterize their biofilms.

Yazar Spotlight: Acinetobacter Biyofilm Miktarının Belirlenmesi, Değerlendirilmesi ve Görselleştirilmesi için Kapsamlı Bir Protokol 

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Biofilms are composed of live microbial cells and are difficult to remove from the surfaces. Acinetobacter strains commonly found in our environment, causing nosocomial infections, are also known to form biofilms on surfaces. So, we aim to develop methods to both quantify and visualize Acinetobacter biofilms.Our protocol provides a simple and easy method to quantify and visualize the biofilms of Acinetobacter. The viable number of cells inside the biofilms is quantified by using the viable count method. Our research findings reveal that the naturally-existing Acinetobacter vector strains have quite varying potentials for biofilm formation.Also, there will exist distinct morphological differences within the various biofilms. This paved the way for research focusing on the causes of such a large variation among Acinetobacter strains.

Protokolü takiben, orijinal olarak mutfak yüzeylerinden izole edilen Acinetobacter izolatlarının biyofilmleri, kristal viyole ile boyanmış polistiren 96 oyuklu bir plaka üzerinde oluşturuldu ve boyalar etanol içinde çözündürüldü ve biyofilm kütlesi için ölçüldü (Şekil 1). Biyofilm sayısı, OD 0.04 ila 1.69 arasında değişen suşlara bağlı olarak büyük ölçüde değişmiştir (Şekil 1). Stepanović ve ark....

Watch this Scientific Journal Video about A Comprehensive Protocol for Acinetobacter Biofilm Quantification, Assessment, and Visualization at JoVE.com

Bu protokol, aşının hazırlanmasını, kristal viyole boya kullanılarak mikrotitre plakalar üzerinde biyofilm miktarının belirlenmesini, biyofilmlerdeki canlı sayımı ve Acinetobacter biyofilmlerinin görselleştirilmesini açıklar.

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Biyofilmler canlı mikrobiyal hücrelerden oluşur ve yüzeylerden çıkarılması zordur. Çevremizde yaygın olarak bulunan ve hastane enfeksiyonlarına neden olan Acinetobacter suşlarının da yüzeylerde biyofilm oluşturduğu bilinmektedir. Bu nedenle, Acinetobacter biyofilmlerini hem ölçmek hem de görselleştirmek için yöntemler geliştirmeyi amaçlıyoruz.Protokolümüz, Acinetobacter'in biyofilmlerini ölçmek ve görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem sağlar. Biyofilmlerin içindeki canlı hücre sayısı, canlı sayım yöntemi kullanılarak ölçülür. Araştırma bulgularımız, doğal olarak var olan Acinetobacter vektör suşlarının biyofilm oluşumu için oldukça değişken potansiyellere sahip olduğunu ortaya koymaktadır.Ayrıca, çeşitli biyofilmler içinde belirgin morfolojik farklılıklar olacaktır. Bu, Acinetobacter suşları arasında bu kadar büyük bir varyasyonun nedenlerine odaklanan araştırmaların önünü açtı.

quantification-viability-assessment-visualization-strategies-for

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

1.4K Görüntüleme.  Korea Food Research Institute. Biyofilmler canlı mikrobiyal hücrelerden oluşur ve yüzeylerden çıkarılması zordur. Çevremizde yaygın olarak bulunan ve hastane enfeksiyonlarına neden olan Acinetobacter suşlarının da yüzeylerde biyofilm oluşturduğu bilinmektedir. Bu nedenle, Acinetobacter biyofilmlerini hem ölçmek hem de görselleştirmek için yöntemler geliştirmeyi amaçlıyoruz.Protokolümüz, Acinetobacter'in biyofilmlerini ölçmek ve görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem sağlar....

Video: Yazar Spotlight: Acinetobacter Biyofilm Miktarının Belirlenmesi, Değerlendirilmesi ve Görselleştirilmesi için Kapsamlı Bir Protokol 

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Biyoloji

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation  

To begin the process of bacterial inoculum preparation, collect 2 to 10 microliters of the bacterial strain from the vial, using a sterile pipette tip, and inoculate a commercially-available blood agar plate with it. Using a sterile loop, streak the agar surface, thinning it out with intermittent flaming. Incubate the prepared agar plate in an upside-down position at 30 degrees Celsius for about 20 to 24 hours.Next, select a single colony of the bacterial culture with a sterile needle and inoculate five milliliters of sterile BHI broth with this culture. Incubate the inoculated broth in a shaking incubator at 30 degrees Celsius at a speed of 150 rotations per minute for about 20 to 24 hours. Then transfer one milliliter of the culture to a sterile micro-centrifuge tube and centrifuge at 6, 000 g and room temperature for 10 minutes.Following centrifugation, discard the supernatant. Add one milliliter of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, to the pellet, and re-suspend it using a vortex. Centrifuge the re-suspended pellet at 6, 000 g for 10 minutes at room temperature and discard the supernatant.This time re-suspend the resulting pellet in sterile, tenfold-diluted BHI broth using vortex. Ensure to achieve an optical density of around 0.1 at 600 nanometers.

Acinetobacter Biyofilm Oluşumu için Bakteriyel İnokulumun Hazırlanması

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet  

To begin, add 200 microliters of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 96-well plate. Then add 200 microliters of deionized water into the outermost wells to keep the inner wells from drying out. Incubate the 96-well plate at 25 degrees Celsius for 24 hours.Following incubation, discard the supernatant in each well using a pipette. Carefully add 300 microliters of PBS to each well and remove the PBS again by using the pipette. Add 200 microliters of 1%crystal violet solution to each well before incubating the plate at room temperature for 30 minutes.Then after dispensing 200 microliters of absolute ethanol in each well, leave the plate for 15 minutes at room temperature. Ensure thorough mixing by pipetting the contents in each well up and down repeatedly. Using a microplate reader, measure the absorbance of the wells at 595 nanometers to determine the biofilm mass.The number of biofilms varied greatly depending on the strains, ranging from an optical density or OD value of 0.04 to 1.69 All of the Acetobacter isolates, except for A.bouvetii, formed biofilms, while A.radioresistens formed a weak biofilm. A.junii and A.baumannii formed moderate biofilms, and A.pittii and A.ursingii formed strong biofilms.

Acinetobacter (Acinetobacter) Kristal viyole kullanarak biyofilm miktar tayini

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count  

Begin by adding one milliliter of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 12 well plate. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours. Then, remove the supernatant using a pipette.Carefully add 1.5 milliliters of sterile phosphate buffered saline or PBS to each well, and again, remove the supernatant with the pipette. After adding one milliliter of sterile PBS to each well once more, use fitted cell scrapers to scrape off the bottom and wall surfaces of the wells. Transfer the harvested cell suspension to a sterile plastic tube marked as 10 to the negative one containing nine milliliters of saline and 10 to 20 glass beads.Vortex the tube for 60 seconds at maximum speed. Next, perform a tenfold serial dilution by transferring one milliliter of the cell suspension from the previous tube to another sterile tube marked 10 to the negative two containing nine milliliters of saline solution. Continue this process of serial dilution up to tube 10 to the negative seven.Spread 100 microliters from each dilution onto separate acinetobacter agar plates. Incubate the agar plates at 30 degrees Celsius for 24 to 42 hours. Then count the number of typical red colonies on each plate manually, considering those within the range between 10 and 250.All the acinetobacter isolates except for A.bouvetii had cells equivalent to seven to eight log CFU per well in their biofilms. While A.bouvetii had a much lower cell number at 4.4 Log CFU.

Acinetobacter Biyofilm Canlılık Sayımının Değerlendirilmesi

Acinetobacter Biofilm Visualization by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Begin by adding 200 microliters of bacterial inoculum into each well of a sterile 96-well plate prepared for microscopic analysis. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours before removing the supernatant with the pipette. Next, carefully add 300 microliters of filter-sterilized deionized water into each well.Remove the supernatant using a pipette once again. In another tube, prepare a diluted mixture of SYTO 9 and propidium iodide and filter-sterilized deionized water to the respective desired final concentrations. Then add 200 microliters of the mixture into each well and incubate the plate for 20 to 30 minutes at room temperature in a dark setting.Confocal laser scanning microscopy revealed that biofilm formation significantly varied depending on the strains. A substantial amount of biofilm was found in Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii, and Acinetobacter ursingii with distinct biofilm morphologies.