Bu eser Ulusal Kanser Merkezi, Kore (1510121) ve Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Hayır. K.-M.H. için araştırma hibe tarafından desteklenen yapıldı. NRF-2015R1A2A2A04007432).

Çalışma protokolü kurumsal İnceleme Kurulu Ulusal Kanser Merkezi, Kore tarafından (NCCNCS-12-630) kabul edildi.
1. numune hazırlama (30 dk)
<ol><li>HeLa hücreleri (CCL-2, ATCC) kültür için bir 100 mm Kültür tabak içinde 10 mL tam DMEM Orta (% 10 fetal Sığır serum, % 1 kalem-strep) kullanın. Serum-hasret HeLa hücreleri hazırlamak için bir önceki çalışmada11' açıklandığı gibi 48 saat boyunca DMEM konfluent HeLa hücreleri fetal Sığır serum olmadan kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri ayırmak için onları 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkamak ve 2 mL % 0.25 EDTA tripsin 100 mm Kültür çanak başına ekleyin. Sonra 2-3 dk 37 ° C'de CO2 kuluçka için kuluçkaya</li>
	<li>Tripsin devre dışı bırakmak için kültür yemek için tam DMEM orta 5 mL ekleyin ve müstakil hücreleri 15 mL tüp aktarın. Sonra 300 x g bir Pelet oluşturmak 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve 300 x g 10 dk de Santrifüjü tarafından iki kez 2 mL soğuk PBS ile Pelet yıkayın.</li>
	<li>Süpernatant kaldırılması sonra 1 mL % 95 etanol hücre Pelet ve hücre pelet tarafından vortexing etanol ile karıştırın. Buz üzerinde sabit hücrelerin hücre block hazırlık kadar tutun.</li>
</ol>2. hücre block hazırlık (1 saat 30 dk)
<ol><li>Dondurulmuş plazma hazırlanması için aliquots, sağlıklı donör kan EDTA plazma toplamak ve 10 dakika süreyle 13.000 x g, santrifüj toplamak süpernatant plazma ve aliquot 200-400 µL her microfuge içine tüpleri. -80 ° C'de aliquots kullanmak kadar saklamak. Dondurulmuş plazma aliquots hazır olduğunuzda, onları almak ve 5 min için 37 ° C'de kuluçka tarafından plazma çözülme.</li>
	<li>700 x g 10 min için de sabit hücreleri santrifüj kapasitesi sonra süpernatant atmak.</li>
	<li>Hücre Pelet plazma, thromboplastin 2 damla ve 0,025 M kalsiyum klorür 2 damla 2 damla (yaklaşık 200 µL) ile karıştırın. Sonra onları pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika, hücre pıhtı oluşturmak karışım izin verin Şekil 2Agösterildiği gibi. Sonra hücre pıhtı PBS ile dökme ve pipet tarafından PBS kaldırarak iki kez yıkayın. Temsilcisi beyaz hücre pıhtı Şekil 2Biçinde gösterilir.</li>
	<li>Filtre kağıt formalin ile nemlendirin ve hücre pıhtı önceden ıslatılmış filtre kağıdı ile sarın. O zaman, pıhtılaşmış karışımı bir pincette ile Şekil 2Ciçinde gösterildiği gibi bir doku kaset yerleştirin.</li>
	<li>Doku kaset tamponlu formalin (PBS % 10 formalin) 50 mL formalin fiksasyon için 4 ° C'de gecede içeren bir cam kavanoz içinde bir yer.</li>
</ol>3. doku işleme ve parafin (gece) katıştırma
<ol><li>Formalin sabit hücre pıhtı içeren doku kaset yük bir doku işlemcide gecede11daha önce açıklandığı gibi. Su kaldırma ve klima parafin katıştırma önce sabit hücre doku işleme içindir. Doku işleme olmadan araştırma için Tablo 1' de gösterildiği gibi yordam işleme doku yapmak.</li>
	<li>Orada olduğunu erimiş parafin metal kalıp içinde orada ısıtmalı gömme İstasyonu ve 60 dakika sonra çeke (Şekil 2B) açın.</li>
	<li>Doku kaset kurulan hücre pıhtıyı almak ve metal kalıp içinde erimiş parafin yere koyun.</li>
	<li>Yer yeni doku kaset kapağı hücreyi içeren metal kalıp içine olmadan ortasında erimiş parafin pıhtısı ve daha fazla erimiş parafin içine doku kaset ve metal kalıp üzerine dökün. O zaman, 30-60 saniye içinde soğuk plaka kuvvetlendirmek parafin izin ver.</li>
	<li>Doku kaset metal kalıp ayırın. Sonra parafin hücre block immunocytochemistry için hazırdır. Katıştırılmış hücre pıhtı parafin gömülü Hücre bloğundaki Şekil 2Eoku simgesiyle gösterilir.</li>
</ol>4. Immunocytochemistry (1 h) için slaytların hazırlanması
<ol><li>Hücre pıhtı parafin Hücre bloğundaki alanı kontrol edin ve hücre bloğu bir microtome kullanarak 3-4 µm kalınlıkları ile dilimler halinde kesin. Parafin kesitler silane kaplı cam slaytlarda Şekil 2Fiçinde gösterildiği gibi koymak.</li>
	<li>Bölümü slaytları slaytlar için uygun bölümler yapmak 30 dk 37 ° C fırında yerleştirin.</li>
</ol>5. Hücre blokları (6 h) Immunocytochemistry
Not: hücre block bölümler üzerinde boyama immunocytochemical için çeşitli kitleri kullanılabilir ( Tablo malzemelerigörmek). Böyle setleri çeşitli hassasiyetleri ve özelliklerine bağlı olarak onların değişiklikler var.
<ol><li>Ksilen de-paraffinize için 4 dakika için 50 ml bölümlerini kuluçkaya.</li>
	<li>Dehidratasyon için 2 min için % 100 etanol ve iki kez % 95 etanol ve % 80 etanol 2 min için slaytlar kuluçkaya. Ardından, etanol akan suyun 10 min için kaldırın.</li>
	<li>Antijen almayla, slaytları bir kavanoz içeren 40 mL Tris-EDTA alma arabellek, pH 9.0, yerleştirin ve bir Ocak 30 dakika kaynatın.</li>
	<li>Slaytlar akan suyun altında yıkayın ve onları % 95 etanol 4 ° C'de 10 dakika içinde kuluçkaya Sonra hücre boyama alanını slaytlara kolay tanımlanması için Pap kalemle işaretlemek.</li>
	<li>Tris tamponlanmış salin % 0,2 içeren slaytlar yıkama ara 20 (TBS-T) ve hidrojen peroksit bloğunda kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek) herhangi bir kalıntı peroksidaz aktivitesi kaldırmak 15 dakika oda sıcaklığında. Sonra slaytları TBS-T içinde üç kez 2 min için her yıkayın.</li>
	<li>Birincil antikor protein bloğundaki sulandrarak seyreltilmiş antikor çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek). Örneğin, birincil antikor olabilir CKAP2 1: 100 ve Ki-67 antikor 1:500 sulandırılmış. O zaman, seyreltilmiş antikor çözüm için 1 h 100 µL slaytları kuluçkaya.</li>
	<li>2 min için beş kez TBS-t yıkandıktan sonra 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında seti birincil antikor artırıcı slaytları kuluçkaya.</li>
	<li>TBS-t yıkama 2 min için dört kez sonrası HRP polimer (horseradish peroksidaz ile etiketli bir ikincil antikor) 2 damla ekleyin ve slaytlar, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>2 min için beş kez TBS-T yıkandıktan sonra diaminobenzidine (DAB) çözüm 100 µL ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) ve 3 dak slaytlarını kuluçkaya.</li>
	<li>TBS-T içinde iki kez yıkama sonra 100 µL hematoksilen çözüm (100 µL Hematoksilen ve 600 µL distile su karışımı) ekleyin ve 1 dk. slaytlarını kuluçkaya.</li>
	<li>TBS-T slaytları bir kez yıkadıktan sonra % 95 etanol için 2 dk içinde kuluçka, % 95 etanol içinde bir kez daldırma ve % 100 etanol içinde iki kez daldırma kurutmak. Sonra 5 min için bir cam kavanoza 40 mL ksilen içindeki slaytları kuluçkaya.</li>
	<li>Slaytları ksilen kuru olduğunda, ilgili coverslips bağlayın.</li>
	<li>Işık mikroskobu kullanarak boyama desenleri gözlemlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+immunofluorescence+of+cultured+cells.">High-quality immunofluorescence of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).</li><li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+-+Avoiding+the+pit+falls.">Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls.</a> J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li><li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Techniques.">Immunofluorescence Techniques.</a> J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).</li><li>Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+the+thromboplastin-plasma+cell-block+technique+for+fine-needle+aspiration+and+serous+effusions.">The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions.</a> Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).</li><li>Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+utility+of+the+cell+block+method+versus+the+conventional+smear+study+in+pleural+fluid+cytology.">Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology.</a> J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).</li><li>Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+block+cytology:+Improved+preparation+and+its+efficacy+in+diagnostic+cytology.">Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology.</a> Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).</li><li>Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value,+feasibility,+and+validity+of+preparing+cell+blocks+from+fluid-based+gynecologic+cytology+specimens.">Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens.</a> Cancer. 96, 204-209 (2002).</li><li>Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+electron+microscopy+on+paraffin-embedded+cytologic+material.">Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material.</a> Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).</li><li>Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mouse+cytoskeleton-associated+protein,+CKAP2,+with+microtubule-stabilizing+properties.">Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties.</a> Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).</li><li>Hong, K. U., Choi, Y. -. B., Lee, J. -. H., Kim, H. -. J., Kwon, H. -. R., Seong, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+phosphorylation+of+tumor+associated+microtubule+associated+protein+(TMAP)/cytoskeleton+associated+protein+2+(CKAP2)+at+Thr-596+during+early+phases+of+mitosis.">Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis.</a> Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).</li><li>Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -. L., Poojan, S., Hong, H. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CKAP2+(cytoskeleton-associated+protein2)+is+a+new+prognostic+marker+in+HER2-negative+luminal+type+breast+cancer.">CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).</li><li>Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+is+a+prognostic+parameter+in+breast+cancer+patients:+results+of+a+large+population-based+cohort+of+a+cancer+registry.">Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry.</a> Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).</li><li>Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+immunofluorescence+procedures+for+protein+analysis.">Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis.</a> Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).</li><li>Beutner, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining:+The+fluorescent+antibody+method.">Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).</li></ol>

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

İmmünfloresan sabit kültürlü hücreleri üzerinde boyama Şu anda seçim tayin edilmesi protein ifade düzey hücrelerdeki morfolojik bilgi1koruma sırasında yöntemidir. Ancak, parafin gömülü hücre bloklar immunocytochemistry mükemmel bir alternatif olabilir. Parafin gömülü hücre blokları ve immunocytochemistry hazırlanması için ayrıntılı yordamlar bu protokol için tarif var ve immunocytochemistry hücre çalışmalarda uygulanmasının kolaylaştırılması umuyoruz.
Immunocytochemistry immünfloresan boyama üzerinde çeşitli avantajları vardır. İmmünfloresan hücreler için genellikle boyama taze kültürlü hücrelerin gerekli ama parafin hücre blokları, oda sıcaklığında birkaç yıl13tutulabilir. Ayrıca, immunocytochemistry hücre bloklar rutin immünhistokimya insan doku4' te kullanılan aynı antikor istihdam ederek hücre içi ifade desenleri keşfedebilirsiniz. Ayrıca, protein düzeyleri veya ardından değişiklikler önceden hücreleri ile çeşitli ilaçlar veya çeşitli kültür koşulları11altında kuluçka tarafından değişimler keşfedebilirsiniz.
İmmunocytochemical boyama avantajları, aksine parafin gömülü hücre blokları hazırlanması zaman alır ve pahalı14yaşında. Ayrıca, çoğu araştırma laboratuvarları bu teknik deneyim eksikliği, ve bu şartlar altında teknik hatalar yaygındır. En sık karşılaşılan hataları hücre morfolojisi zavallı korunması ve parafin hücre block bölümleri üzerinde boyama yoksul ya da düzensiz immunocytochemical vardır. Bu ve en diğerleri en iyi hücre koşullar altında hücre blok yapma ve hücre pıhtıları oluşturmak için yeterli bir çözüm kullanarak önlenebilir.
Bir gösteri mevcut iletişim kuralı olarak hücre blokları HeLa hücreleri için hazırlanmıştır ve immunocytochemical boyama iki nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri, CKAP2 ve Ki-67, daha önce bildirilen11olarak gerçekleştirildi. İmmunocytochemistry için hücreleri kuluçka medya ve fetal Sığır serum olmadan tarafından manipüle ve serum açlık etkisi dikkat edilmelidir. Çünkü birçok Slaytları slayt başına yalnızca bir 4-5 µm kalınlığında hücrede bölümü kullanarak bir hücre Block hazırladı bu hazırlanan parafin gömülü hücre bloklar antikorlar, çok sayıda için istihdam edilebilir. Bu nedenle, iki farklı koşullar için karşılık gelen ifade desenleri birkaç farklı antikorlar ile değerlendirilebilir. İmmunostaining CKAP2 için desen ve Ki-67 kanser dokuları-si olmak zaten be bildirdi9,10,11,12ve sonuçları boyama immunocytochemical kolayca, çünkü değerlendirilecektir boyama desenleri immünhistokimya üzerinden oldukça benzer.
Sonuç olarak, parafin hücre bloklar üzerinde boyama immunocytochemical immünfloresan boyama için mükemmel bir alternatif olabilir; Ayrıca, bu kolayca ve güvenle ifadesi hücre hatlarında morfolojik bilgi koruyarak profil oluşturma için temel araştırma istihdam edilebilir.

Çoğu laboratuvarlarda parafin gömülü hücre blokları yaygın olarak kullanılmaz. Daha doğrusu, kültürlü hücreleri sabit, hücreleri parafin gömülü değil, istihdam edilmektedir hücre altı yerelleştirme çalışmalarında. O kültürlü hücreleri sabit, floresans Kromojen yerine kullanılmıştır. Bu nedenle, immünfloresan boyama Şu anda seçim için belirlenmesi protein ifade düzeylerinin hücre kültürleri1istihdam araştırma yöntemidir. Slaytlar immünfloresan boyama için hazırlanan ancak, görüntüleri oldukça farklı uçak mikroskobu2altında belirtilen gösterebilir sadece immünfloresan mikroskobu altında görülebilir. Ayrıca, immünfloresan boyama için slaytlar korunması parlak ışık koruma gerektirir ve floresan sinyalleri ile tekrarlanan maruz kalma nedeniyle3floresan sinyal kaybı görüntüleme için zayıf olmak. İmmunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar sonuçlarından oldukça immünhistokimya parafin gömülü doku4üzerinden benzer ve klinik bilgileri kolayca çevrilebilir. Bu nedenle, immunocytochemistry mükemmel bir alternatif olabilir. Ancak, hücre block hazırlık temel araştırma laboratuvarlarında popüler olmamıştır. Bu protokol için sonra bu yöntem hücre kültürü çalışmaları alanında kullanılmasını sağlamak için hücre block hazırlık ve immunocytochemical boyama sağlanır.
Hücre block hazırlık ve immunocytochemistry benzersiz yöntemler değildir ve onlar zaten klinik tanı temel araştırma4,5' e uygulandıktan. 4,çeşitli hücre block hazırlama yöntemleri olmuştur rapor6 thromboplastin-plazma yöntemi basit, uygun maliyetli ve kolayca adapte edilebilir olsa da. Bu nedenle, bu yazıda, thromboplastin-plazma yöntemi4,5,6,7,sunulan protokolünde8 parafin gömülü hücre blokları hazırlanması için kullanılır.
Bu da çalışmanın, thromboplastin-plazma hücre blokları ve iki nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri istihdam immunocytochemistry yöntemi hazırlanması için ayrıntılı yordamlar gösterdi. Son zamanlarda bir mitotik marker9,10,11bildirilmiştir sitoiskeleti ilişkili protein 2 (CKAP2), bir işaretleyicidir; diğeri ise Ki-67, en iyi bilinen nükleer silahların yayılmasına karşı marker12' dir. Temsilcisi şeması Şekil 1' de gösterilen.

<table><tbody><tr><td>HeLa Cells</td><td>ATCC</td><td>HeLa (ATCC&amp;nbsp;CCL-2)</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9106-S1</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher SCientific</td><td>1330-20-7,100-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethenol</td><td>GD Chem</td><td>DJ16016</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Agilent</td><td>10118581</td><td></td></tr><tr><td>DAB Quanto Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-125-QHDX, QHCX 170405</td><td></td></tr><tr><td>Ultravision LP detection Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PBQ141209, LPB141209, LPH141210</td><td>Kit for immunocytochemistry; contains protein block</td></tr><tr><td>TintoRetriever Pressure Cooker</td><td>Bio SB Corporation</td><td>BSB 7008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>IBS-BT008</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corporation</td><td>115106</td><td></td></tr><tr><td>Thromboplastin</td><td>Neoplastin Cl Plus</td><td>NC0591432</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA retrival Buffer</td><td>Dignostic Biosystem</td><td>E625-A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&amp;nbsp;bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone Laboratories Inc</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Ultra vision peroxide block H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02Q141212</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>363313</td><td></td></tr><tr><td>Pap-Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-0155</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>PAA Laboratories</td><td>H21-002</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Daejung</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tube</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>tissue processing cassette</td><td>Simport</td><td>M492-5</td><td></td></tr><tr><td>100 mm culture dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>140712</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Marienfeld</td><td>2262817</td><td></td></tr><tr><td>Glass Zar</td><td>Hyunil Lab-Mate</td><td>HIP-1027</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Class II Laminar Flow Hood</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1300 series A2</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processor</td><td>Leica BioSystem</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>CX-21</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin embedding station</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC 350-1, EC 350-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Section Bath (Round)</td><td>CellPath</td><td>HCP-JAW-0100-00AEU</td><td></td></tr><tr><td>Fume Hood</td><td>Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.</td><td>FH-150</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of protein expression level in cultured cells by immunocytochemistry on paraffin-embedded cell blocks

Morfolojik bilgi aynı zamanda gerekli olduğunda immünfloresan boyama Şu anda seçim protein ifade düzeyleri tespiti için hücre kültürü sistemlerinde yöntemidir. Burada, sunulan parafin gömülü hücre bloklar üzerinde boyama immunocytochemical Protokolü immünfloresan parafin katıştırılmış sabit hücreleri üzerinde boyama için mükemmel bir alternatiftir. Bu iletişim kuralı, HeLa hücreleri parafin hücre bloğundan thromboplastin-plazma yöntemi kullanılarak hazırlanan ve immunocytochemistry iki nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleri, CKAP2 ve Ki-67 değerlendirme için gerçekleştirildi. Çekirdek ve sitoplazmik morfoloji HeLa hücrelerin hücre bloğu slaytlar iyi korunmuş. Aynı zamanda, immunocytochemistry CKAP2 ve Ki-67 boyama desenleri immunohistokimyasal parafin kanser dokularda boyama ile oldukça benzer. Serum serbest koşullarda HeLa hücrelerin ön kuluçka dahil olmak üzere değiştirilmiş hücre kültürü koşullarla etkisi mimari bilgi koruyarak değerlendirilecektir. Sonuç olarak, immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar immünfloresan boyama için mükemmel bir alternatiftir.

Hematoksilen ve eozin lekeli slayt içinde parafin gömülü hücre Block (Şekil 3AB), hücrelerin sitoplazma ve çekirdeklerin en sağlam, morfolojik korunması ile geçerli Protokolü (mükemmel olduğunu düşündüren Şekil 3A). İmmunocytochemical boyama, pozitif CKAP2 boyama yoğun kromatin, mitotik iğ ve sitoplazma (Şekil 4), daha önce bildirilen10' a kadar gözlendi. Ki-67 boyama hücre çekirdeği beklenen (Şekil 4) gözlenmiştir. Yalnızca yoğun kromatin boyama hücreleri CKAP2 ile (bkz. Şekil 4ABokları) Mitotik hücre vardı. Birçok CKAP2 pozitif hücreler bir kuluçka tam orta (Şekil 4A) sonra hazırlandığını yüksek oranda mitotik HeLa hücreleri içinde gösterilmiştir. Buna karşılık, serum-hasret HeLa hücreleri (Şekil 4B) kaç CKAP2 pozitif hücre vardı. En yüksek oranda mitotik HeLa hücreleri vardı Ki-67 pozitif (Şekil 4 c). Contrastingly, Ki-67-pozitif oranı serum-hasret HeLa hücreleri içinde ~ %50 (Şekil 4 d) yüksek kaldı. Bu sonuçlar bu CKAP2 Ki-67 daha bir daha güvenilir nükleer silahların yayılmasına karşı işaretleyicisinde kanser hücreleri olduğunu göstermektedir bir önceki rapor11, oldukça karşılaştırılabilir.
Kötü hazırlanmış hücre blokları, çekirdeklerin sitoplazma ayrılır ve ortada da, sonuçta, zavallı morfolojik koruma. Gecede daha uzun kuluçka buzdolabında sabit hücrelerin böyle kötü sonuçlar neden olabilir. Başka bir önemli sorun hücreleri de mükemmel morfoloji rağmen immunocytochemistry tarafından lekeli değil. Hücre pıhtı küçük olduğunda bu sorun daha sık ortaya çıkar. Genellikle, boyama yoğunluğu Şekil 3B' gösterildiği gibi düzensiz; Ama hücre pıhtı daha büyük olduğunda, düzensiz boyama çok daha az şans. Bu nedenle, bu protokol için biz büyük hücreli pıhtı oluşturmak üzere plazma, thromboplastin ve kalsiyum klorür hacimleri arttı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig1.jpg"> Şekil 1: hücre block hazırlık planı. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig2.jpg"> Şekil 2: illüstrasyon parafin hücre block hazırlık. (A) thromboplastin-plazma hücre pıhtı tüp. (B) TP hücre pıhtı PBS yıkama sonrası. (C) hücre pıhtı ıslatılmış süzgeç kağıt üzerinde. (D) doku gömme İstasyonu erimiş mum ile. Metal kalıp (ok) erimiş mum katılaşma için tutar. (E) parafin gömülü hücre pıhtı (ok) parafin veya parafin gömülü hücre block katıştırılabilir. (F) ince parafin bölüm kaplı bir slayt orta kısmında. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig3.jpg"> Şekil 3: hücre block hazırlık ve hematoksilen eozin ve immunostaining kalite onayı. (A) HeLa hücreleri parafin gömülü hücre-blok bölümündeki Hematoksilen ve-eozin-lekeli görüntü. (B) düzensiz Ki-67 immunocytochemistry üzerinde kötü içinde boyama parafin gömülü hücre-blok bölüm hazır. Ölçek barlar (A) 100 ve (B) 200 mikron vardır. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57369/57369fig4.jpg"> Şekil 4: HeLa hücreleri için parafin gömülü hücre blokta Immunocytochemical boyama. (A) yüksek oranda mitotik koşullar altında boyama CKAP2. (B) serum-hasret koşullar altında boyama CKAP2. (C) Ki-67 yüksek oranda mitotik koşullar altında boyama. (D) Ki-67 serum-hasret koşullar altında boyama. 100 μm kalınlığında ölçek çubuğu gösterilir. Ok uçları CKAP2 pozitif hücreler gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57369/57369fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Yordamı</td>
			<td>Adımları</td>
			<td>Çözüm</td>
			<td>Zaman/sıcaklık</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Su kaybı</td>
			<td>1</td>
			<td>% 70 alkol</td>
			<td>15 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>% 80 alkol</td>
			<td>15 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>% 95 alkol</td>
			<td>15 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>%100 alkol</td>
			<td>15 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Takas</td>
			<td>1</td>
			<td>Ksilen</td>
			<td>60 dk/4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Ksilen</td>
			<td>10 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Ksilen</td>
			<td>10 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Ksilen</td>
			<td>10 dk/RT</td>
		</tr>
<tr>
<td>* RT, oda sıcaklığında</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Doku işleme yordamı.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks at JoVE.com

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Morfolojik bilgi aynı zamanda gerekli olduğunda şu anda, immünfloresan sabit hücreleri üzerinde boyama seçim protein ifade düzeyleri tespiti için yöntemidir. Burada sunulan bu protokolü parafin gömülü hücre bloklar immunocytochemistry alternatif bir yöntem sağlar.

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

determination-protein-expression-level-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.4K Görüntüleme.  National Cancer Center. Morfolojik bilgi aynı zamanda gerekli olduğunda şu anda, immünfloresan sabit hücreleri üzerinde boyama seçim protein ifade düzeyleri tespiti için yöntemidir. Burada sunulan bu protokolü parafin gömülü hücre bloklar immunocytochemistry alternatif bir yöntem sağlar.

Video: Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Tıp

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Biyoloji

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Kanser Araştırmaları

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Isolation of Stably Transfected Melanoma Cell Clones

Cell populations that have stable changes in their genomic information are widely used by scientists as a research model. They do not require repeated cell transfection as it can lead to a heterogeneous cell population and variable transfection efficiency, affecting reproducibility. Moreover, they are preferable for large-scale analyses. The generation of stable cell clones is useful for a wide range of applications, such as research on gene functions and recombinant protein production. There are a few methods to obtain a homogenous cell population upon initial transient transfection. Here, we describe the isolation of single cell clones with glass cylinders. Although this method has been known for some time, there are a few crucial steps, and neglecting them may lead to failure. We have successfully used this method to obtain clones stably overexpressing a protein of interest (POI) or with knockout of a gene of interest (GOI). We describe preparation steps such as the optimization of selecting drug concentrations, preparation of glass cylinders, and validation of whether the obtained clones have the desired change in the expression of the GOI by PCR, western blot analysis, immunostaining, or gDNA sequencing (depending on the type of derived clones). We also discuss the phenotypic heterogeneity of well-established cell lines as this might be an issue in obtaining stable cell clones.

A protocol is described for isolating stably transfected melanoma cell clones using glass cylinders. We focus on practical advice that may be decisive for the success of the entire procedure.

Cell populations that have stable changes in their genomic information are widely used by scientists as a research model. They do not require repeated ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Standardized Processing for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Immunohistochemistry Controls

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While tissue controls are beneficial for well-characterized proteins with defined tissue and cellular expression patterns, they are less suitable for the initial development of IHC assays for novel, poorly characterized, or ubiquitously expressed proteins. Alternatively, due to their standardized nature, cell pellets, including cancer cell lines with defined protein or transcript expression levels (e.g., high, medium, and low expression), transfected over-expressing cell lines, or cell lines with genes deleted through cell engineering technologies like CRISPR, can serve as valuable controls, especially for the initial antibody characterization and selection. In order for these cell pellets to be used in the development of IHC assays for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues, they need to be processed and embedded in a manner that recapitulates the procedures used for tissue processing. This protocol describes a process for creating and processing formalin-fixed, paraffin-embedded cell pellet controls that can be used for IHC method developments.

Presented here is a protocol for generating formalin-fixed, paraffin-embedded cell pellet controls for immunohistochemistry.

Formalin-Sabit, Parafin-Gömülü Hücre Pelet İmmünohistokimya Kontrolleri için Standartlaştırılmış İşleme

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While ...

Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Tissue Imaging via Light Microscopy

Source: Michael S. Lee1 and Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201
Immunohistochemistry (IHC) and immunocytochemistry (ICC) are techniques used to visualize the expression and localization of specific antigens using antibodies. The first published use of IHC was in 1941 when Albert Coons used the technique to visualize the presence of pneumococcal antigen in tissue sections from mice infected with Pneumococcus (1). The name, immunohistochemistry, is derived from the roots &#34;immuno-,&#34; in reference to antibodies, and &#34;histo-,&#34; in reference to the tissue sections used in IHC. The root &#34;cyto-&#34; in immunocytochemistry highlights the key difference between ICC and IHC. Whereas IHC uses sections of whole tissue, ICC uses cells that have been isolated from tissue or grown in culture. The difference in samples used means sample preparation technically differs between IHC and ICC, but otherwise the protocols for ICC and IHC are identical and one will find the terms are frequently used interchangeably.
In both IHC and ICC, antibodies with either chemical or fluorescent tags, such as peroxidase or rhodamine, respectively, are used to visualize the distribution of any antigen of interest through specific binding of the tagged antibody to the antigen. In the case of IHC, thin slices of tissue are immobilized on a slide to maintain the structure of the tissue before being stained, allowing the visualization of antigens in the context of whole tissues (Figure 1). In the case of ICC, cells are distributed evenly on a slide before being stained, allowing the visualization of antigen distribution within individual cells but not within the structure of any specific tissue. Due to the similarities between the two protocols, this protocol will focus on IHC to address the additional complexities of sample preparation involved in IHC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10498/10498fig1.jpg" /> 
Figure 1: Outline of IHC Protocol. Visual outline of an IHC protocol for paraffin-embedded tissue dissected from a mouse. This protocol uses a biotinylated secondary antibody and strepavidin-HRP to visualize the location of antibody binding. Other options, such as fluorescently tagged antibodies, are also possible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10498/10498fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The first major decision when performing IHC is how to prepare the tissue sections in order to maintain the structure of the tissue throughout the staining process. The two main choices are formalin-fixed sections of paraffin-embedded tissue or fresh sections of frozen tissue. There is no simple answer as to which method to use as it depends on what downstream analysis will be conducted. Formalin-fixation of paraffin embedded tissues is generally thought to better preserve tissue morphology for optimal imaging while freezing fresh tissue can preserve protein function for subsequent assays outside of IHC. In addition, fresh frozen tissue sections have been shown to be more suitable for gene expression analysis (2). A third consideration is whether or not the antibodies for your antigen of interest are suitable for either fixed or frozen tissue sections, as some antibodies have only been optimized for a specific type of section and may not work for others. Finally, one also needs to determine how long they need to store the tissue sections, as fresh frozen samples must be kept at -80&#176;C and may not last beyond one year while fixed sections can be stored for much longer at room temperature. These are a few of the major considerations for determining whether to use formalin-fixed sections of paraffin-embedded tissue or fresh sections of frozen tissue. Ultimately, if one has enough tissue, it may be best just to have some of both.
In this experiment, we set out to determine if cyclin D1 expression was increased in enlarged spleens from a spontaneous mouse model of lymphoma development. Splenic tissue samples were first isolated from either wild-type mice, transgenic mice that do not have lymphoma, or transgenic mice that have spontaneously developed lymphoma. The spleen tissue samples were fixed in paraformaldehyde, embedded in paraffin, sectioned, stained using a mouse anti-cyclin D1 primary antibody followed by a horse anti-mouse secondary antibody, and developed using 3,3-diaminobenzidine (DAB). The sections were then counterstained in Harris Hematoxylin Solution and then the sections were imaged at 20X magnification.
Reagents
Paraffin-Embedded Sections
<ol type="a">
	<li>4% Paraformaldehyde (PFA)</li>
	<li>Ethanol (anhydrous denatured, histological grade 100%, 95%, 80%, 75%, and 50%). Can be diluted from 100% stock using double distilled water (ddH2O)</li>
	<li>Xylene</li>
	<li>IHC compatible glass slide to ensure tissue section remains attached throughout the entire procedure. IHC compatible glass slides have a specialized coating and are readily available from multiple retailers. If performing ICC, use a chambered slide. Chambered slides allow for cells to be seeded in the chambers and placed in the incubator until cells attach to the slide and reach proper confluency, at which point the chambers can be removed and staining can proceed in the same manner as IHC.</li>
	<li>Paraffin</li>
	<li>0.3% Hydrogen peroxide (H2O2)/methanol: To prepare, add 1 mL 30% H2O2 to 99 mL methanol. Store at -20&#176;C</li>
	<li>Antigen retrieval buffer: IHC citrate buffer pH 6.0</li>
</ol>
Fresh Frozen Sections
<ol type="a">
	<li>Optimal cutting temperature (OCT) embedding compound</li>
	<li>Optimal fixative: 4% PFA or acetone that has been cooled to -20&#176;C</li>
</ol>
Staining
<ol type="a">
	<li>Blocking buffer: Should be determined by user. One example is horse serum diluted in 1X PBS</li>
	<li>Diluted primary antibody: see manufacturer specifications</li>
	<li>Diluted biotinylated secondary antibody: see manufacturer specifications</li>
	<li>Diluted avidin-Horseradish Peroxidase (HRP): Only for peroxidase visualization. See manufacturer specifications.</li>
	<li>DAB or another compatible substrate</li>
	<li>Counterstain (optional)</li>
	<li>Ethanol (anhydrous denatured, histological grade 100% and 95%)</li>
	<li>Xylene</li>
	<li>Organo/Limonene Mount</li>
</ol>

Immunohistochemistry &amp; Immunocytochemistry: Tissue Imaging

Source: Michael S. Lee1 and Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and ...