Bu araştırma, Dr Ian Goodfellow verilen bir Wellcome Trust Kıdemli Kardeşliği tarafından finanse edildi.

1. Hücre hatları Üretimi: pMEP4 transfeksiyon / ifade <ol><li> PMEP4 ifade vektörü ile hücre transferinde ve tüm sahte transfekte hücrelerini öldürüldü kadar higromisin B / ml (Roche) 100 mikrogram ile seçin. PMEP4 plazmid belirli bir klon izole etmek için gerek yoktur episomally şekilde korunur. </li><li> PMEP4 vektörü içeren hücrelerin 16 saat süreyle 10 uM CDCh 2 ile muamele ile uyarılan edilebilir. İfade ve indüklenebiliyordu hücre hatlarının amplifikasyonu önce küçük ölçekte teyit edilmelidir. Protein G etki hemen hemen tüm türlerden antikorların bağlanma olarak TAP-etiketli protein kolayca tespit edilebilir. Büyük ölçekli saflaştırılması için hücreleri, genellikle 10 konfluent 175 cm 2 şişeler gereklidir. Bu yaklaşık 2 X10 8 salgılayan hücrelerin eşittir. </li></ol> 2. Hücre lizat hazırlığı <ol><li> PBS içine hücreleri kazıyın ve tek bir 50 ml tüp birleşir. 1200X gf Spinveya 5 dakika (Bu yıkandıktan sonra yaklaşık 1.5 ml azaltır, başlamak dolu hücrelerin 2-3 ml sebep olmalıdır). </li><li> Buz gibi soğuk PBS (50 ml her seferinde) hücreleri, üç kez yıkanır. </li><li> 5 ml lizis tamponu (hücre parçalayan 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 ve proteaz inhibitörü ). Not: NaF, Na 3 VO 4 ve proteaz inhibitörleri taze ilave edilmelidir. Buz üzerinde 5 dakika ayrılmadan önce 10 kez aşağı yukarı Pipeti ve. Buz üzerinde 5 dakika buz üzerinde tekrar ayrılmadan önce künt bir iğne kullanarak Şırınga aşağı yukarı 5-10 kez. Syringing tekrarlayın ve buz üzerinde daha 5 dakika bekletin. </li><li> (Sıvı N 2 / veya kuru buz ve etanol) iki kez lizat donma-çözülme. Örnek 4 ve daha büyük ° C&#39;ye ulaşmasına izin vermeyin Not: işlemek için zaman ° C&#39;ye kadar -80 bu örnek saklayabilirsiniz. </li><li> 1.5 ml tüpler içine alikotu örnek ve kaldırma Parçalanmayan hücreleri ve dsantrifüjleme (4 at 10 ° C dakika, 16,000 x g) tarafından ebris. </li><li> Süpernatant Kurtar, 15 ml falcon tüp içinde birleştirmek ve (isteğe bağlı) protein verimi ölçümü için 20 mikrolitre numune almadan önce filtre 0.45 mikron geçer. Sonraki analiz (Örnek 1) için bir başka 50 ul alikotu çıkarın. </li></ol> 3. Tavşan IgG-agaroz bağlanarak (Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g&#39;de yapılmalıdır) <ol><li> Yavaşça şişe dönen tarafından tavşan IgG-agaroz (Sigma-Aldrich) tekrar süspansiyon. IgG agaroz (bir kesim 1ml pipet kullanarak) 380 ul atın ve 1 dakika santrifüj nakliye / solüsyonundan kaldırın. Soğutulmuş lizis tamponu (4 ° C) açıklığa kavuşturmak için santrifüj kullanarak. Yılında agaroz üç kez yıkayın Agaroz nihai verim paketlenmiş boncuklar yaklaşık 250 ul olmalıdır. </li><li> 2.6 (15 ml şahin küvette gelen temizlenmiş hücre lizatı eklee) 4 C&#39;de 3 saat yıkanmış tavşan-IgG ve agaroz inkübe (ya da gece boyunca) ° C arasında bir döner mikser kullanılarak. </li><li> 4 ° C de 5 dakika için agaroz boncukları aşağı doğru dönmeye ve sonraki analiz (Örnek 2) için supernatant kaldırın. Not: protein etiketli TAP artık boncuklu ile ilişkili edilmelidir. </li></ol> 4. TEV proteaz bölünme (Not: Tüm spin aksi belirtilmedikçe, 1 dakika 4oC bir soğutmalı santrifüj içinde 1200X g yapılmalıdır) <ol><li> Soğutulmuş lizis tamponunda tavşan IgG agaroz boncuk üç kez yıkayın (4 ° C) (not: lizis tamponu proteaz inhibitörleri içermemeli) açıklığa kavuşturmak için santrifüj kullanarak. Bakım yıkama adımları sırasında herhangi bir boncuk kaldırmak veya kaybetmek değil alınmalıdır. </li><li> Netleştirmek için santrifüjleme ile TEV-proteaz bölünme tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl ve% 0.2 NP-40) sahip boncuk bir başka iki kez yıkanır. Son yıkamadan sonra dikkatlice li kaldırmakboncuklar sterlin. </li><li> Bir TEV proteaz bölünme karışım hazırlamak; her bir örnek için 467,5 ul H2O, 25 ul 20x TEV Tamponu (Invitrogen), 5 ul 0.1 M DTT ve 2.5 ul (25 U) TEV Proteaz (Invitrogen) içerir. Paketlenmiş boncuklar her bir örnek için bu TEV bölünme mix 500 ul ekleyin ve 1.7 ml önceden yağlanmış bir tüp (Costar) için tüm karışımı aktarın. Kuluçka öncesi sonraki analiz (Örnek 3) için bir 30 ul alikotu çıkarmak için kullanılır. </li><li> 4 gece boyunca TEV proteaz reaksiyon inkübe ° C Döner karıştırıcı kullanarak. Daha kısa inkübasyonlar kez ampirik olarak tespit edilmelidir yem protein ve TEV proteaz bölünme sitesini ancak minimal inkübasyon süresi erişilebilirlik doğasına bağlı olarak kullanılabilmektedir dikkat ediniz. </li></ol> 5.. İmmobilize Streptavidin Plus, boncuk ULTRALINK bağlanarak (Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g&#39;de yapılmalıdır) </p&gt; <ol><li> 1200X g (4 ° C) 5 dakika tavşan IgG agaroz boncuklar içeren TEV bölünme reaksiyonu santrifüjleyin. Analiz için bir açıklık süpernatan 20 ul alikotu (Örnek 4) kaldırmak </li><li> Taze bir 1.5 ml önceden yağlanmış bir tüp (Costar) kalan süpernatant (yaklaşık 480 ul) aktarın ve buz üzerinde bırakıyoruz. Bu Süpernatant atmayın - Bu sizin TEV bölünmüş yem protein ve ilişkili herhangi bir bağlayıcı protein içerir. </li><li> Kalan tavşan IgG agaroz boncuk ve Pastör pipetiyle için soğutulmuş lizis tampon 500 ul (Bölüm 2.3) ekleyin. Süpernatant çıkarmadan ve adım 5.2 o ile birleştirerek önce boncuk açıklığa kavuşturmak için bu karışımı santrifüjleyin. (Şimdi örnek ~ 980 ul içermelidir) buz üzerinde bu tüp bırakın. </li><li> Sonraki analiz için tavşan IgG agaroz boncuklar (Örnek 5) saklayın. Not: SDS-PAGE jel (ya da western blot) Bu örneği çalıştırmak eğer nedeniyle IgG ağır ve hafif varlığı arka planda bir sürü verecekzincirleri. </li><li> Bu arada hafifçe ULTRALINK şişe dönen tarafından Streptavidin Artı agaroz boncuk (Pierce) İmmobilize tekrar süspansiyon. Önceden yağlanmış 1.5 ml tüpler içine sonuna kesim, kısım numune başına streptavidin boncuk 70 ul ile 200 ul pipet kullanmak ve santrifüj nakliye / solüsyonundan kaldırın. Not: Bu boncuklar çok küçük ve bu yüzden &quot;ördek gagalı&quot; veya düz / dar uçlu ipuçları yıkama esnasında boncuk kaybını en aza indirmek için kullanılabilir. </li><li> Streptavidin boncuklar soğutulmuş lizis tamponu içinde üç kez yıka (4 ° C) netleştirmek için santrifüjleme ile. Bu tüp başına paketlenmiş boncuk yaklaşık 45-50 ul bırakmalısınız. </li><li> Transfer 4 3 saat (veya gece) için yıkanmış streptavidin boncuk ve inkübe içeren tüpe TEV-proteaz bölünme süpernatant (yani adım 5.3 &#39;ten örnek 980 ul) ° C Döner karıştırıcı kullanarak. </li><li> 4 ° C de 5 dakika için streptavidin boncuklar aşağı doğru dönmeye ve (bir sonraki analiz için supernatant kaldırmak Sample 6). Streptavidin boncuklar soğutulmuş lizis tamponu içinde üç kez yıka (4 ° C) netleştirmek için santrifüjleme ile. Son yıkamadan sonra, dikkatle kalan tüm yıkama tamponu çıkarın. </li></ol> 6. Streptavidin bağlayıcı peptid ve yem protein biotin elüsyon (Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C&#39;de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g&#39;de yapılmalıdır) <ol><li> Biotin (1 mM D-biotin) ve bir döner mikser kullanılarak 3 saat (ya da gece boyunca) için 4 ° C&#39;de inkübe: 500 ul PBS ilave edilerek streptavidin boncuklar ile etiketlenmiş proteinleri elüt edilmesi. </li><li> 4 ° C de 5 dakika streptavidin boncuk aşağı çevirin ve 1.5 ml önceden yağlanmış tüpü (Not süpernatant kaldırmak: Bu senin son örnek / elüsyon (Örnek 7). </li><li> Kalan streptavidin boncuk için PBS ve dönen bir mikser kullanarak 2-3 saat (veya gece) 4 ° C&#39;de inkübe: başka bir 500 ul Biotin ekleyin. </li><li> Returba 6.2 adım ve iki elutions (Örnek 7) birleştirir. Bu, nihai elüsyon -80 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Biotin elüsyon etkinliğini değerlendirmek için, daha sonra SDS numune tamponu (Örnek 8) (: Fisher LaneMarker 5x azaltarak numune tamponu tavsiyeler) kalan streptavidin boncuk dondurma ve kaynatın. </li></ol> 7. Protein konsantrasyonu <ol><li> Nihai arındırıldı (Örnek 7), çünkü düşük protein konsantrasyonunu ve nispeten yüksek hacim analizden önce konsantre edilmesi gerekmektedir. Bu, düşük moleküler ağırlıktaki (&lt;5 kDa) Vivaspin sıkma kolon (Vivascience) kullanılarak elde edebilir. Az 100 ul için ses aşağı konsantre hedefliyoruz. Bu son örnek (: Fisher LaneMarker 5x azaltarak numune tamponu öneriler) kaynatılır ve protein örnek tampon saklanabilir. </li></ol> 8. Analiz <ol><li> Örnekler 1-8 aşağı çekme etkinliğini belirlemek için western blot ile analiz edilebilir. Not: Çoğu sekonder antikorlar olacakfüzyon protein Protein G etki çapraz reaksiyona ama bu TEV proteaz bölünme sonra kaldırılır. </li><li> Örnek 7 1D veya 2D SDS-PAGE ile analiz edilebilir. Boyama gümüş veya Coomassie (: SilverQuest gümüş boyama ve Invitrogen Kolloidal Mavi Coomassie boyama kitleri öneriler) kullanılarak yapılabilir. Protein tanımlama kütle spektrometrisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar TAP etiketli eIF4E bağlayıcı ortaklarına tanımlamak için bu protokolünden nihai elüsyon (Örnek 7) arasında 1D SDS-PAGE ile analiz için bir örnek, Şekil 2&#39;de verilmiştir. Bu temsili jel hücre diğer proteinler ile eIF4E etkileşimlerin kompleksi ve bol doğasını yansıtır. Sadece TAP etiketi ifade eden bir hücre dizisi aynı zamanda elde edilen Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, açılan baited Bu eIF4E özgünlüğünü göstermektedir. Konsantre son elüsyon bu örneği% 15 (Örnek7) Invitrogen Silverquest gümüş boyama kiti kullanılarak lekelenmektedir edilmeden önce, piyasada bulunan önceden dökme gradyanı kullanılarak jel 1D SDS-PAGE ile analiz edildi. Tipik olarak, geri kalan konsantre nihai elüsyon (Örnek 7), 50-85% Koloidal Coomassie (Invitrogen) boyası ile analiz edilir. Tüm şeritli Örnekler (jel dilim / bantları) sonra kitle spektrometre tarafından ayıklanır ve analiz edildi. Açılan eIF4E tanımlanan proteinleri spesifik olmayan bağlanma ortak belirlemektir negatif kontrol gelen bağlayıcı ortaklarına karşı filtre edildi. TAP etiketleme eIF4E bu işlem kullanılarak tespit Nihai protein bu teknik kullanılarak tespit normal proteinler için temsili Şekil 2, görülebilir. Buna ek olarak, eIF3 alt birimlerinin bir sayı, aynı zamanda (veri gösterilmemiştir) tespit edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1.. Şematiktandem afinite saflaştırma prosedürü. altı adım tandem afinite saflaştırma (TAP) protokolü hücre hattı üretimi, hücre parçalama, Tavşan IgG agaroz immüno-yağış, TEV proteaz bölünme, streptavidin boncuk afinite saflaştırma ve nihayet biotin elüsyon içerir. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Fare eIF4E protein Tandem afinite saflaştırma. Ölümcül tagged dokunun N ortakları etkileşimde eIF4E ekli protokol kullanılarak ökaryotik HEK293 hücrelerine arınmış. Nihai elüsyon (Örnek 7) bir 20% fraksiyonu önceden dökme 4-12% gradyanı jel (TAP-eIF4E şeritli) üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi. Eşdeğer bir analizi tek başına etiketi (TAP şerit) için yapıldı. Proteinler gümüş boyama yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Daha sonra aynı örnek kütle spektrometresi tarafından tespit Proteinler jel vurgulanır. Kısaltmalar: eIF4G; ökaryotik çeviri başlatılması faktör 4 gamma, PABP; poliA bağlayıcı protein, eIF4A: ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4 alfa, SBP-eIF4e; ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E bağlayıcı; ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E ile kaynaşmış, 4EBPs streptavidin bağlayıcı peptid içeren kalan TAP yem protein proteinler, eIF4eNiF1l ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E nükleer ithalat faktör 1, SKB; TEV Birleşmemiş TAP peptid kalan streptavidin bağlayıcı peptid.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada gösterilen TAP etiketleme tekniği ökaryotik hücrelere in yem proteinlerinin bağlama ortaklarına izole etmek için bir çok özel ve sıkı bir yöntemi göstermektedir. Bu yaklaşım, hücre ve virüs proteinleri hem de uygulanabilir. Bildiğimiz kadarıyla, bu tür bir teknik çeviri başlatma faktörü eIF4E uygulanmış ilk kez. Bu tekniği kullanarak bilinen eIF4E bağlayıcı proteinlerin eIF4G ve 4EBPs belirlenmesi böyle bir yaklaşımın geçerliliğini onaylar. Buna ek olarak, eIF4F kompleksinin kalan bileşeninin tanımlama, yani eIF4A ve PABP dolaylı etkileşimi ve üçüncül kompleksleri saflaştırma işlemi sırasında olduğu gibi kalır olduğunu onaylar. Kanonik eIF4e bağlayıcı proteinlerin birden izoformlarının tanımlama da belli oluyordu. Bu, Şekil 2&#39;de daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Yaklaşımın sınırlamaları ile ilgili olarak, belirli bakım seçimi ile ilgili olarak alınması gerekenyem protein ve N-veya C-terminusta TAG etiketi yerleştirmek için olsun veya olmasın. Bu işlevsel bir test yapmak veya etiketli türevi işlevsel olmasını sağlamak için önce tam ölçekli arıtma için mikroskop ile füzyon proteini lokalizasyonu incelemek için tavsiye edilebilir. İntegral membran veya nükleer proteinlerin mutlaka lizis adımda açıklanan nispeten hafif bir deterjan koşulları tarafından serbest olabilir. Tüm imüno ve benzeri açılan testleri olduğu gibi, değişiklikler lizis verimliliğini artırmak için lizis tamponunda doğa ve deterjan konsantrasyonları için yapılamadı. Lisisi ve yıkama tamponların iyonik konsantrasyonu da saflaştırılması sıkılığına arttırmak veya azaltmak için tadil edilebilecektir. Bu standart ılımlı koşullar (yukarıda anlatılan) altında başlangıç ​​saflaştırma gerçekleştirmek de mümkündür, ancak daha sonra daha sonra artan iyonik Con altında yıkanabilir 4-5 kısma streptavidin boncuklar (bölüm 5.8), bölmekditions. Bu, kullanıcının spesifik olmayan etkileşim proteinler kaldırmak optimal koşulları tanımlamak için etkinleştirebilirsiniz. Tüm süreç de geçici etkileşen ortaklarına bilinmektedir ve bunu takip eden transfeksiyon Western blot ile belirlenir, sadece kendi varlığı ya da yokluğu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu durumda her plazmid ifade 8 mikrogram ile transfekte hücreler iki 100cm 2 yemekleri öneririm. Bilinen bağlayıcı ortakları ile etkileşim TAP-füzyon proteininin mutant türevlerinin yeteneğini incelerken Bu modifiye işlemi özel kullanım olduğu. Gümüş lekeli SDS-PAGE jel (ya da western blot tarafından bir antikor varsa) 8 ile örnek 1 incelendiğinde giderme mükemmel bir yoldur, teknik kabul edilebilir sonuçlar üretmek için başarısız. Her yakınlık tabanlı yağış ve özel yıkama etkinliği bu sistematik örnekleme yöntemi kullanılarak analiz edilebilir. Örnekleri 8-1 Optim sırasında alınmalıdırher yeni yem için protokol yatış gerçekleşmedi. TAP etiketleme tekniği gibi GST gibi diğer yaklaşımlar pull-çıkışlar, vb çift afinite saflaştırma ve belirli elüsyon adımlar (TEV bölünme ve biyotin elüsyon) bir tutulmaları özgüllük ve sıkılığı sağlayacak maya iki hibrid testleri için güçlü ve sağlam bir alternatif sunuyor saflaştırma prosedürü boyunca yüksek düzeyde. Kritik Bu tekniğin bir protein için uygulanabilir ve bu nedenle bir ilgi proteinin hedef için bağlayıcı ortaklarına belirlenmesi için mükemmel bir yöntemi göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Higromisin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> Tavşan IgG Agaroz </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV Proteaz </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> ULTRALINK Streptavidin Plus, boncuk İmmobilize </td><td> Delmek </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 santrifüj konsantratör (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest gümüş boyama seti </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Kolloidal Mavi Coomassie boyama seti </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml prelubricated tüpler</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Pipet uçları Microcapillary </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage% 4-12 Bis-Tris degrade jeller </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CDCh 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5x SDS Örnek Tampon </td><td> Balıkçı </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

Host ve viral proteinlerin işlevlerini anlamada kritik ve genellikle sınırlayıcı aşama hücresel veya viral proteini ortaklarına etkileşen tanımlanmasıdır. Etkileşen maya da dahil olmak üzere iki hibrid sistemi ortak, yanı sıra, rekombinant proteinlerin ve kütle spektrometrisi tanımlama 1 takiben endojen proteinlerin immünopresipitasyon kullanılarak deneyleri aşağı doğru tanımlanması sağlayan birçok yaklaşım vardır. Son çalışmalar etkileşen proteinlerin tanımlanmasında iki özel elüsyon adımlar ile birleştiğinde çift afinite etiketi aracılı arınma programı, sermiştir. Bu yaklaşım olarak adlandırılan Tandem Affinity Arıtma (TAP), başlangıçta maya 2,3 kullanılmıştır ama son zamanlarda memeli hücrelerinde 4-8 kullanmak için adapte edilmiştir. Proof-of-concept olarak, iyi karakterize ökaryotik çeviri inisiyasyon fac kullanarak bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi kurduktor eIF4E 9,10. hücresel çeviri faktörü eIF4E kap-bağımlı çeviri inisiyasyon 10 dahil hücresel eIF4F karmaşık kritik bir bileşenidir. Mevcut çalışmada kullanılan TAP etiketi iki Protein G birimlerden oluşur ve bir streptavidin bağlayıcı peptid Bir Tütün Etch Virüsü (TEV) proteaz bölünme sırası ile ayrılır. Mevcut çalışmada kullanılan TAP etiketi iki Protein G birimlerden oluşur ve bir streptavidin bağlayıcı peptid Bir Tütün Etch Virüsü ile ayrılmış (TEV) proteaz bölünme sırası 8 edilir. Klonal hücre serilerinin jenere edilmesi için ihtiyacı forgo için, pMEP4 (Invitrogen) dayalı bir episomally muhafaza edilen plasmidin TAP-etiketli yem proteininin ifadesi dayanır hızlı bir sistemi geliştirilmiştir. Bu plazmid etiketli fare eIF4E İfadesi kadmiyum klorür indüklenebilir Metallothionein organizatörü kullanılarak kontrol edildi. R bağlama aracılığıyla ifade eden hücrelerin ve müteakip afinite saflaştırma lizisabbit IgG agaroz, TEV proteaz bölünme, streptavidin bağlantılı agaroz bağlanarak ve (yalnız TAP etiketi ifade hücre hatları kontrol grubuna kıyasla) daha sonra biotin elüsyon açılan eIF4E görünüşte bir çok özel proteinler tanımlanmıştır. Proteinlerin kimlikleri 1D SDS-PAGE ve müteakip tandem kütle spektrometrisi ile bantları çıkarılması ile elde edilmiştir. Tanımlanan bileşenler bilinen eIF4E bağlayıcı eIF4G proteinleri ve 4EBP-1 dahildir. Buna ek olarak, eIF4F kompleksinin, diğer bileşenler, eIF4E bir bileşeni ve eIF4A Poli-A bağlayıcı protein, yani belirlendi olduğu. Bilinen doğrudan bağlayıcı ortak yanı sıra ikincil etkileşen proteinler, sadece tanımlamak için yeteneği fazla işlevi bilinmeyen proteinlerin karakterizasyonu bu yaklaşımın yarar vurgulamaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification at JoVE.com

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

37.3K Görüntüleme.  Imperial College London. Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Video: Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-His saflaştırma: Tam boy Saflaştırılmış Proteinler Verim iki aşamalı bir saflaştırma protokolü Affinity

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...