Name: production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D at JoVE.com

Yazarlar T. Palmer teşekkür ve H. Şekil 4 fare NPCs. vektör sanat sağlamak için Babu (Stanford Nöroşirürji) kullanılmış ve sunucusu tıbbi Sanat altında Creative Commons Attribution 3,0 dağıtıma açıktır Lisansı (https://creativecommons.org/ uyarlanmıştır licenses/by/3.0/legalcode). Bu eser parçası, Stanford Nano paylaşılan özellikleri (Ödülü ECCS-1542152 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen SNSF), gerçekleştirildi. Üssü destek üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri (32 GM 008412) olarak kabul eder. C.M.M. bir NIH NRSA desteğinden önceden Doktora Bursu (F31 EB020502) ve Siebel akademisyenler Program kabul eder. S.C.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (U19 AI116484 ve R21 EB018407), Ulusal Bilim Vakfı (DMR 1508006) ve California Institute desteği rejeneratif tıp (RT3-07948) kabul eder. Bu araştırma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T), fon aldı Nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB) Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında Sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri görüşlerini temsil etmiyor.

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+Cell-Matrix+Adhesions+to+the+Third+Dimension.">Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+perturbation+in+vitro-A+growing+case+for+three-dimensional+(3D)+culture+systems.">Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expression+of+differentiated+functions+in+hepatocytes+cultured+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix.</a> Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+opens+new+dimensions+in+cell-based+assays.">3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays.</a> Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).</li><li>Caliari, S. R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+hydrogels+for+cell+culture.">A practical guide to hydrogels for cell culture.</a> Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Madl, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+neural+progenitor+cell+stemness+in+3D+hydrogels+requires+matrix+remodelling.">Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling.</a> Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).</li><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li><li>Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+Regulates+Fate+Decisions+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells.</a> PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).</li><li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+Role+of+Matrix+Stiffness+in+3D+Cell+Migration+and+Remodeling.">Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling.</a> Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).</li><li>Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+osteogenic+and+myogenic+differentiation+of+MSCs:+interplay+of+stiffness+and+adhesive+ligand+presentation.">Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).</li><li>Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+three-dimensional+engineered+protein+hydrogels+for+tailored+control+of+neurite+growth.">Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth.</a> Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).</li><li>Kilian, K. A., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Stem+Cell+Fate+by+Controlling+the+Affinity+and+Density+of+Ligand-Receptor+Interactions+at+the+Biomaterials+Interface.">Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+A+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Materials+through+Modular+Protein+Engineering.">Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering.</a> Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).</li><li>Meyer, D. E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+proteins+by+fusion+with+thermally-responsive+polypeptides.">Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides.</a> Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).</li><li>Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+and+characterization+of+elastin-like+polypeptides+(ELPs)+with+variable+guest+residues.">Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues.</a> Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).</li><li>McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Topographic+Imaging+of+Environmentally+Responsive,+Elastin-Mimetic+Hydrogels.">High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels.</a> Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).</li><li>McMillan, R. A., Conticello, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+Elastin-Mimetic+Protein+Gels+Derived+from+a+Well-Defined+Polypeptide+Precursor.">Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor.</a> Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).</li><li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrakis(hydroxymethyl)+Phosphonium+Chloride+as+a+Covalent+Cross-Linking+Agent+for+Cell+Encapsulation+within+Protein-Based+Hydrogels.">Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).</li><li>Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+RGD+ligand+density+and+L1CAM-mediated+Schwann+cell+interactions+synergistically+enhance+neurite+outgrowth.">Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth.</a> Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).</li><li>Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradation+of+elastin-like+polypeptide+nanoparticles.">Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles.</a> Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).</li><li>Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+elastin-like+polypeptides+in+tissue+engineering.">Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).</li><li>Madl, C. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine-Selective+Functionalization+for+Bio-Orthogonal+Cross-Linking+of+Engineered+Protein+Hydrogels.">Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).</li><li>Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-like+protein-hyaluronic+acid+(ELP-HA)+hydrogels+with+decoupled+mechanical+and+biochemical+cues+for+cartilage+regeneration.">Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration.</a> Biomaterials. , 132-140 (2017).</li><li>Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Orthogonally+Crosslinked,+Engineered+Protein+Hydrogels+with+Tunable+Mechanics+and+Biochemistry+for+Cell+Encapsulation.">Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation.</a> Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).</li><li>Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+elastin-like+polypeptide+hydrogels+with+grafted+VEGF-mimetic+peptides.">One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides.</a> Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).</li><li>Straley, K. S., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+tuning+of+multiple+biomaterial+properties+using+protein+engineering.">Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering.</a> Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).</li><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli.">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li><li>Graumann, K., Premstaller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+of+recombinant+therapeutic+proteins+in+microbial+systems.">Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems.</a> Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).</li><li>Tashiro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Synthetic+Peptide+Containing+the+IKVAV+Sequence+from+the+A+Chain+of+Laminin+Mediates+Cell+Attachment,+Migration,+and+Neurite+Outgrowth.">A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Rekombinant protein ifade ve arıtma ile yüksek tekrarlanabilirlik Biyomalzeme sentezlemek için güçlü bir araç var. Ticari moleküler klonlama advent büyük ölçüde nedeniyle, özel rekombinant plazmid birkaç terdarikçilerin ELPs gibi malzemeler ile çalışmak için zaman önemli ölçüde küçültür satın alınabilir. Benzer şekilde, plazmid doğrudan kaynak laboratuvardan ne zaman orijinal çalışma bir federal anlaşma tarafından desteklenen ve gelecekteki iş kar amacı gütmeyen kullanım için olacak istenebilir. Tam ELP amino asit dizisi daha önce birkaç ELP türevleri31için yayınladı. Ancak, ifade işlemi rekombinant proteinlerin nihai arıtma için genellikle düşük verimleri veya daha düşük kaliteli bir ürün yol açabilir kritik adımlar bir dizi içerir. ELP kursları en yaygın sorunlardan bazıları aşağıdakilerden birini ortaya çıkar: (1) saklı bakteriyel stokları kalitesini, (2 ilk donma-çözülme döngüsü bakteriyel membran ve termal aracılığıyla (3) protein saflaştırma bozmaya.
Biz biyolojik makine polimerler sentezlemek için rekombinant ana yararlanarak protein ifade ve malzemeleri üreten diğer biyolojik olmayan araçlarla arasında büyük bir fark olduğunu. Daha sonra bu teknik bir benzersiz sınırlama ile gelir: hücresel ölüm ya da zarar. Hücre ölümü en çok bakteri kolonileri azaltılmış bir dizi olarak bir tabak ya da nispeten yavaş yavaş büyümeye anormal derecede küçük koloniler çizgiler sonra ortaya çıkmaktadır. Bakteriyel hisse senetleri, dikkatli bir şekilde muhafaza Eğer yıl boyunca kararlı kalabilir; Ancak, art arda gelen donma-çözülme döngüsü tekrarlanan kullanımı ya da dondurucu hatası nedeniyle hücre canlılığı azaltmak veya DNA hasara yol. Tipik BL21 bakteri stokları askıya alınan hücrelerle karışık hacmen % 10 ve % 40 gliserol arasında kullanın. Gliserol membran zarar donma sırasında buz kristalleri nucleating azaltmak için amaçtır. Bu nedenle, düşük konsantrasyonlarda kullanarak (< % 10) daha yüksek konsantrasyonlarda sırasında güvenliği aşılan bir membran yol açabilir (> % 40) yeterince için nerede hisse senedi donuyor hiç hücre ölümü için önde gelen donma noktası önleyebilirsiniz. Ancak, en iyi gliserol seviyede bile, bakteriyel hisse senetleri için tamamen yeniden donma ve sitotoksik etkilerinden gliserol membran hasarı birleşimidir yol açabilir gibi tezcan hisse senedi canlılığı ve DNA hasarı azaltmak izin verilmemelidir. Bu bakteriyel bir hisse senedi bir düşük koloni sayımı sonuçları veya hücre sürekli olarak yavaş bir hızda (yavaş OD600 rampa oranı ifade sırasında tecelli) bölünmesi görülmektedir, bu nedenle, plazmid yeniden dönüştürme ve yeni bir stok yapma basit bir ise Bu sorunu gidermek için ilk yaklaşım. Bunu aklýnýzda tutarak, bakteriyel hisse senetleri uzun vadeli bakım ve DNA, bütünlüğünü sağlamak için bu saf DNA su ve hücre içinde donmuş olarak, plazmid kopyalarını depolamak en iyisidir. Bu şekilde DNA depolamak başarısız hisse senedi veya dondurucu başarısızlık gibi beklenmedik olaylar, dönüşüm için orijinal DNA'ın güvenilir bir kaynak kullanılabilir sağlayacaktır.
Başka bir kritik ELP imalat ifade ana hedef protein saflaştırma adımdır. E. coli çıkarma protein daha fazla ardışık donma-çözülme çevrimleri ile bileşik olduğunu askıya alınan hücre dondurma üzerine, lysate boyunca formu nucleating buz kristalleri kullanarak hücre duvarı kırarak elde edilir. Hücre duvarı parçalanma için alternatif yöntemler sonication veya bir basın gibi yararlı olabilir. Sadece bir dondurucu ve diğer özel ekipman gerektirir gibi özellikle, lysate, üst üste dondurma çözdürme avantajlıdır. Ancak, bu yordamı nonspecifically DNA, RNA ve protein kirleticiler, hedef protein bozulmasına yol açar potansiyeline sahip proteaz yanı sıra serbest bırakır. Bu nedenle, için kirlenmesini önlemek ve verim, ben (DNaz) ve phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) hücre DNA aşağılamak ve proteaz, sırasıyla inhibe lysate eklenir deoksiribonükleaz azaltılmış. DNA'ın varlığını DNaz eklenmesi önce görsel olarak yeniden askıya alınan hücre boyunca 'kılçıklı' bir görünüm olarak ilk tezcan takip lysate görülebilmektedir. DNaz aktif olarak bu DNA'yı düşürür ve böylece viskozite Santrifüjü arındırmak daha kolay hale lysate hücrenin azaltır. DNA'ın en iyi bozulmak görsel olarak hücre lysate tamamen sıvı gibi görünüyor ve lifli görünüm artık görünür olduğundan emin olarak onaylanabilir. Biz pratikte DNaz ~0.1 mg mL hücre lysate başına eklenmesi gerekli bozulması ulaşmak için yeterli olduğunu gözlemledim. DNA varlığı hala görülmektedir, ancak, daha fazla DNaz takip ajitasyon an munzam iki ya da üç saat tarafından eklenebilir. Herhangi bir lysate olmuştur önce yeterince çözülme potansiyeline DNaz zamanından önce eklenirse, benzer bir sorunu da ortaya çıkabilir. Bu durumda, daha soğuk sıcaklıklarda DNA bozulması nedeniyle DNaz erken inactivation verimliliğini sınırlayabilirsiniz. Bu sorunu önlemek için bu kez yaklaşık 8 saat önce DNaz tedaviyle çözülme yeniden askıya alınmış Pelet izin vermek için en iyi yöntem var. Buna ek olarak, düşük protein verimleri bildirilir ve DNA dökümünü yeterli oldu, daha fazla potansiyel protein yıkımı proteaz üzerinden azaltmaya yardımcı olmak için daha fazla PMSF eklenmesi gerekli olabilir.
ELPs en iyi ifade sağlamak için dikkat edilecek diğer noktalar faydaları dikkatli bir anlayış ve seçilmiş bir antibiyotik sınırlamaları içerir. Burada, ampisilin direnç geni içeren pET15b vektörler için protein ifadesi kullanıldı. İşlevsel olarak, evde beslenen hayvan vektör serisi kadar %50 ile önemli protein ifadesidir bir başarılı indüksiyon32,33takip hedef protein adanmış bir bakteri'nın protein ifade sağlar. Ancak, Obama seçim antibiyotik olarak en iyi ifade ile girişime neden olabilir bazı sınırlamalarla birlikte gelir. İlk olarak, ampisilin E. coli huzurunda bozulma hızla beta-lactamase yayın nedeniyle oluşabilir. Ampisilin yeterli miktarda bozulmuş, ampisilin kodlama plazmid (yani ELP kodlama plazmid) tamamen kaybolabilir. Sonuç olarak, ELPs daha uzun süreler için ifade edilirken, protein ifade düzeyleri dikkatle her başarılı zaman noktalarda arzu ifade için izin vermek için yeterli miktarda ELP kodlama gen kalır emin olmak için takip edilmelidir. Beta-laktamaz birikimini sorun giderme için olası yöntemleri starter kültür iplik ve ifade orta aşı önce Orta antibiyotik içermeyen hücreleri yeniden askıya alma içerir. Bu işlem etkin antibiyotik aşağılayıcı enzim devrinin sınırlar ve daha büyük bir bölümünü sağlar hedef protein kodlama vektör hücre içeriyor. Ayrıca, ampisilin yaklaşık 2-3 hafta sınırlı bir raf ömrü vardır. Bu nedenle, kültür plakaları protein ifade için en fazla iki hafta kullanmadan önce 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Son olarak, ampisilin starter ve ifade medya, ampisilin hisse senedi çözüm içinde etkinliği sağlamak için olmak üretilen taze hemen kullanmadan önce uzun süreli depolama için daha az etkili bir antibiyotik neden olabilir gibi.
Bir LCST varlığı ELPs basit arıtma termal aracılığıyla sağlar. Özellikle, daha yüksek bir sıcaklıkta ve tuzları huzurunda, Entropik kuvvetleri ELPs daha az çözünür hale ve daha sonra bir polimer zengini coacervate faz oluşturmak neden. Öte yandan, daha düşük sıcaklıklarda ELPs çözünür kalır ve çözüm içine kolayca çözülür. Toplamak ve ELP içeren faz sırayla atmak için Santrifüjü adımları ile birleştiğinde bu iki sıcaklık rejimleri arasında bisiklet protein konsantreleri ve aynı anda ELP olmayan kirletici varlığı azaltır.
Ancak, nerede ELPs bu arıtma işleminde kayıp olabilir aşamaları bir dizi vardır. İlk olarak, soğuk her spin öncesinde protein içeren çözüm pH 9.0 için alkalized. Bu daha yüksek pH deprotonate için hizmet etkili onları dolu bir durumda bırakarak ve daha fazla kendi çözünürlük geliştirme protein omurga üzerindeki belirli amino asitler. Sigara çözündürüldükten proteinler olması sırasında Santrifüjü pelleted atılır gibi ve sonuç olarak, bu adım yukarıda veya protein dağılması için yeterli zaman izin vermiyor verim bir azalma yol açabilir.
Benzer şekilde, ne zaman seminerine pelleted, sıcak spin işlemi sırasında hedef proteinler kaybolmuş olabilir. Başlangıçta, NaCl seminerine çözünürlük azaltmaya protein açısından zengin süpernatant için eklenir. Tuzları neden sulu faz ayırmak protein protein ve su molekülleri arasındaki elektrostatik etkileşimler kalkan çalışmak. Bu etki, Entropik etkileri nedeniyle daha fazla ELPs çevreleyen sulandırılmışperklorid 'kafes' tatili ve proteinlerin toplama zorlar çözüm Isıtma tarafından güçlendirilmiş. Düşük protein konsantrasyonlarda (i.e., ilk termal döngüsü), tuzları yalnız eklenmesi sık sık bu aşama ayrılık neden için yeterli değil. Ancak, protein konsantrasyonu artırır (i.e., daha sonra ısı devir) ve orada tuzları ile etkileşim daha az ikincil kirleticiler, ELP daha kolay çökelti. Tuzları çok hızlı bir şekilde eklenirse, sonuç olarak, onlar fiziksel olarak proteinler, toplayarak tarafından hangi etkili çözüm tuz konsantrasyonu azaltır ve daha fazla protein yağış sınırlar tuzak haline. Böylece, tuz homojen çözüm dağıtmak için yeterli zaman sahip emin olmak için üç küçük gruplar halinde eklenmelidir. Son bir not olarak Konuk kalıntı değişiklikler elastin benzeri bölgesinin çeşitlemeleri ELP omurgasına, yoluyla daha ya da biyo-aktif bölgesine değişikliklerin önemli ölçüde LCST davranışını etkileyebilir. Sonuç olarak, protein çeşitleri arasında en iyi protein verim sağlamak için bu pH, tuz konsantrasyonu ve tuz türü optimize etmek önemlidir (Örn., monovalent veya divalent) sıcak ve soğuk spin için.
Gibi kolayca önemli bir ELP kayıp herhangi bir arıtma adım sırasında oluşup oluşmayacağını belirlemek için kullanılabilir SDS-sayfa iletişim kuralı tamamlandıktan sonra çalışan öneririz. ELP sıcak bir spin takip süpernatant içinde tespit edilirse, kısaca, sonra protein etkili çöktürülmüş değil. ELPs çözündürüldükten Pelet soğuk bir spin aşağıdaki örnekte tanımlanan, benzer şekilde, sonra protein etkili bir şekilde feshedilmiştir değil.
ELP hydrogels sentetik veya doğal olarak elde edilen malzemeler birçok avantajlar sunuyor. Özellikle, Amin-reaktif crosslinker THPC kullanımı protein crosslinking ucuz, basit ve akort mekanizmasının affords. Ancak, unutulmamalıdır crosslinking iletişim kuralına farklı sınırlamalar vardır. THPC oksijen hassas olduğunu ve uygun olmayan koşullarda depolanmış olsa, hızlı bir şekilde tepki verimliliği bozulabilir. Buna ek olarak, Birincil aminler ile onun reaktivite nedeniyle THPC aminler içinde zengin proteinler medya veya hücre yüzeyinde çevreleyen ile tepki. Bu nedenle, ELP hydrogels oluşturan, bu mümkün eksojen protein olan ve bu nedenle, bir azalma crosslinking etkinliğini azaltmak için hücre Pelet ile medya kirlenmesini önlemek için önerilir. Son olarak, bu crosslinking mekanizma yok lizin kalıntılar içeren biyo-aktif bölge dizisine önler ve böylece, bazı hücre yapışkanlı motifler potansiyel tümleştirme sınırlar (Örn., IKVAV34). Bu sınırlamalar, değişiklikleri adrese ELP omurgasına azid ve bicyclononyne (BCN) ile reaksiyon ortaklarının verir yukarıda açıklanan27olarak biyo-ortogonal crosslinking için.
ELP LCST davranış hidrojel mikroyapı dikte önemli bir rol oynadığı unutulmamalıdır. LCST yukarıda sıcaklık rejimleri ELPs dışarı matris porozite etkileyebilir protein açısından zengin ve protein eksikliği aşamaları oluşumu ve matris9crosslinking verimliliği için önde gelen çözüm çökelti. ELP LCST üzerindeki fizyolojik ilgili sıcaklıklarda (~ 37 ° C) çoğu hücre kültür deneyler yaptı çünkü bu etkiler dikkate alınmalıdır. Hydrogels etkili bir şekilde crosslink ve form için bir birbirine bağlı protein ağ lizin gelen birincil Amin THPC crosslinker fiziksel olarak erişilebilir olmalıdır. ELP toplama yeterli crosslinking ulaşmadan önce ortaya çıkarsa, protein açısından zengin faz içinde sıkışıp ELPs ulaşılmaz ve böylece crosslinking içinde katılmak kurulamıyor olabilir. Bu sınırlama gidermek için bir ilk 15 dk crosslinking dönem ELP onun termal faz geçiş geçer önce hidrojel ön polietilenin sağlayan oda sıcaklığında bizim protokol gerektirir. Bu oda sıcaklığında kuluçka bir ek 15 dk kuluçka 37 ° C'de hidrojel crosslinking sonuçlandırmak için izler. Bu yordamı yeterli crosslinking ve sağlam, tekrarlanabilir jelleşme ELP malzeme için önemlidir.
Sonuç olarak, ELP kullanarak fabrikasyon Rekombinant protein hydrogels protein sıra ve bu nedenle 3D Cep microenvironment olağanüstü ayar sunuyoruz. ELP polimerler vitro ve in vivo sistemleri çok çeşitli olarak gösterilen ifade yüksek verimleri, kolayca LCST davranışlarını sayesinde, saf olmak ve biyouyumlu olmuştur. E. coli kullanımı rekombinant ana bilgisayar olarak polimer molekül ağırlığı ve fonksiyonelliği mükemmel kontrol yakınındaki açmaktadır basit ve ucuz bir yordam sağlar. Birlikte, bu teknik sağlam ayar ve tekrarlanabilirlik bırakmak için geniş bir hücre tiplerinin 3D kültür hidrojel platformu sağlar. Son olarak, bu ELP hidrojel için birçok aşağı akım biyokimyasal deneyleri qRT-PCR, Western blot, DNA ekstraksiyon ve hücre immunostaining9dahil olmak üzere mükellef bir platformdur.

Son yüzyıl içinde iki boyutlu (2D) doku kültürü temel hücre biyolojisi vitroçalışmak için ayrılmaz bir araç haline geldi. Ayrıca, 2D hücre kültürü için nispeten ucuz ve basit protokoller kabulünün için birçok biyolojik ve tıbbi disiplinler arasında açmıştır. Bununla birlikte, araştırmaları bu toplanan vivo içindegelen belirgin sapma, değerli zaman ayrılır ve fon klinik olarak odaklı araştırma1,2içinboşa olduğunu geleneksel 2D platform sonuçlara yol açabilir göstermektedir, 3. Bu tutarsızlık en uygun yayılması ve çeşitli hücre tiplerinin olgunlaşma için gerekli olabilir 2D yüzeylerde kültürlü hücrelere sağlanan yerel Biyokimya ve biyofizik cues eksikliği ilişkilendirilebilir ki biz ve diğerleri öngörmekteyiz.
Bu sınırlamalar ve yardım Köprüsü 2D arasındaki boşluğu gidermek için Gelişmiş üç boyutlu (3D) hidrojel platformlar için hücre-kapsülleme1,4,5 vitro ve in vivo çalışmalar, araştırmacılar var ,6. Hydrogels doku gibi mekanik özellikleri ve besinlerin hızlı ulaşım sağlar su şişmiş yapısı nedeniyle hücre dışı matriks (ECM) vivo endojen microenvironment özetlemek için ideal maddeler olduğunu ve sinyal7,8faktörler. Ayrıca, 3D hydrogels iskele mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin üzerinde bağımsız denetim sağlamak için tasarlanabilir. Matris mekaniği9,10,11,12 ve hücre yapışkanlı ligandlar13,14,15 hücre etkilemek için iyi bilinen davranış vitro ve içinde vivo. Böylece, ayarlanabilir özellikleri ile 3D hydrogels hücreler ve onların microenvironment arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için bir platform sunuyoruz. Bir ideal 3D hidrojel matris için ölçüt basit, Sigara sitotoksik hücre kapsülleme yanı sıra fizyolojik ilgili mekanik özelliği bağımsız ayar ve taklit eder yerel hücre yapışkanlı motifler içerir.
Her iki sentetik (Örn., Polietilen glikol, polylactic asit, poli (Glikolik asit)) ve doğal olarak elde edilen (e.g., aljinat, kollajen, Matrigel) hydrogels var avantajları 2D vitro kültür platformlarına; Ancak, aynı zamanda onların uygulanabilirliği sınırı önemli eksiklikleri var. İlk, birçok sentetik ve doğal olarak elde edilen platformlar memeli hücrelere potansiyel olarak toksik olabilir sert crosslinking koşullar gerektirir, önde gelen azalma hücre canlılığı7. Ayrıca, birçok sentetik platformlar yerli bioactivity eksikliği ve artan maliyetini ve karmaşıklığını16ekleyebilirsiniz ikincil kimyasal reaksiyonlar ile functionalized gerekir. Son olarak, doğal olarak elde edilen malzemeler genellikle iç biyo-aktif etki alanları içerir iken, onlar sık sık yüksek toplu iş toplu iş değişkenlik tarafından boğulmuş ve genellikle nispeten zayıf jelleri7,17şekillendirme için sınırlıdır.
Protein sıra üzerinde açık denetime izin vererek Rekombinant protein mühendislik malzemeleri tasarımı için benzersiz bir araç seti sunar ve uzatma tarafından son hidrojel potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin18İskele yapısı. Ayrıca, Escherichia coli (e.coliproteinler ifade etmek için) iyi bilinen biyolojik makine yararlanarak, malzemeler düşük maliyetle ve tutarlı bir şekilde sınırlı Inter - ve içi-toplu değişkenliği ile üretilmektedir. Burada sunulan elastin benzeri protein (ELP) üç mühendislik etki alanı vardır: (1) bir T7 ve His6 etiket etiketleme yoluyla fluorescently antikorlar öğesini için izin veren, elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal için izin veren (2) bir 'elastin-gibi' bölgesi Crosslinking ve (3) hücre yapışkanlı motifler için kodlar 'biyo-aktif' bölge.
Elastin benzeri bölgemizde nerede dört 'xaa' amino asit siteleri isoleucine (Ile), ama olabilir herhangi bir amino asit prolin hariç olacak şekilde kurallı (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sırasını temel alır. Bu sıra rekombinant ELPs19,20Bisiklete binme termal üzerinden basit arıtma sonrası ifade için istismar alt kritik çözüm sıcaklık (LCST) davranışı ile endows. Bu LCST özelliği termal olarak toplamak için farklı sıcaklıklarda Konuk 'Xaa' kalıntı21,22değiştirerek ayarlanabilir.
Burada, bir beş elastin benzeri tekrarlar 'Xaa' konumuna hidrojel crosslinking için kullanılmaktadır Amin sunulması (Lys) lizin amino asit ile değiştirilmiştir. Önceki çalışmalarımız sitotoksik sigara ve sağlam crosslinking Amin-reaktif crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC)23ile reaksiyonu ile göstermiştir. Değişen toplam protein içeriği ve crosslinker konsantrasyon tarafından bir fizyolojik ilgili sertlik aralığı (~0.5-50 kPa)9,23,24span için ayarlanan hydrogels üretmek edebiliyoruz. Mekanik özellikleri ayarlama ek olarak, hücre adezyon hidrojel içinde ELP protein omurga içinde kurallı hücre yapışkanlı etki alanlarının entegrasyonu kaynaklanır. Örneğin, genişletilmiş fibronektin kaynaklı 'RGDS' amino asit dizisi birleşme hücre adezyon ve şifreli, süre konformasyon esneklik sağlar bağlayıcı 'RDGS' değişken hücre-matris yapışması24kısıtlar. Hücre-Yapıştırıcı Yapıştırıcı proteinler hem de toplam protein konsantrasyonu oranını modüle tarafından biz etkili ligand konsantrasyonu geniş bir yayılma hydrogels üretmek edebiliyoruz. Sonuçta, bir hidrojel platform bağımsız olarak çeşitli hücre tiplerinin en iyi 3D kültür için ayarlanan bilgisini iletmiyor biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ile geliştirdik.
Matris sertlik ve yapışkanlı ligand ayar ek olarak, rekombinant hydrogels hücre yayılan, yayılması ve 3D içerik4 içinde geçiş için gerekli olan tasarım belirli malzeme bozulması profilleri, yeteneği teklif , 9. bu bozulma özellikle genişletilmiş 'RGDS'9 veya elastin benzeri sıra25hedef proteaz hücre salgılanmasını tarafından tanınan. ELP hydrogels hücre canlılığı ve işlev immunocytochemistry yanı sıra DNA/RNA/protein ayıklama nicel reverse için de dahil olmak üzere eğitim için gerekli olan sonraki biyokimyasal testleri desteklemek için de gösterilmiş olan Transkripsiyon-polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve Western blot9. ELP türevleri de vivo içinde modeller bir dizi kullandık ve bağışıklık sistemi26tarafından iyi tolere bilinmektedir.
Hücre-kapsülleme çalışmaları için malzeme bir platform çok çeşitli yararları genellikle Biyokimya ve biyofizik ayar aynı derecede eksikliği sentetik veya doğal olarak elde edilen malzeme platformları için karşılaştırıldığında sahiptir olarak birlikte, ELP alınan ve tekrarlanabilirlik. Ayrıca, ELP'ın basit ve sitotoksik sigara kullanımı ile çok çeşitli hücre tiplerinin (Örn., piliç dorsal kök gangliyon14,24, fare nöral progenitör hücre9, insan mezenkimal kök hücrelerin27, sığır Yenidoğan kondrosit28, insan endotel hücreleri29,30) 2D hücre kültürü için karşılaştırıldığında endojen 3D ECM daha fizyolojik ilgili bir model sağlar. Burada, biz recombinantly türetilmiş bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut, kapsülleme ELPs tunable hidrojel platformu olarak kullanmak için 3D hücre. Biz daha fazla metodoloji ve kapsüllenmiş hücre confocal mikroskobu aşağı akışı floresan etiketleme için mevcut.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Elastin-Like Protein Expression and Purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-18-0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt, dihydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195381</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter Unit (0.22 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m syringe filters</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm thick silicone sheet</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture plates&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Biopsy Punch (2 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Biopsy Punch (4 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Biopsy Punch (5 mm)</td><td>Integra Miltex</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline (DPBS)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 12 mm glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Nestin Primary Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Sox2 Primary Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Hardset Mounting Medium&amp;nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

production of elastin-like protein hydrogels for encapsulation and immunostaining of cells in 3d

İki boyutlu (2D) doku kültürü teknikleri temel hücre biyoloji anlayışımız için gerekli olmuştur. Ancak, geleneksel 2B doku kültürü sistemleri olmaması önemli bir sonuçlanan bir üç boyutlu (3D) matris kesin-den sonuçlanmak arada toplanan vitro ve içinde vivo. Bu sınırlamaya yönelik olarak, araştırmacılar-si mühendislik in vivo hücre microenvironment Biyokimya ve biyofizik özelliklerini taklit edebilirsiniz 3D hidrojel doku kültürü platformlar. Bu araştırma gerek 3D hücre saklama ve aşağı akım biyokimyasal testleri destek malzeme platformlar geliştirmek için motive vardır. Rekombinant protein mühendisliği protein sıra ayrıntılı denetim için izin vererek ve bu nedenle, dolayısıyla, sonuç potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin 3D hidrojel malzemesi tasarım ve geliştirme için benzersiz bir araç seti sunar matris. Burada, bağımsız olarak ayarlanabilir mekanik özellikleri ve hücre yapışkanlı ligand konsantrasyonu ile form hydrogels için kullanılan recombinantly türetilmiş elastin benzeri protein (ELP), bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde için bir metodoloji sunmak ve sonraki immünfloresan boyama, hücreleri aşağı akım Analizi ve miktar için gömülü.

Bu protokol için kullanılan ELPs beş bölgelerinde oluşmaktadır: T7 etiketi, His6 etiketi, enterokinase (EK) bölünme sitesi, biyo-aktif bölge ve elastin benzeri bölge (Şekil 1). T7 ve His6 Etiketler standart Western blot teknikleri ile kolay tanımlanması için izin verir. EK bölünme sitenin giriş gerekirse etiket bölge enzimatik kaldırılması için izin verir. Biyo-aktif bölge genişletilmiş, fibronektin türetilmiş hücre-yapıştırıcı ('RGDS') veya non-yapıştırıcı ('RDGS') dizileri için kodlar. Son olarak, elastin benzeri bölge merkezi tekrarı kanat tekrarlar bir LCST ~ 32 ° C31ulaşmak için isoleucine içerirken crosslinking üzerinden THPC sağlayan Konuk kalıntı sitesinde lizin grubunu içerir.
Yazı ifade, SDS-sayfa veya Western blot molekül ağırlığı görselleştirmek ve T7 (MASMTGGQQMG) veya His6 (HHHHHH) (Şekil 2) gibi antikor Etiketler içeren ELPs kimliğini onaylamak için kullanılabilir. Başarılı ifade kontrollü şartlar altında yaklaşık molekül ağırlığı (~ 37 kDa) adlı tek bir karanlık bant varlığı gösterdiği son derece homojen bir ürün her iki SDS-sayfa (Şekil 2A) kullanarak bu proteinlerin verir ve Western blot) Şekil 2B).
Kontrolsüz şartlarda bir Western blot üzerinde düşük moleküler ağırlıklı bandından varlığı bazı proteinler kısmını değil tamamen çevrildi ve/veya ifade (Şekil 2C) sonra bozulmuş olduğunu göstermektedir. Özellikle, burada kitleler tarafından yaklaşık ağırlığı bir biyo-aktif bölge ve üç elastin gibi bölgeler (bir ' tekrar'), veya yaklaşık dördüncü hedef protein karşılık gelen ~ 9 kDa eşit aralıklandırılmış. Bu küçük protein parçaları ifade daha yüksek bir sıcaklıkta işlenirken genellikle mevcut (> 32 ° C) Şekil 2Colduğu gibi. Bu daha düşük moleküler ağırlıklı proteinler varlığı öngörülemeyen mekanik özellikleri için yol açabilir. Böylece, düzenli posta ifade eleme yüksek kaliteli nihai ürün sağlamak için önerilir.
ELP tabanlı hydrogels mekanik sertlik ELP konsantrasyon veya THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler oranını işleyerek değiştirilebilir. Aynı anda, hücre yapışkanlı ligandlar konsantrasyonu ELP değişik hücre-yapıştırıcı (RGDS) ile oranını değiştirerek yapışkan olmayan (RDGS) sıralarını herhangi bir sertlik rejimi içinde ayarlanabilir. Bu iki değişken manipüle ederek, mekanik özellikleri ve ligand konsantrasyonu (Şekil 3) bir spektrum var jelleri üretebilir.
3D ELP hydrogels hücrelerde kapsüllemek için hücreler için istediğiniz sayıyı ortamda askıya ve hücre Pelet (Şekil 4A) üretmek için centrifuged. Orta tüm tüpünden Aspire ve istenen konsantrasyon ELP çözüm aynı şekilde yeniden askıya alınmış hücrelerdir. Daha sonra THPC çözüm için hücre/ELP süspansiyon eklenir ve homojen bir karışım oluşturmak için iyice pipetted. Bu çözüm hızlı bir şekilde steril Silikon kalıplar içinde bir pipet kullanarak bir 24-şey plaka aktarılır ve crosslink oda sıcaklığında ve 37 ° C 15 dakika her (Şekil 4B) izin. Son olarak, orta iyi plakasına eklenir ve deneyinde 37 ° C'de inkübe.
Boyama canlı/ölü hücre canlılığı ve başarılı hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde değerlendirmek için kullanılabilir. Şekil 5' te gösterildiği gibi yetişkin fare nöral progenitör hücre (NPCs) yüksek hücre canlılığı üzerinde 7 gün içinde % 3 (w/v) ELP hidrojel göster.
3D ELP hydrogels daha önce gösterilmiştir NPC kök bakım kurallı NPC protein işaretleri SRY (bölge Y belirleme seks) ifade aracılığıyla ölçülen desteklemek için-kutu 2 (Sox2) ve testin9. NPCs %3 (w/v) ELP hydrogels düşük THPC crosslinking Haritayı yüksek ifade lokalize nükleer Sox2 ve sitoplazmik testin filamentler yolu ile immunostaining ve confocal görüntüleme (Şekil 6) ile kapsüllenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig1.jpg"> Resim 1 : ELP ve karşılık gelen amino asit dizileri şematik gösterimi. Bu çalışmada kullanılan ELP antikor tabanlı görüntüleme, biyoaktif bir bölge için giriş hücre yapışkanlı etki alanlarının ve elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal çapraz için izin veren bir elastin benzeri bölge T7 ve His6 etiket içerir. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig2.jpg"> Resim 2 : Hedef protein ifadesi SDS-sayfa ve Western blot ile molekül ağırlığı ve nihai lyophilized ürün kimliğini onaylamak için doğrulanmış. Saf tam uzunlukta ELP çalışır 6 (HHHHHH) etiket SDS-sayfa (A) ve Western blot T7 (MASMTGGQQMG) veya histidin kullanarak tarafından belirlendiği şekilde 37 kDa bir molekül ağırlığı (B). (C). ELP saf olmayan toplu işlemleri ELP ifade protokolündeki sapmalar nedeniyle ELPs ifadesiyle daha düşük moleküler ağırlık yol açabilir. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig3.jpg"> Şekil 3: RGDS ligand içeriği bağımsız olarak ELP hydrogels içinde mekanik özelliklerindeki ayarlanmış. %5 (w/v) ve % 3 (w/v) ELP hydrogels var kesme dönmeler ~ 800 Pa ve ~ 400 Pa, anılan sıraya göre. Hydrogels THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler 1:1 oranında çapraz 15dk 37 ° C'ye ısıtılmış için oda sıcaklığında vardı ve 5 dk önce ölçüm için equilibrate için izin. Ortalama ± s.d., *p bilgilerse < 0,001. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig4.jpg"> Şekil 4: Şematik ELP hydrogels hücre kapsüllemenin. (A). hücreleri tek hücre süspansiyon orta ve pelleted santrifüj kullanarak içine başlangıçta ayrışmış. Orta tüm tüpünden Aspire ve hücreleri istenilen konsantrasyon, ELP çözümde yeniden askıya ve de karışık. Son olarak, THPC crosslinking çözüm eklenir ve de karışık. (B). THPC eklenmesi hemen ardından, çözüm bir pipet ile bir silikon kalıp içine atıldı. Çözüm için oda sıcaklığında crosslink 15dk 37 ° C'de ikinci bir 15 dk kuluçka takip için izin verilir Orta daha sonra kültür için de deneme süresi için eklenir. <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig5.jpg"> Şekil 5: Nöral progenitör hücre korumak yüksek canlılık ELP hydrogels. Temsili resim nöral progenitör hücre kültüründe 7 gün sonra hydrogels 1:1 crosslinking (THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler) ile %3 (w/v) ELP kapsüllü. Yeşil: Canlı Boyama (calcein-AM); Kırmızı: ölü (etidyum homodimer) boyama. Ölçek çubuğu 100 µm =.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57739/57739fig6.jpg"> Şekil 6 : 3D ELP hydrogels nöral progenitör hücre kök maker ifade destek. Ayirt görüntü Sox2 ifade ve kültür ELP hydrogels 7 gün sonra proteinler testin nöral progenitör hücre. Görüntüleri %3 (w/v) ELP jelleri 0.5:1 crosslinking (THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler) ile kapsüllü hücreleri gösterir. Mavi: DAPI (çekirdek); Kırmızı: Sox2; Yeşil: testin. Ölçek çubuğu 25 µm. = <a href="/files/ftp_upload/57739/57739fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D at JoVE.com

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K Görüntüleme.  Stanford University. Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Video: Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biyokimya

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Biyomühendislik

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

Kimya

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Biyoloji

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several approaches have been developed for the preparation and use of supporting gel beds in 3D bioprinting. This paper describes a process to manufacture microgel suspensions using agarose (known as fluid gels), wherein particle formation is governed by the application of shear during gelation. Such processing produces carefully defined microstructures, with subsequent material properties that impart distinct advantages as embedding print media, both chemically and mechanically. These include behaving as viscoelastic solid-like materials at zero shear, limiting long-range diffusion, and demonstrating the characteristic shear-thinning behavior of flocculated systems. 
On the removal of shear stress, however, fluid gels have the capacity to rapidly recover their elastic properties. This lack of hysteresis is directly linked to the defined microstructures previously alluded to; because of the processing, reactive, non-gelled polymer chains at the particle interface facilitate interparticle interactions-similar to a Velcro effect. This rapid recovery of elastic properties enables bioprinting high-resolution parts from low-viscosity biomaterials, as rapid reformation of the support bed traps the bioink in situ, maintaining its shape. Furthermore, an advantage of agarose fluid gels is the asymmetric gelling/melting transitions (gelation temperature of ~30 &#176;C and melting temperature of ~90 &#176;C). This thermal hysteresis of agarose makes it possible to print and culture the bioprinted part in situ without the supporting fluid gel melting. This protocol shows how to manufacture agarose fluid gels and demonstrates their use to support the production of a range of complex hydrogel parts within suspended-layer additive manufacture (SLAM).

Shear processing during hydrogel formation results in the production of microgel suspensions that shear-thin but rapidly restructure following the removal of shear forces. Such materials have been used as a supporting matrix for bioprinting complex, cell-laden structures. Here, methods used to manufacture the supporting bed and compatible bioinks are described.

Askıda 3D biyobaskı için jelasyon sırasında kesme işlemi ile oluşturulan agaroz sıvı jelleri

The use of granular matrices to support parts during the bioprinting process was first reported by Bhattacharjee et al. in 2015, and since then, several ...

ECM Sertleşmesine Hücresel Tepkileri Araştırmak için Fototize Edilebilir Biyobaskılı Hidrojeller

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture platforms and dynamically triggering changes, such as increasing microenvironmental stiffness, enables researchers to model changes in the extracellular matrix (ECM) that occur during fibrotic disease progression. Herein, a method is presented for 3D bioprinting a phototunable hydrogel biomaterial capable of two sequential polymerization reactions within a gelatin support bath. The technique of Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting was adapted by adjusting the pH of the support bath to facilitate a Michael addition reaction. First, the bioink containing poly(ethylene glycol)-alpha methacrylate (PEG&#945;MA) was reacted off-stoichiometry with a cell-degradable crosslinker to form soft hydrogels. These soft hydrogels were later exposed to photoinitator and light to induce the homopolymerization of unreacted groups and stiffen the hydrogel. This protocol covers hydrogel synthesis, 3D bioprinting, photostiffening, and endpoint characterizations to assess fibroblast activation within 3D structures. The method presented here enables researchers to 3D bioprint a variety of materials that undergo pH-catalyzed polymerization reactions and could be implemented to engineer various models of tissue homeostasis, disease, and repair.

Yazar Spotlight: 3D Baskılı Fototable Hidrojeller Kullanarak Kronik Akciğer Hastalıklarını Anlamak 

This article describes how to 3D bioprint phototunable hydrogels to study extracellular matrix stiffening and fibroblast activation.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...