Name: engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix
Uploaded: 2016-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix at JoVE.com

Bu çalışma NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David ve Lucile Packard Vakfı, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı ve Burroughs hibe tarafından kısmen desteklenmiştir Fonu hoş geldiniz. ASP Charlotte Elizabeth Procter yüceltici Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmiştir.

Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> Insülin, 5 mg / ml çözelti hazırlamak (çözücü, 100 ml, 500 mg insülin) O dH 2 5 mM, hidroklorik asit (HCI) ile toz haline getirilmiş insülin stokları sulandırmak. Damıtılmış su, 100 ml konsantre HCI, 50 ul ekleyerek çözücü 100 ml (DH 2 O) hazırlayın. </li><li> PBS 1x solüsyon yapmak için, steril koşullar altında DH 2 O 1x, 10x, fosfat tamponlu tuz (PBS) stok çözeltisi seyreltilir. </li><li> şöyle polidimetilsiloksan (PDMS) bir elastomer çözeltisi hazırlayın: 1 (ağ: ağ) oranı, bir 10 ısıyla sertleştirme maddesi ile bir araya PDMS prepolimeri karıştırın. </li><li> aşağıda hücre kültür ortamı hazırlayın: Hazır Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı 500 ml: Besin Karışımı, F-12 (DMEM / F-12), 10, steril fetal sığır serumu ml (FBS), gentamisin reaktif 500 ul ve ek 5 mg / ml insülin, 500 ul. </li><li> (w% 1 ekleyin, 1 x PBS çözeltisi içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlamak için: BSA tozu v) çözeltisi PBS 1x ve iyice karıştırın. </li><li> ekleyin I kolajen nötralize sığır tipi bir 4 mg / ml çözelti hazırlamak için, 50 ul 10x Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) tampon maddesi, 30 ul 0.1 N sodyum hidroksit (NaOH), 30 ul hücre kültür ortamı ve hazır kollajen 400 ul soğutulmuş 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne. Yukarı ve aşağı pipetleme yavaş yavaş karıştırın; kabarcıkları almaktan kaçınması. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için, kısaca 4 ° C&#39;de karışım santrifüj. </li><li> 4 (v: v) 1 x PBS içinde% 16 paraformaldehit 1 seyrelterek bir sabitleyici çözelti hazırlayın. </li><li> 1,000 (v: v) stok çekirdekleri etiketleme çözümü 1 seyreltilmesi ile bir çekirdek etiketleme çözümü hazırlayın 1x PBS içinde. </li><li> Deterjan:% 0.3 (v v) ile 1X PBS karıştırılarak% 0.3 fosfat tamponlu tuzlu su ve deterjan (PBST) çözeltisi hazırlayın. </li><li> % 0.3 PBST: keçi serumu 01:10 (v v) seyreltilmesi ile engelleme tampon hazırlayın. </li><li> PRI seyrelterek, ilgilenilen özel bir protein için bir birincil antikor çözeltisi hazırlayın(Örneğin, tavşan anti-fokal yapışma kinaz (FAK)) Mary antikoru 1: 200 (hacim: hacim) blokaj tamponunda. </li><li> (V v) blokaj tamponunda 1.000 (örneğin, keçi anti-tavşan) 1 floresan prob ve konjüge olmamış antikor seyrelterek bir ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. </li></ol> 3D micropatterning Elastomerik Pullar 2. Hazırlık Not: Elastomerik pulları PDMS ile yapılır. <ol><li> Adım 1.3 açıklandığı gibi aynı oranda bir PDMS çözüm yapmak ve iyice karıştırın. Karıştırma işlemi sırasında oluşan olan tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için 15-30 dakika süreyle bir vakumlu odasında karışımın yerleştirin. </li><li> tekne ya da lithographically istenen geometri özellikleri ile desenli bir silikon ustası içeren Petri kabı tartın bir plastik içine Tolüen dökün. En iyi sonuçları elde etmek için, 12 saat ~ 60 ° C&#39;de PDMS çözeltisi tedavi. Not: silikon ustaları son derece özelleştirilebilir; Bu protokol 50 ölçülerinde dikdörtgen yapılar kullanırmm x 200 mm x 50 mm 200 mm aralıklı. Silikon Masters, standart fotolitografi teknikleri kullanılarak yapılabilir. Kısaca, bir epoksi-bazlı fotorezist silikon göbeğin üzerine spin-kaplanır. İstenilen damga özelliklerini ayrıntılı bir maske daha sonra UV ışığına maruz fotorezist kaplı gofret, üstüne yerleştirilir. maske tarafından bloke istenen özellikleri ışığa maruz kalır ve ışığa dirençli kaplamanın geri kalanı çözünür olduğu ve yıkanmasını edilebilir ise bu yerlerde fotorezist, çapraz bağlanmış olur. </li><li> PDMS silikon ana istenilen özelliklere etrafında tamamen donduktan sonra plastik bir kaba gelen PDMS ve master&#39;ı çıkarın. Dikkatle silikon gofret PDMS ayırmak ve temiz bir jilet kullanarak baskılı özellikleri çevresinde aşırı PDMS çıkarın. </li><li> Hemen bir jilet ile tek tek dikdörtgen pullar halinde kalıplanmış özelliklerine (~ 8 mm x 5 mm), desenli PDMS kesti. Bir cle bu özellik yan-up MağazaBir 100 mm çaplı Petri kabı. </li><li> Ayrıca, dikdörtgen pulları için destek yapmak için adım 1.3 açıklanan PDMS çözümü kullanın. </li><li> bir eğirme kaplayıcı kullanılarak, 100 mm çapında bir Petri tabağına eşit PDMS çözeltisi ~ 2-3 g yaymak ve adım 2.1 60 ° C&#39;de ~ 12 saat boyunca PDMS tedavi. Sonra, bir jilet kullanarak, dikdörtgenler içine PDMS ince bir tabaka (~ 5 mm x 2 mm) kesti. Not: İki destekler adım 2.3 yapılan her PDMS damga için gereklidir. destekleri PDMS pulları içeren 100 mm çapında Petri kabındaki saklanabilir. </li><li> PDMS pulları ve destekler hücre kültürü için kullanılmadan önce, bir biyogüvenlik kabini içinde bir aspiratör (hücre kültürü kaput) kullanılarak% 70 etanol ve kuru batırılarak sterilize edin. </li></ol> 3D Epitel Dokuların 3. hazırlanması <ol><li> Bir biyo-güvenlik kabini, her pul en PBS içinde% 1 BSA, yaklaşık 50 ul&#39;lik bir damla ekleyin. Bir mini 4 ° C&#39;de pul kaplı damlacık yerleştirin4 saat içinde anne BSA damgası yüzeyine adsorbe sağlamak. </li><li> PDMS pul aspire BSA çözüm. </li><li> Her yıkamadan sonra aspire, hücre kültür ortamı (pul her yıkama başına 50 ul yeterli olmalıdır) ile iki kez pul yüzeyleri yıkayın. </li><li> Kavisli paslanmaz çelik cımbız kullanarak sterilize PDMS pulları ve destekleri anlaştım. Her damgası PDMS için bir biyogüvenlik kabini, bir 35 mm çaplı doku kültürü çanak yatıyordu. her yemeğin, PDMS pul uzunluğu biraz daha az bir mesafe ile ayrılmış iki PDMS destekler uzandı. </li><li> cımbız kullanarak, birçok yuvarlak cam lamelleri sterilize (çapı 15 mm, # 1)% 70 etanol kullanarak PDMS pulları olduğu gibi. cımbız ile onları tutarken lamelleri fazla sıvıyı aspire. Ayrı bir 100 mm çapında Petri kabındaki yıkandı lamelleri saklayın. </li><li> ~ Kollajen karışımı 50 ul eşit kat, her yüzey damgası PDMS için dağıtın. </li><li> AlmakHer kollajen kaplı PDMS cımbızla damga ve onları hafifçe ters çevirin. PDMS üstüne ters pullar indirin 35 mm çaplı doku kültüründe ortaya koydu destekler kollajen mühür ve doku kültürü çanak alt arasında olacak şekilde bombeli. 30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de yemekler inkübe edin. </li><li> Dairesel lamelleri her birine ~ kalan kollajen karışımı 50 ul koyun ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe (daha sonra bu, tamamen kollajen bunları kapsüllemek için mühendislik dokularının üzerine yerleştirilir). </li><li> % 40 konfluansa ~ epitel hücreleri (ör. EpH4 fare meme epitelyal hücreleri) ihtiva eden bir 100 mm çaplı bir doku kültürü çanağı elde edilir. Hücre kültür ortamı aspire edildi ve PBS 1x 10 ml ile bir kez yıkanır. hücrelere tripsin 2 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> doku kültürü çanağı, tripsinize edilmiş hücre ihtiva eden çanak kalan yapışık hücreler ayırma taze kültür ortamı 8 ml ekleyin. pipetleme ile yavaşça karıştırın ve 5 dakika boyunca 100 x g &#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj hücre karışımı hareket ettirin. </li><li> Konik tüpten aspire ve hücre kültür ortamı içinde hücre pelletini. hücreler bir hemasitometre kullanarak saymak süspansiyon konsantrasyonunu belirlemek için. 10 6 -10 7 hücre / ml ~ nihai bir konsantrasyon elde etmek için süspansiyon ses seviyesini ayarlayın. </li><li> inkübatör jölelenmişti kollajen örnekleri çıkarın. cımbız kullanarak, yavaşça kalıplı kollajen onları ayırmak ve onları atmak için düz yukarı PDMS pulları kaldırın. </li><li> istenen geometriye kalıplanmış boşluklar içeren her kollajen jel yüzeyi üzerine ~ konsantre hücre süspansiyonu 30 ul koyun. Hafifçe yemekler yan sallayarak boşlukları içinde yerleşen hücreyi teşvik yan ise 10X / 0.25 NA amacı ile bir aydınlık mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. boşluklar ~ 5 dakika içinde doldurulması gerekmektedir. </li><li> rBoşlukların etrafında aşırı hücre birikimleri temizlenmelidir yan, her bir doku kültürü çanağı eğim ve yavaşça kollajen jel yüzeyi üzerine hücre kültürü ortamında ul 400 ~ dağıtın. Her yıkama arasında mikroskop altında kolajen jelleri kontrol sıvı aspire ve yıkama 1-2 kez daha tekrarlayın. </li><li> fazla hücreler kolajen kalıp hücre dolu boşlukların etrafında temizlendikten sonra, 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir hücre kültür inkübatörü içine doku kültür kaplarına yerleştirin. Ardından, cımbız kullanarak, yavaşça kollajen kaplı sınıf lamelleri ters ve lamelleri kollajen hücre dolu boşlukların üzerine bir kap oluşturduğu hücre dolu kollajen kalıpların üstüne koyun. 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kollajen kapaklar hücre dolu kollajen kalıba yapıştırılır sonra, jeller üstüne cam lamel üzerinde yavaşça ~ 2-2.5 ml hücre kültür ortamı dağıtmak. Kültür 1-3 gün boyunca 37 ° C &#39;de örnekler. Not:24 saat ilk ekimden sonra epitel dokular, epidermal büyüme faktörü (EGF) veya dal uyarılması için hepatosit büyüme faktörü (HGF) gibi büyüme faktörleri ile muamele edilir. </li></ol> 4. İmmünofloresan ve Görüntü Analizi <ol><li> Doku kültür kaplarından, hücre kültür ortamı aspire ve hücre-ihtiva eden jeller karşılamak için yeterli sabitleyici solüsyonu ekleyin. 200 rpm&#39;de bir çalkalayıcıda 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin yemekler. </li><li> , Fiksatif aspire 1X PBS ile doku kültür kaplarına doldurun ve 200 rpm&#39;de bir çalkalama 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Üç toplam yıkar iki kez tekrarlayın. </li><li> Doku kültürü çanak aspire PBS ve Hoechst çözümü ile değiştirin: çekirdekleri etiketlemek için. 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. FAK veya antikorlar ile saptanabilir başka marker için leke, 4.5 adıma geçin. </li><li> nükleer etiketleme çözeltisi aspire ve hücre-ihtiva eden g yıkamakAşama 4.2 olarak 1 x PBS ile üç kez kavuşmaktadır. Lekeli örnekler sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de 1 x PBS içinde saklanabilir. </li><li> , PBS aspire doku kültür kaplarından% 0.3 PBST 300 ul ve 15 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir örnek: ilgi konusu bir protein için leke için. </li><li> PBS aspire Blokaj tamponu ile jeller kapak ve ~ 4 saat boyunca oda sıcaklığında bir çalkalama (200 rpm) üzerinde inkübe edin. </li><li> Aspire bloke tamponu, primer antikor çözeltisi ile jeller kapağı ve 4 ° C&#39;de bir gece 200 rpm&#39;de bir çalkalama üzerinde inkübe edin. </li><li> Primer antikor çözeltisi aspire% 0.3 PBST solüsyonu ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında 200 rpm&#39;de bir çalkalama üzerinde inkübe edin. PBST aspire ve 3-4 saat süreyle her 30 dakikada bir tekrarlayınız. </li><li> Tekrarlayın 4.7 ve 4.8, ikincil antikor çözeltisi ile inkübe bu kez yineleyin. İkincil antikor photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile doku kültür tabaklarında sarın. fina sonraL yıkama, lekeli numuneler sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de 1 x PBS içinde saklanabilir. </li><li> Örnekleri görselleştirmek için, epitel dokuda midplane odaklanmış bir 10X / 0.30 NA objektif kullanın. </li><li> Hücre çekirdekleri, UV aydınlatma altında 10X / 0.30 NA objektif kullanarak bir nükleer işaretleyici ile etiketlenmiş görüntü sabit örnekleri görselleştirmek için. </li><li> Ters bir floresan mikroskopu üzerinde bir 10X / 0.30 NA objektif kullanılarak ilgi konusu bir protein, görüntü için boyandı örnekleri görselleştirmek için. </li><li> aynı ilk geometri birçok dokuda (tipik olarak 50 veya daha fazla) protein boyama frekans haritalar oluşturmak için, ilk ithalat standart görüntü analiz yazılımı kullanarak her görüntü (Malzeme) ve 8-bit gri tonlama onları dönüştürmek. </li><li> Bu görüntülerin eşik için, gri tonlama kesme noktası tanımlayarak ikili (yani, yarım ton / siyah ve beyaz) onları dönüştürmek; eşiğin altına gri tonlama değerleri siyah olur ve eşiğin üstünde o beyaz olur. Daha sonra, kombinetek bir görüntü yığını içine bireysel ikili görüntülerin her. </li><li> Sonraki yığılmış görüntüleri kayıt (yani hizalamak veya onları maç) analiz yazılımı. Birçok görüntü analiz yazılımı paketleri serbestçe kullanılabilir kayıt eklentisi ile geliyor. <ol><li> sonraki görüntüye uyum için bir şablon olarak bir yığın her görüntü kullanın, tüm yığın görüntüleri yayılması ile hizalanır şekilde. Son olarak, bindirme (proje) ortalama yoğunluğuna dayalı hizalanmış görüntü yığınında görüntüleri piksel frekansı harita ile tek bir görüntü oluşturmak için. Bu görüntü daha sonra renk kodlu seçim 10,11 görüntü düzenleme yazılımını kullanarak olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Affolter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+signaling+in+the+regulation+of+branching+morphogenesis.">PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis.</a> Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sternlicht, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+stages+in+mammary+gland+development:+the+cues+that+regulate+ductal+branching+morphogenesis.">Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis.</a> Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).</li><li>Fata, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK(ERK-1,2)+pathway+integrates+distinct+and+antagonistic+signals+from+TGFalpha+and+FGF7+in+morphogenesis+of+mouse+mammary+epithelium.">The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium.</a> Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).</li><li>Ip, M. M., Darcy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+mammary+primary+culture+model+systems.">Three-dimensional mammary primary culture model systems.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).</li><li>Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+three-dimensional+models+to+study+mammary+gland+branching+morphogenesis+and+functional+differentiation.">Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).</li><li>Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+determines+sites+of+mammary+branching+morphogenesis+in+organotypic+cultures.">Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures.</a> Science. 314 (5797), 298-300 (2006).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+patterns+of+mechanical+stress+are+required+for+branching+morphogenesis.">Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis.</a> Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).</li><li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+mechanical+strains+and+stresses+around+quiescent+engineered+three-dimensional+epithelial+tissues.">Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues.</a> Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).</li><li>Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+tensile+forces+drive+collective+cell+migration+through+three-dimensional+extracellular+matrices.">Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices.</a> Sci Rep. 5, 11458 (2015).</li><li>Zhu, W., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+regulates+branch+initiation+and+extension+of+cultured+mammary+epithelia+via+Akt+and+Rac1+respectively.">PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively.</a> Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).</li><li>Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+and+alveolar+morphogenesis+of+primary+mammary+cultures+on+reconstituted+basement+membrane.">Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane.</a> Development. 105 (2), 223-235 (1989).</li><li>Hirai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+functions+as+a+key+morphoregulator+for+mammary+epithelial+cells.">Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells.</a> J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).</li><li>Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+stroma+induces+branching+morphogenesis+of+engineered+epithelial+tubules.">Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules.</a> Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the...

morfojenezi dallanma olarak bilinen kollara ayrılmış epitelyal dokuların gelişimi, hücre-türevli, fiziksel ve çevresel faktörler ile düzenlenir. meme bezinde, morfolojilerinden dallanma toplu hücre göçü bir ağaç gibi mimari oluşturur güdümlü aracılığıyla tekrarlanan bir süreçtir. İlk adım şube başlatılması ve uzama 1,2 izledi süt kanallarından birincil tomurcuğu oluşumu vardır. Çevredeki stromaya dalları Invasion ergenlik steroid hormonların sistemik salınımı ile indüklenir. Yeni birincil tomurcukları sonra varolan şube uçlarından başlatabilir ve bu süreç bir epitel ağacı 3 yaratmaya devam ediyor. Birçok önemli biyokimyasal sinyaller tespit edilmiş olmasına rağmen, bu karmaşık gelişim süreci şu anda eksiktir rehberlik hücre biyolojik mekanizmaların kapsamlı bir anlayış. Ayrıca, belirli ipuçlarının etkilere mekanik çalışmalar deney gelen yapısızlaştırmak zorin vivo likte olarak hassas uzaysal tedirginlikler ve ölçümler çoğu zaman mümkün değildir. Böyle tüm organ kültürü, birincil organoids ve hücre kültür modelleri gibi üç boyutlu (3D) kültür teknikleri, sistematik doku morfolojilerinden 4-6 yatan mekanizmaları araştırmak için yararlı araçlardır. Bu hareketi, çoğalması ve farklılaşması dahil olmak üzere hücre davranışları çeşitli, bu gibi mekanik güçler ve biyokimyasal sinyallerin gibi, tek tek özel faktörlerin etkileri belirlemek için yararlı olabilir. 6 tasarlanan hücre kültürü modelleri, özellikle, hali hazırda pertürbasyon etkinleştirmek tek tek hücreler ile bunların mikro arasında. Böyle bir kültür modeli a ile uyarılan zaman tutarlı ve tekrarlanabilir toplu göç dalları oluşturan kontrollü 3D yapısı ile örnek meme epitel doku mühendisi bir mikroüretim tabanlı bir yaklaşım kullanırppropriate büyüme faktörleri. modelin en büyük avantajı tam işlemek ve bu tür yüksek istatistiksel güven ile mekanik stres desen, fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin etkilerini ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik, bir araya hesaplama modelleme ile, daha önce meme epitelyal dokusunda ve dallı epitel 7-11 normal gelişimin rehberliğinde fiziksel ve biyokimyasal sinyallerin nispi katkılarını belirlemek için kullanılmıştır. Burada sunulan kolaylıkla hücreler ve hücre-dışı matrisi (ECM) jellerin diğer tiplerinin uzatılabilir, bu model, dokular, bina için ayrıntılı bir protokoldür ve terapötiklerinin test edilmesi için potansiyel bir araç olarak hizmet eder.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS curing agent</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Lithographically patterned silicon master</td><td>self-made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic weigh boat</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-115</td><td></td></tr><tr><td>100-mm-diameter Petri dishes</td><td>BioExpress</td><td>D-2550-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>American Safety Razor</td><td>620179</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium : Ham&amp;rsquo;s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>10x Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen (non-pepsinized)</td><td>Koken</td><td>IAC-50</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Curved stainless steel tweezers</td><td>Dumont</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-diameter tissue culture dishes</td><td>BioExpress</td><td>T-2881-6</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>BioExpress</td><td>C-3394-2</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter</td><td>Bellco Glass Inc.</td><td>Special order</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 1x Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300260</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H 9661</td><td>Resuspended in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O at 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse FAK antibody</td><td>Life Technologies</td><td>AMO0672</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Used for color-coding pixel frequency maps.</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.</td></tr></tbody></table>

engineering three-dimensional epithelial tissues embedded within extracellular matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

Meme epitelyal dokusu mikroimalat genel şematik Deneysel çalışma akışını özetleyen mikroimalat prosedürünün genel şematik Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Sonuçta tamamen bir ECM jel içinde gömülü olan özdeş geometri ve aralık epitel dokuda bir dizidir. Temsili deney I, 4 mg / ml bir konsantrasyonda kolajen sığır türü bir jel içinde kültürlenmiş EpH4 fare meme epitelyal hücreleri kullanılmakta...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix at JoVE.com

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

engineering-three-dimensional-epithelial-tissues-embedded-within

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Görüntüleme.  Princeton University.  Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar. 

Video: Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Kanser Araştırmaları

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ECM also participates in cell migration, proliferation, and differentiation. Fibroblasts are the main type of cells modifying ECM fiber arrangement and production. In cancer, CAFs (cancer associated fibroblasts) are in permanent activation status, participating in ECM remodeling, facilitating tumor cell migration, and stimulating tumor-associated angiogenesis, among other pro-tumorigenic roles. The objective of this method is to create a three-dimensional matrix with a fiber composition that is similar to in vivo matrices, using immortalized fibroblasts or human primary CAFs. Fibroblasts are cultured in pre-treated cell culture plates and grown under ascorbic acid stimulation. Then, fibroblasts are removed and matrices are blocked for further cell seeding. In this ECM model, fibroblasts can be activated or modified to generate different kinds of matrix, whose effects can be studied in cell culture. 3D matrices are also shaped by cell signals, like degradation or cross-linking enzymes that might modify fiber distribution. In this context, angiogenesis can be studied, along with other cell types such as epithelial tumor cells.

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. Fibroblasts are seeded in a pre-treated culture plate and stimulated with ascorbic acid for matrix generation. Matrices are decellularized and blocked to culture relevant cells (e.g., endothelial cells).

Endotel Tüp Oluşumu Namına Uygulanan Fibroblast Türetilmiş 3D Matris Sistemi

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Doku Mühendisliği: Katmanlı Hücre Sheets teslimi için bir Multisellüler 3D İskele İnşaatı

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Biyomühendislik

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional (3D) structures. One of the main functions of epithelia is the formation of barriers that protect the underlining tissues against physical and chemical insults and infectious agents. In addition, epithelia mediate the transport of nutrients, hormones, and other signaling molecules, often creating biochemical gradients that guide cell positioning and compartmentalization within the organ. Owing to their central role in determining organ-structure and function, epithelia are important therapeutic targets for many human diseases that are not always captured by animal models. Besides the obvious species-to-species differences, conducting research studies on barrier function and transport properties of epithelia in animals is further compounded by the difficulty of accessing these tissues in a living system. While two-dimensional (2D) human cell cultures are useful for answering basic scientific questions, they often yield poor in vivo predictions. To overcome these limitations, in the last decade, a plethora of micro-engineered biomimetic platforms, known as organs-on-a-chip, have emerged as a promising alternative to traditional in vitro and animal testing. Here, we describe an Open-Top Organ-Chip (or Open-Top Chip), a platform designed for modeling organ-specific epithelial tissues, including skin, lungs, and the intestines. This chip offers new opportunities for reconstituting the multicellular architecture and function of epithelial tissues, including the capability to recreate a 3D stromal component by incorporating tissue-specific fibroblasts and endothelial cells within a mechanically active system. This Open-Top Chip provides an unprecedented tool for studying epithelial/mesenchymal and vascular interactions at multiple scales of resolution, from single cells to multi-layer tissue constructs, thus allowing molecular dissection of the intercellular crosstalk of epithelialized organs in health and disease.

The present protocol describes the capabilities and the essential culture modalities of the Open-Top Organ-Chip for the successful establishment and maturation of full-thickness organ-on-chip cultures of primary tissues (skin, alveolus, airway, and intestine), providing the opportunity to investigate different functional aspects of the human epithelial/mesenchymal and vascular niche interface in vitro.

İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

<meta charset="utf8"></head><body>Epitel ve Fibroblast hücreleri için gelişmiş iki katmanlı 3D ko-kültür sistemi

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: PVA-PCL Nanolifli Membranlarla 3D Kokültür Sistemlerini Geliştirme

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...