Biz içtenlikle Dr. Mustafa Khokha, Yale Üniversitesi, onun laboratuvar kaynaklarının kullanımını sağlamak için teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için Bay Ming-Jie Wu için sana şükrediyoruz. EF HHMI dedektif olduğunu. Bu eser bir hediyesi John Monsky ve Jennifer Weis Monsky Lyme hastalığı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.

1. DNA şablonları hazırlanması
<ol><li>16S rRNA sıra belirli bakteriyel her cins NCBI veritabanını ve tasarım polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uyumlu ileri download ve cins özel bölgeler (~ 200-250 baz çifti uzun) daha önce anlatıldığı gibi yükseltmek astar ters 19. RNA probları bakteriyel bazı cinsler için ticari olarak olsa da aynı zamanda açık kaynak veritabanlarının SILVA20,probeBase ve21 22 için çevrimiçi kaynaklar rRNA hedefli oligonükleotid sonda ve astarlar, bakın kullanılabilir. Not: Özel-özel cins olan gen bölgeleri seçin ve tasarlanmış astar ilgili bakteriyel cins yükseltmek değil emin olmak önemlidir. Bu gen/cins özel sonda hibridizasyon elde etmek için önemlidir.</li>
	<li>Fareler, 24, 48 veya 72 h kene cesaret teşrih ve RNA ve açıklanan önceki23olarak kene bağırsaklar dan cDNA hazırlamak için keneler besleme. PCR şablonuna yükseltmek gibi bir thermocycler kullanarak cins özel amplicons cDNA kullanın. PCR-ürün/amplicon bir aliquot üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve amplicon için beklenen boyut görüntüleme sistemi bir jel kullanarak ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirme tarafından karşılık geldiğini onaylayın.</li>
	<li>Bakteriyel 16S ribozomal RNA amplicon ilgi RNA polimeraz Rehberleri bakteriyofaj polimerazlar (SP6, T7 veya T3) uygun içeren bir piyasada bulunan TA vektör içine (Tablo reçetesi) klon. Amplicon kimliğini ve yön ile ilgili her Rehberleri bir klonu onaylamak için klonlar sıra. Buna göre duygusu veya antianlamlı RNA oluşturmak için seçim organizatörü (Şekil 1) probları belirlemek.</li>
	<li>Plazmid 30 µLfor üretici tarafından önerilen sıcaklıklarda 2 h reaksiyon hacmine uygun bir Restriksiyon enzimi ile 1 mg linearize. Enzimleri duygusu veya antianlamlı sonda (Şekil 1) oluşturmak için kullanılması gereken organizatörü göre seçin. 2 µL % 1'özel jel üzerinde Özet tepki görselleştirme tarafından doğrusallaştırma doğrulayın.</li>
	<li>Bir piyasada bulunan PCR ürün sütun arıtma kiti kullanılarak sindirilir DNA'ın kalan 28 µL arındırmak ve DNA toplama spektrofotometre tarafından ölçmek. Not: Arka plan karşılık gelen antianlamlı sonda çok daha yüksek boyama bazı anlamda probları neden olabilir ve diğer seçenekleri keşfedilmeyi gerekebilir. Alternatif negatif denetimleri örneği veya hibridizasyon kendine özgü bir model verir başka bir robot temsil edilmeyen dizileri kodlama plazmid içerir.</li>
</ol>2. Digoxygenin-UTP RNA probları inşaatı
<ol><li>100 mm UTP, 10 mM digoxygenin-UTP 25 µL ve 10 µL her 100 mM ATP, GTP ve CTP 1,5 mL santrifüj tüpü içinde 7,5 µL birleştirerek nükleotit karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek piyasada bulunan T7 veya Sp6 RNA polimeraz kitleri kullanarak, 1 µL nükleotit Mix (adım 2.1) ve 0,25 - kullanarak 1 µg şablonunun DNA. Birim su ile 20 µL kadar getir. Birleştirmek ve spin darbe tüpü hafifçe vur. 2.5-3 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Sonda inşaat sindirilir plazmid konsantrasyonları 7 ng/µL düşük ama 15-25 ng/µL Bu adım mesafeden tipik konsantrasyonları ile başarılı olmuştur. Transkripsiyon tepki de gecede 37 ° C'de inkübe, ama bu önemli ölçüde RNA verim artırmaz.</li>
	<li>DNaz 1 µL ekleyin (2.000 adet/µL) ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. 10 dk fazla olamaz veya enzim RNA aşağılayıcı başlayabilir.</li>
	<li>Buz gibi 7.5-8 M Lityum klorür 30 µL ve 30 µL RNA çökelti nükleaz ücretsiz soğutulmuş su ekleyin. Karıştırmak için tüp fiske. Yağış RNA gecede-20 ° C'de devam etmek için izin</li>
	<li>Santrifüjü 17.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de tarafından RNA toplamak Pelet kez 1 mL taze hazırlanmış % 75 etanol dietil pyrocarbonate (DEPC) su ile yıkayın, sonra aralıklarla tekrarlayın.</li>
	<li>Kaldırmak ve süpernatant atmak, tüp temiz kağıt havlu üzerine ters çevir ve 10 dk. Resuspend için Pelet nükleaz ücretsiz su kurumasını sağlar. Pelet kolayca görünür durumdaysa, 25 µL resuspend. Pelet içinde 15-20 µL. çok küçük veya görünür değil, resuspend ise RNA konsantrasyon tahmini spektrofotometre tarafından elde etmek. Not: 200-500 ng/µL tipik RNA konsantrasyonları arasındadır.</li>
</ol>3. görsel olarak RNA RNA saflık değerlendirmek için RNA formaldehit jel elektroforez tarafından probları
Dikkat: Formaldehit bir inhalasyon tehlike teşkil etmektedir; Bu nedenle, RNA jel analiz bir duman Hood için gerekli çözümler üretmek. Etidyum bromür şüpheli bir kanserojen olduğu; özenle hallederim.
<ol><li>% 1 formaldehit özel jel24 daha önce açıklanan ve jel RNases ücretsiz bir jel kutusunda döküm olarak hazırlamak. Serin bir kez, arabellek (1 x bezleri pH 7,0, %5 formaldehit) çalıştıran x 1 jel kutusunu doldurun.</li>
	<li>Örnek arabellek (5 µL 400 mg/mL arasında etidyum bromür, bezleri, 35 µL formaldehit ve 100 µL formamide x 20 µL 10) hazırlayın. RNA inceleyebilirsek (adım 2.6) 2 µL örnek arabellek 8 µL ile birleştirin. 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>RNA yükleme arabellek 5 mL % 50 gliserol, 1 mL % 10 formaldehit, 40 mg bromophenol mavi, 40 mg ksilen cyanol ve 0,5 M EDTA (pH 7.5) 20 µL birleştirerek hazırlayın. Bu arabellek-20 ° C'de kullandıktan sonra saklamak</li>
	<li>Yükleme arabelleği 3 µL RNA örnek adım 3.2 ekleyip karıştırın. Örnek tüpler buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bütün numune hacmi adım 3.4 jel yükleyin. Bir aliquot tek iplikçikli RNA merdivenin alongside RNA boyutu doğrulamak için yükleyin. Jel 100 V çalıştırmak veya mavi boya jel aşağı yaklaşık % 75'i geçirir dek indirin. Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak UV ışık altında RNA görselleştirin. Not: Kaliteli RNA prob prob (Şekil 2, lane 1) beklenen boyutuna karşılık gelen bir hareketlilik ile ayrı bir grup olarak görünmesi gerekir. Eğer soruşturma bu kullanılmaması gereken bir yaygın ve smeary band (Şekil 2lane 2) görünür.</li>
</ol>4. Gut koleksiyonu ve fiksasyon kene
<ol><li>Zaman ilgi için fareler üzerinde beslenen Ixodes scapularis perileri toplamak. Not: Bu teknik amacı gereği, 48 veya 72 s iş için en iyi keneler beslenir.</li>
	<li>Kene gelen bağırsak MEMFA (Tablo 1) mümkün olduğunca çok organ hasar kaçınarak bir diseksiyon mikroskop altında bir cam slayt üzerinde incelemek. Bir kene MEMFA 20-30 µL içinde temiz mikroskop slayttaki bir yer. Steril yüksek karbon çelik tıraş bıçağı #11 dilim baş bölge çifti kene kene vücut bırakarak kalkan kullanarak. Gut divertikül ve tükürük bezleri vücut kütikül dışarı itmek için vücut hafifçe bastırın. Tükrük bezleri ve gut ayırmak ve cesareti jilet üzerinde oymak.</li>
	<li>Cesaret 500 µL MEMFA içeren bir 1,5 mL tüp içine toplamak. Nazik 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında tüp kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de Not: Kene tükürük bezleri de disseke ve benzer şekilde sabit lekeli ve.</li>
	<li>Doku yavaşça 1 mL buz gibi % 100 etanol ile 3 kez yıkayarak kurutmak. Santrifüjü doku zarar verebilir gibi doğal olarak her yıkama arasında tüp altına lavabo cesaret ver. Uzun süreli depolama için örnekleri-20 ° C'de % 100 etanol içinde tutmak</li>
</ol>5. inşaat kafes örnek sepetleri ve 24-şey sepet tutucu
<ol><li>Dipleri 2 mL veya 5 mL kapalı ısıtmalı tek taraflı jilet bir neşter kullanarak ek alıcı santrifüj tüpleri kesti. Dikkat: Bıçak kesim tamamlamadan önce birkaç kez yeniden isitilan gerekebilir.</li>
	<li>110 µm naylon mesh karelerinin biraz yeni tüp açılış daha büyük kesti. Tüp altına mesh iyi bir mühür yapılana kadar onları birlikte hafifçe sıcak bir tabak orta-düşük ateşte basarak bond. Soğumaya bırakın, mesh ve tüp arasında boşluk olduğundan emin olun ve aşırı kafes kenarları kırpın.</li>
	<li>Öyle ki adım 5,2 yapılan örnek sepet dudak Hole'da oturmak ve aracılığıyla, nerede örnek sepetleri dipleri oturup ta wells içinde konulduğunda bir set-up verimli değil düşmek bir 24-şey plaka kapak delik kesme kapak delik.</li>
	<li>Bu monte sepet tutucu sepetleri bir tabak içinde in situ hibridizasyon Protokolü tamamı için göreli kolaylıkla diğerine aktarmak için kullanın. Bir kuluçka meydana gelen iken, diğer plaka için sonraki yıkama hazırlanan iki 24-şey tabak kullanın.</li>
</ol>6. in Situ hibridizasyon: 1. gün (zamanlama: 4-5 h)
<ol><li>Transfer cesareti için örnek sepetleri etiketli, deneysel koşulla ayrılmış ve RNA sonda amaçlanan. Not: koşul çoğaltır arasında doğal varyasyon için hesap başına en az 5 cesaret leke.</li>
	<li>Yavaşça hava kabarcıkları dokusu içine yavaş yavaş serum fosfat tamponlu %0.1 non-iyonik yüzey aktif (PTw; oranını artırarak tanıtımı önlemek için örnekleri suyla temasa Tablo 1) etanol için yıkar. Not: Komple tüm 24-şey sepet sahibi nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığı, aksi belirtilmediği sürece yıkar. Aliquot 500-600 µL yıkama çözümler içine cesaret her sepette tamamen batık her tür sahibinin. RNA yıkımı önlemek için su DEPC tedavi ile tüm çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Örnekleri 5 min için 500 µL % 100 etanol içinde yıkayın.</li>
		<li>% 75'i örnek sepet başına en az 500 µL hazırlamak, % 50 ve % 25 etanol içinde PTw. örnekleri 5 dakika içinde en yüksek etanol konsantrasyon en düşük hareket her etanol çözüm yıkanmasında tarafından suyla temasa.</li>
		<li>4 kere 5 min için örnekleri PTw içinde yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri İndinavir K ile permeabilize (10 µg/mL) PTw 5 dk içinde.</li>
	<li>Doku hibridizasyon için RNA probları ile hazırlayın.<ol>
<li>İki kez 6.2 500 µL trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) her 5 min için nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığında 24-şey sepet tutucu (örnekleri Amin-Alerjik bir ortamda korumak için,Tablo 1) açıklandığı gibi örnekleri yıkayın.</li>
		<li>Trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) 5 min için örnekleri iki kez 500 µL % 0,25 asetik anhidrit ile tedavi, sonra örnekleri PTw 5 min için iki kez yıkayın. Not: Non-spesifik elektrostatik etkileşimler önlemek ve mRNA için sondanın özel bağlayıcı emin olmak çok önemlidir olumlu şarj etkisiz hale getirmek için ücretsiz aminler asetik anhidrit acetylates.</li>
		<li>PTw 500 µL % 4 paraformaldehyde ile 20 dk için cesaret düzeltmek, daha sonra 5 kere 5 dk her PTw içinde yıkayın.</li>
		<li>500 µL hibridizasyon arabellek /in titreyen bir su banyosu içinde nazik ajitasyon ile 24-şey sepet sahibi için 1,5-2,5 h 60 ° C'de 24 iyi plaka (Tablo 1) örneklerinde kuluçka tarafından prehybridize. Gün 2 Protokolü (adım 7.1) yeniden kullanmak için prehybridization adım hibridizasyon arabelleği kaydedin.</li>
		<li>Sonda hibridizasyon çözümleri RNA sondalar son konsantrasyonu 1 µg/ml hibridizasyon arabellekte sulandrarak hazırlayın.  Kuluçkaya gecede, titreyen bir su banyosu (Tablo 2) nazik ajitasyon ile 60 ° C'de 24-şey sepet tutucu prob hibridizasyon çözümleri ile örnekleri. Hibridizasyon çözüm buharlaşma önlemek için sepet tutucu alüminyum folyo ile rahatça taşıyan plaka kapak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. in Situ hibridizasyon: 2. gün (zamanlama: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Örnekleri sonda hibridizasyon çözümlerinden kaldırmak ve önceki gün ayrılmış hibridizasyon arabelleğinden içine koyun. 3 min için nazik ajitasyon ile 60 ° C'de kuluçkaya. Not: Sonda hibridizasyon çözümleri-20 ° c yeniden kullanım için ilâ 3 kere depolanabilir.</li>
	<li>Serum sodyum sitrat arabellek (SSC) x 2 sulandrarak 20 tarafından hazırlamak x SSC DEPC tedavi su (Tablo 1). Örnekleri 3 dk ile 2 x SSC için iki kez, o zaman 2 ile 20 dk için 3 kez yıkayın x SSC 60 ° C'de sonda ve hibridizasyon arabelleği tüm izlerini silmek için.</li>
	<li>Bir (20 µg/mL) ve RNase T RNase ile tedavi1 (10 µg/mL) 2 x SSC 37 ° C'de 30 dk için tek kaldırmak için zor durumda RNA prob ücretsiz temsil eden sigara-melezleşmiştir RNA.</li>
	<li>2 ile bir kez yıkama x SSC oda sıcaklığında 10 dakika için. 0,2 hazırlamak sulandrarak 2 tarafından x SSC suda DEPC tedavi x SSC sonra iki kez 0,2 ile yıkayın aşırı RNases kaldırmak için x SSC 60 ° C'de 30 dk için.</li>
	<li>Maleik asit tampon (MAB; 500 µL ile iki kez yıkamak Tablo 1) 10 dakikadır her.</li>
	<li>1.5-2 h için çözüm (MAB % 2 engelleme reaktif) engelleme ile örnekleri kuluçkaya. Not: Engelleme reaktif çözülmeye zor olabilir; nazik Isıtma dağılmasına yardımcı olur.</li>
	<li>Anti-digoxigenin alkalin fosfataz Birleşik 500 µL çözüm engelleme 1:3,000 seyreltme, antikor, engelleme çözüm yerine ve yaklaşık 4 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
</ol>8. in Situ hibridizasyon: 3. gün (zamanlama: bir gecede 6 h)
<ol><li>Örnekleri ile 500 µL MAB aşırı antikor kaldırmak için her 30 dk için en az 5 kez yıkayın. Not: Bu yıkama esnektir ve 1-2 h için uzatılabilir veya 3-4 yıkama etkinliği en az düzeyde etkisi ile 4 ° C'de bir gecede yıkama için yerine olabilir.</li>
	<li>Alkalen fosfataz arabelleği, pH 9,5 (AP arabellek; ile 5 min için iki kez yıkamak Tablo 1).</li>
	<li>Son yıkama chromogenic substrat alkalen fosfataz (Tablo reçetesi) için 500 µL değiştirerek renk reaksiyon başlar. Alüminyum folyo ile örnek plaka kapak ve 3 - 5 s veya 4 ° C'de gece için oda sıcaklığında devam boyama izin Boyama reaksiyonu belirli aralıklarla overstaining önlemek için diseksiyon mikroskop altında doku görüntüleyerek izlemek. Not: boyama tamamlandığında, bir mor renk tonu gözlerinin içine mikroskop altında antisens probed örnekleri tarafından algılanabilir ama doku çok karanlık olmak için izin verilmemelidir. Boyama 4 ° C'de çok yavaş devam eder ve en fazla 20-24 saat sürebilir.</li>
	<li>5 dakika içinde 500 µL MAB yıkanmasında tarafından renk reaksiyonu ve ardından doku gecede Bouin'ın çözümde düzeltmek. Dikkat: Bouin'ın çözüm bir duman başlıklı işlemek; aşındırıcı bir kanserojen olduğu.</li>
</ol>9. in Situ hibridizasyon: 4 gün (zamanlama: 3-3.5 h)
<ol><li>1 örnek sepet başına en az 7 mL hazırlamak sulandrarak 20 x SSC su DEPC tedavi x SSC. Bouin'ın çözüm 1'örnekleri 4-6 kez % 70 etanol ile yıkayarak çıkarın doku artık sarı olana x SSC.</li>
	<li>%1 75, % 50 ve % 25 etanol çözümlerinde örnek sepet başına 500 µL hazırlamak x SSC. Örnekleri 5 min için en yüksek etanol konsantrasyon en düşük için doku rehydrate hareketli her çözümde yıkayın. İki kez 5 dk içinde her 1 yıkama x SSC.</li>
	<li>Çamaşır suyu çözüm (Tablo 1) örneklerinde bir duman başlıklı bir lightbox üzerinde 90 dk için kuluçkaya. Not: Bu adım herhangi bir pigmentasyon örnekleri veya Bouins eriyik-e doğru var olmak çıkarmak--dan renklendirme sağlar ve sonda sinyal açık görselleştirme için geliştirir.</li>
	<li>1 500 µL iki kez örnekleriyle yıkama x SSC 5 min için.</li>
	<li>Çok az hasar bağırsaklarıyla örnek sepet yeni bir 24-şey plaka bir kuyunun içine ters çevirme tarafından yeniden konumlandırmak ve % 70 etanol transfer pipet kullanarak kafes alt aracılığıyla ile yıkayın. -20 ° C'de gerekirse depolar.</li>
	<li>Şekil 3' te, gösterildiği gibi birden fazla örnekleri boyama şekillerinin genel bir bakış elde etmek için herhangi bir alan parlak mikroskopla % 70 etanol 24 iyi-plaka ve görünüm cesaret korumak. Şekil 4, Şekil 5' de gösterildiği gibi bireysel cesaret alan parlak mikroskop altında incelemek için, ve Şekil 6, %100 gliserol coverslips altında cesaret dağ. Bir plastik spatula yavaşça en az hasarla doku işlemek için kullanın. Not: Gliserol yüksek viskozite doku sıkıştırma tarafından neden olduğu zararlara karşı korunmasına yardımcı olur ve doku daha yüksek büyütme oranlarında en iyi şekilde görüntülenebilir öyle ki divertikül dikkatli konumlandırma sağlar.</li>
	<li>Esir alma imge üstünde mikroskop mikroskop belirli görüntü yakalama yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak ve genel bir resim düzenleme yazılımı için TIFF görüntü olarak dışa aktarın. Deneysel tedaviler göreli Boyama farklılıkları ölçmek için genel görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) yükleyin. Görüntüyü analiz yazılımı içinde açın ve boyama piksel yoğunluğu ölçümü ve boyama çubuk grafik araziler hesaplamak için belgili tanımlık öğretim içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission:+Translational+Aspects.">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).</li><li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut.">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li><li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worlds+within+worlds:+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota.">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li><li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+microbiome:+the+force+within.">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li><li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence.">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li><li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+microbiome+of+arthropods.">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks.">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li><li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphofunctional+changes+in+the+midgut+of+Ixodid+ticks+during+the+life+cycle.">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li><li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conducting+a+microbiome+study.">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87 (2014).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li><li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae.">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li><li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections.">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (1991).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete.">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li><li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies.">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li><li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces.">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+and+&amp;#34;All-species+Living+Tree+Project+(LTP)&amp;#34;+taxonomic+frameworks.">The SILVA and &amp;#34;All-species Living Tree Project (LTP)&amp;#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization.">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).</li><li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu bir eklem bacaklılar vektör patojenlerin microbiota çalışmaya bir bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) tekniği ilk kullanmaktır. Bizim iletişim kuralı bir geliştirme Drosophila ve kurbağa embriyosu25,26çalışırdım adapte oldu. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon gen transkript dağınık şekilde yerelleştirmek için rutin olarak kullanılmıştır ve geçici27 ve transkript görselleştirme parlak alana göre veya floresan mikroskopi yapılabilir. Kene cesaret microbiota tespiti doğru eski benimsedik. Bu hangi baş bölgesi penetrasyon sabitleştirici ve hibridizasyon çözümleri başarılı olmadı izin kaldırıldı tüm keneler kullanarak bütün-mount situ hibridizasyon gerçekleştirmeye çalışır unutmamak gerekir. Burada açıklanan protokol disseke cesaret kullanır ve midgut23yılında bakteriyel kolonizasyon belirli kene proteinler etkilerini incelemek için uygulamaya konmuştur. WMISH elde edilen bilgilerle immünhistokimya için karşılaştırılabilir ama protein ve gen antikor üretimi veya protein ilgi gerektiren değil avantajı vardır. Genomik bilgi reaktifleri WMISH için oluşturmak yeterlidir. WMISH ve balık (floresans in situ hibridizasyon) gen ekspresyonu algılayabilir. Ancak, o bir enzimatik ve Kromojen tabanlı tahlil varlık nedeniyle, WMISH renk geliştirme aktif olarak takip edilebilir ve tepki kadar istenen sinyal devam etmek için izin ve hassasiyet elde avantajı vardır. Bu Otomasyon için tam mükellef ve yüksek üretilen iş biçimine kolayca ölçeklenebilir. Balık ve immünhistokimya aksine, hiçbir kesit gereklidir. WMISH balık üzerinde sadece 2 farklı mRNA'ların veya genlerin aynı anda ele alınması ve sondalar digoxigenin-UTP ve floresein-UTP28gibi farklı nükleotid analogları ile etiketlenmesi gerekir dezavantajdır. Balık ile en fazla 6 farklı mRNA'ların bir tahlil29incelenebilir. Her iki deneyleri karşılaştırılabilir zaman gerektirirken, floresan boyalar maliyetini chromogenic yüzeylerde daha yüksek. WMISH görüntü görselleştirme herhangi bir ışık mikroskobu ile yapılabilir süre balık deneyleri de floresan mikroskop görüntü görselleştirme için gerektirir.
Bu protokol yakından takip çok önemlidir; Ancak, özel dikkat gerektiren bazı adımlar vardır. Diseksiyon midgut doku zarar olmadan kene gelen bazı beceri gerektirir. Gruptakiler pratik ve yeterlik kazanmak için ilave keneler toplamak ihtiyatlı olabilir. Bireysel cesareti (Şekil 3) farklı divertikül içinde boyama heterojenite nedeniyle, bakteriyel bereket kesin kanıtlar türetmek için her gut tüm divertikül incelemek önemlidir. Varlığı, kayma dağıtım ve bereket farklı divertikül içinde belirli bakterilerin kesin bilgi elde etmek için deneysel her koşul için birkaç cesaret (en az 5) işlemek önemlidir. Yüksek kaliteli RNA probları üretiminde etkili doku boyama için önemlidir. Ayrıca o antisens sağlamak için klonlama vektör sonda şablonunda dizisi onaylamak çok önemlidir ve anlamda probları uygun şekilde üretilir. Bir üretken vitro transkripsiyon tepki yeterli şablonu DNA gerektirir; en az 100 ng-var olmak kullanılmış, ancak 0,5 - 1 µg en iyi sonda üretimi için tavsiye edilir.
Örnek sepetleri ve bu iletişim kuralı 24-şey levha boyama işlemi sırasında zarar en aza indirir her yıkama adımında doku doğrudan manipülasyonu önler. Ancak, örnekler hala zaman zaman kaybolması veya zarar görmesi; bağırsaklar dan tartılı veya 24h beslemeli keneler, özellikle, zor görmek ve örnek sepetleri için uzun vadeli bir saklama kabı aktarırken kaybetmek kolay. Bu örnekleri taşıma sırasında ek bakım alınmalıdır. Bu sınırlama nedeniyle, esas olarak 48 ve 72 h beslemeli kene cesaret kullandık. Bu zaman-puan (72 h uzun) bağırsağına kan yemek büyük miktarda varlığı boyama ve görselleştirme kan unu belirsiz arka plan nedeniyle etkilemektedir ve de bir sınırlama bu tekniğin sunar. Probları fluorescently etiketli kullanımı bu sorunu aşmak muhtemeldir.
Boyama yordam en önemli sağlam boyama ve düşük arka plan sinyal arasındaki dengeyi kurmak için olanıdır. İdeal renk geliştirme zamanlaması deneysel koşullarına bağlı olarak değişebilir. Böylece, oda sıcaklığında ve monitör renk gelişim yaklaşık her 30 dakika renk reaksiyonu gerçekleştirmek en iyisidir. Tepki de gecede 4 ° C renk geliştirme yavaşlatmaya devam etmek için ayarlanmış olabilir. Ancak, uzun süre devam Bu reaksiyon değil izin vermek için son derece önemlidir. Boyama reaksiyonu örneklere diseksiyon mikroskop altında incelenmesi gerekir bu yüzden göz göre izlemek zor olabilir. Bir mor renk örnekleri RNA minimal renk tutmak gerekir duygusu ile probed iken antianlamlı RNA ile probed örnekleri üzerinde görünür olmalıdır. RNA probed anlamda örnekleri parlak leke, sorun giderme adımlarını BM mor ile kuluçka süresini azaltmak ve engelleme zaman artan ile başlamalıdır. Bazen anlam probları antianlamlı probları göre anormal derecede yüksek arka plan neden olabilir; Bu gibi durumlarda, farklı bölgelerde genin RNA probları üretmek için dikkate alınması gerekebilir. Verilen örnekte temsil edilmeyen DNA dizileri de negatif kontrol probları oluşturmak için şablon olarak düşünülebilir. Örneğin, bir bölge kene genom veya onun microbiome temsil edilmeyen yeşil flüoresan protein kodlama DNA şablon-ebilmek var olmak kullanmak.
Bu teknik bir sınırlama analizi büyük ölçüde nitel olmasıdır; Ancak, görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) her örnek içinde boyama sinyal miktarını ölçmek için kullanılabilir. Bu bakteri türleri çeşitli deneysel koşullarda bolluk yarı kantitatif karşılaştırılması sağlayacak. Bu 3-4 gün tamamlamak için alır zaman alıcı bir iletişim kuralı olmakla birlikte, zahmetli değildir; Her gün eller sadece yaklaşık 3-5 h ortalama zamanı. Ancak, pek çok örnekleri örnek sepetleri ve sahipleri ile paralel işleme yeteneği yüksek üretilen iş analiz için izin verir. Ayrıca, bu işlem piyasada bulunan aletler kullanarak otomatik hale getirilebilir (malzemeler tablo) bu iletişim kuralı bir temel ve rutin bileşeni kullanarak araştırma laboratuvarı piyasada olması bekleniyor Eğer Otomasyon uyumlu platformlar (Tablo reçetesi) daha fazla uygulamalı süresini azaltın.
Açıklanan protokolü kullanarak parlak alan mikroskobu görüntüsü kolorimetrik bir sinyal üretimini sağlayan digoxygenin etiketli probları kullanır. Bir chromogenic substrat melezleşmiştir RNA probları belirli bireysel hedefleri algılamak için kullanılan iken, sonda digoxigenin-UTP gibi farklı nükleotid analogları ile etiketleme tarafından aynı anda birden çok hedef algılamaya mümkündür ve Fluoresein-UTP ve farklı chromogenic yüzeylerde30. Doku örnekleri sonra sırayla digoxigenin ve iki adımı için farklı chromogenic tepkiler ile floresein karşı antikor alkalin fosfataz birleştiğinde ile inkübe. Bu teknik aynı zamanda daha yüksek çözünürlükte görüntüleme confocal mikroskobu31 kullanarak kolaylaştırmak ve farklı renklerde birden fazla probları paralel olarak kullanma seçeneği sağlar fluorescently etiketli probları için adapte olabilir. Bu teknik yalnızca özellikle birkaç mikroorganizmaların bir anda bir örnek olarak değerlendirebilirsiniz. Ancak, çeşitli örnekleri kene microbiota temsil birden fazla mikroorganizmaların adrese yüksek üretilen iş deneyleri içinde değerlendirilebilir.
Son olarak, bu teknik keneler ve onların ilişkili microbiota arasındaki etkileşimler incelenmesi için sınırlı değildir. Sonda tamamlayıcı kene genom içinde ilgi herhangi bir gen için oluşturulan ve bolluk ve yerelleştirme belirli genlerin farklı dokularda incelemek için kullanılan. Kene tükürük bezleri de işlenen ve benzer şekilde gut için analiz edilebilir. Genel olarak, bu teknik mikrobiyal topluluklar diğer eklem bacaklılar hastalık vektör ilgi içinde dinamikleri üzerinde uyum çalışmaları için geniş potansiyele sahiptir.

İnsan ve hayvan patojenler eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından aktarılan dünya çapında bulunur ve bulaşıcı hastalıklar yaklaşık % 20 genel olarak1, ama etkili hesap ve çoğu bu patojenlerin karşı güvenli aşı mevcut değildir. Oransal ve hemen hemen tüm metazoans3 sağlık şekillendirme ve microbiome2, topluca bilinen komensal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmaların önemli rol anlayışımızı genişletiyor. Şimdi eklem bacaklılar vektörel çizimler patojenlerin Ayrıca gut microbiota liman ve çeşitli vektör kaynaklı patojenler4,5etkilemek için bu vektör ilişkili microbiota gösterilmiştir açıkça anlaşılmaktadır. Eklem bacaklılar microbiome eubacteria, Arkeler, virüsler, ökaryotik mikroplar gibi tek hücreli, nematodlar ve mantarlar6oluşur. Ancak, baskın araştırma odak eubacteria üzerinde nedeniyle, kısmen, işaretleyici genler ve belirli bakteriyel üyelerini tanımlamak için başvuru veritabanları kullanılabilirliğini olmuştur.
Ixodes scapularis, kene vektör Borrelia burgdorferi7, de dahil olmak üzere birden çok insan patojenlerin ile bir odak hastalığının Lyme hastalığı, bir mikrobiyal görselleştirme teknik optimizasyonu amaçlı yapıldı. kene gut microbiota vektör-patojen etkileşimleri bağlamında anlayışımızı geliştirmek. Kene microbiome alanında cevaplanması gereken birkaç soru kalır. Gut kene ve yatay olarak aktarılan patojenler bağlamında gelen patojen arasındaki ilk genişletilmiş karşılaşma sitesidir; Bu nedenle, vektör vektör-patojen etkileşimleri oransal olarak gut microbiota rolünün anlaşılması anlamlı yorumlara ortaya çıkaracaktır. Kene kan yemek sindirim, burada kan yemek bileşenleri alır işlenmesi intracellularly8yer benzersiz bir moduna sahip. Gut lümen görünüşte kene beslemeleri kan yemek içerecek bir gemi olarak hizmet vermektedir ve besin sindirim ve asimilasyon besleme birkaç gün doğmak ve sonrası repletion devam etmek. Kene tarafından besleme sırasında alınan patojenler gut lümen bloodmeal ile birlikte girin ve böylece lümen kene, patojen ve ikamet microbiota arasındaki etkileşimlerin birincil bir site olur. Sindirim repletion ve deri değiştirme iksodid kene ile devam ederken, gut yapısal ve işlevsel değişiklikler9uğrar. Kompozisyon ve gut bakteri mekansal organizasyonu değişen gut çevre ile uyum içinde değişebilir olasılığı mevcuttur. Bu, bu nedenle, yerleşik bakteri tamamen kene, patojen ve gut microbiota etkileşimi anlamak için kene gut mimarisini anlamak önemlidir.
Ana bilgisayar ilişkili microbiota rutin olarak açıklamak için moleküler teknikleri yükseltmek ve bakteriyel 16S ribozomal DNA (rDNA) sıra ile yüksek-den geçerek paralel sıralama stratejileri10 kullanmaktadır. Bu sıralama stratejileri aşmak gerek axenic belirli bakteri kültürleri elde etmek ve tüm bakteriyel Üyeler örnek temsil ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yine de, bu stratejileri bona fide sakinleri çevre contaminations ayırt etmek için yetersizlik tarafından şaşırmış. Ayrıca, örnekleri, keneler, küçük içinde büyüklük ve bu nedenle düşük microbiota özgü DNA içeren gibi değerlendirmek verir, çevre kirletici amplifikasyon olasılığı artan11 olduğunu ve belirsiz yorumlanmasında sonuçları microbiome kompozisyon. Bu nedenle, belirli uygun bakteri görselleştirme ile birlikte işlev karakterizasyonu tanımlamak ve kene microbiome geçici ve dağınık şekilde ayırt için önemli olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon kullandı. Bu teknik gen ifade desenleri, organ ve embriyo12,13,-14 değerlendirmek için rutin olarak kullanılan ve ilgi tüm örnek ifade semiquantitative analiz sağlar. Bu doku bölümleri kullanmak ve genellikle kesitli malzeme tüm organları15ifadede tahmin etmek için sayısal bir derleme ile geniş Analizi gerektirir geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri farklıdır. Burada bütün Dağı genelde bütün organizmalar12' ye anlamına gelir iken, Bütün Dağı bütün cesaret veya organları belirtir. Kene gut microbiota mimarisini değerlendirmek için bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon yaklaşımı kullanmanın yararları kesişmeyi. Kene gut boyutu16' değişen her çifti, divertikül, 7 çiftlerinden oluşur. Eğer bu divertikül arasında herhangi bir kene biyoloji, bağlamında anladım değil işlevsel farklılıklar microbiota veya kene-patojen etkileşimleri kene. Gut divertikül rüptürü manipülasyonlar, gut microbiota gut lümen veya gevşek gut microbiota kayma lokalizasyonu yanlış yorumlanmasına sonucu ile ilişkili mevcut yerinden. RNA in situ hibridizasyon floresans etiketli daha önce kene gut transkript17 sabitleme ve bireysel gut divertikül sonda hibridizasyon, B. burgdorferi yerelleştirmek üzere açma incelemek için kullanıldığında vardır transkript parafin gömülü tüm keneler18kesit tarafından. Bu her iki yaklaşımın gut microbiota mimari etkilerdi hibridizasyon önce kene dokuların manipülasyon gerektirir.
Bu raporda, Bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) kullanarak uygun kene gut microbiota incelemek için iletişim kuralı biz ayrıntılı olarak tarif. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon varlığı küresel bir anlayış ve belirli gut bakteri gut değişik bölgelerinde bolluk sağlar ve kene gut biyoloji patojen kolonizasyon bağlamında yeni görüşler teşvik ve iletim. Ayrıca, algılama kene gut uygun bakterilerin RNA probları karşı belirli bakteriyel RNA yönetmen kullanımına izin verir.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC-treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA from torula yeast</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Single stranded RNA ladder</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;#11 High-Carbon steel blades&amp;nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>DS-500E Digital Orbital shaker</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&amp;nbsp; documentation system</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Gel documentation system</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Light box</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Image capture software</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Image editing software&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&amp;nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Bulaşıcı hastalıklar eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından iletilen insan sağlığı dünya çapında önemli bir tehdit devam. Bu hastalıklar neden patojenleri yok yalıtım modunda vektör kolonize zaman; Bunun yerine, onlar büyük olasılıkla etkileşimleri gut lümen içinde ikamet mikroorganizmalar ile meşgul. Vektör microbiota patojen iletim birkaç vektör kaynaklı hastalıklar için önemli bir rol oynamak için kanıtlanmıştır. Ixodes scapularis kene, Borrelia burgdorferi, dahil olmak üzere birçok insan patojenleri vektör gut yerleşik bakteri kene iletim patojenlerin etkisi olup olmadığını tespit değil. Biz yöntemleri olası türler arası etkileşimler kene gut daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için kene gut ile ilişkili bakteriler bileşimi karakterize için gerektirir. Bütün Dağı in situ kullanarak özellikle bakteriyel tür ile ilişkili RNA transkript görselleştirmek için hibridizasyon bereket ile ilgili nitel veri toplama ve sağlam doku microbiota dağıtımını sağlar. Bu teknik değişiklikler gut microbiota ortamında besleme kene boyunca incelemek için kullanılan ve kene genlerin ifade analiz etmek için de uygulanabilir. Bütün kene boyama hedef RNA dokusunda üç boyutlu yeniden yapılandırma için gerek kalmadan brüt mekansal dağılımı hakkında verim bilgi cesaret ve kez sıralama tabanlı zihnimi karıştıran çevresel kirlenme tarafından daha az etkilenir karmaşık mikrobiyal topluluklar çalışma için sık kullanılan bir yöntem. Genel olarak, bu tekniği daha iyi kullanılabilmesi için değerli bir araç vektör-patojen-microbiota etkileşimleri ve hastalık iletim içindeki rolü anlamak olduğunu.

Ölçüm ve RNA probları kalitesinin tahmini boyama başlamadan önce kritik öneme sahiptir. Vitro transkripsiyon verimliliği yüksek miktar ve kalite meydana bağlıdır. Biz düzenli olarak RNA probları saflık ve sonda transkripsiyon reaksiyonlar tarafından oluşturulan miktarı doğrulamak için bir formaldehit jel üzerinde görüntülenir. Sondalar parlak, ayrı gruplar (Şekil 2) görünmesi gerekir. RNA konsantrasyon spektrofotometrik ölçümler jel bands görünümü ile de son derece sonda kalite göstergesidir ve ilişkili idi. Böylece, jel görselleştirme adım protokol ile aşinalık elde sonra istenirse atlanabilir. Her iki durumda da yeterli RNA yüksek kalitede üretilen tüm akış yönündeki adımlar sondalar sağlamlık bağlıdır gibi emin olmak önemlidir.
Bu teknik gücü varlığı ya da yokluğu bakteriyel türler, bereket kene akışları olarak zamanla bakterilerin ve yerelleştirme türlerin bütün doku içinde değişiklikler de dahil olmak üzere kene microbiota hakkında geniş gözlemler kolaylaştırmak olduğunu. Bu nedenle, iyisi ortalama bir fikir edinmek için koşul başına en az beş cesaret leke tutar ve dağıtım boyama içinde biraz değişme miktarı normal biyolojik çoğaltır arasında yanı sıra bireysel cesaret ister (Şekil 3), divertikül 7 çiftleri arasında boyama desen. Protokol genel başarısı her koşul için anlam ve antisens örnekleri boyama karşılaştırarak en iyi ölçülür. Anlamda örnekleri, analiz, bu tür için önemli negatif denetimleri mor renk (Şekil 4) için en az olmalıdır. Diğer taraftan, antianlamlı örnekleri hangi yoğunluğunu hedeflenmiş belirli bakteriyel transkript bereket on bağlı olacaktır en az arka plan ile sağlam boyama görüntülenmelidir. Boyama desen doku içinde de bu parametrelere göre değişir. Önemlisi, anlam ve antianlamlı örnekleri aynı süre için doğrudan bu örnekler paralel işlenmesi bu yüzden onları karşılaştırmak için geliştirilmelidir. Overdevelopment renk tepki arka plan boyama, anlam örnekleri antisens (Şekil 5) benzer başladığı yüksek miktarda neden olabilir. Gerçekleştiği bir kez tepki ters yolu olarak belirli iletişim kuralı bu aşamada overstaining, önlemek için özen gösterilmelidir.
Tüm cesaret tamamen her reaktif her adımı sırasında batık emin olmak önemlidir; değişim örnekleri arasında bir artış reaktifler düzensiz maruz olabilir. Tutarı zaman cesaret toplanan önce keneler beslenir da sonuçları üzerinde önemli bir etkisi vardır. Tartılı veya sadece 24 saat beslenir keneler ile çalışmak zor; cesareti vardı da daha kolayca zarar görebilir ve leke değil de (Şekil 6) ve bu yaklaşım şu anda bir kısıtlamadır. 48-72 saat için bu cesur cesaret için 24 h cesaret için daha sonra zaman puan beslenen keneler üzerinden karşılaştırıldığında daha büyük boyutu nedeniyle çalışmak en kolay beslenen keneler da büyük olasılıkla daha sonraki aşamaları o sırasında bakteriyel yük artışlar nedeniyle 24 h beslemeli keneler daha iyi lekeli f besleme. 72-h doku kez kan gelen kahverengi renk tonu hafif bir arka plan vardı ama mor boyama renk tonu (Şekil 4) üzerinde açıkça görülebiliyordu. Cesaretin en iyi düşük büyütmede (5 X veya 10 X) bir alan parlak mikroskop kullanarak tüm doku arasında boyama desenleri görüntülemek için görüntülenebilir. Bütün-dağ dokusu yüksek büyütmede gibi petrol amaç, X 63 görüntüleme amacı karşı slayt tuşuna basın ve doku örnekleri kalınlığı nedeniyle sıkıştırmak gibi doku zarar riski çalışır. Daha yüksek kararlılık düşsel isterseniz, doku kesit için potansiyel incelenmesi gerekir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig1.jpg"> Resim 1 . Sonda üretimi için şablon hazırlanması şematik. 16S rRNA amplicon T7 ve Sp6 Rehberleri içeren vektör klonlama bir TA kopyalayın. Siteleri bir veya b vitro transkripsiyon T7 veya Sp6 organizatörü duygusu veya antisens probları sırasıyla üretmek için kullanma için kesmek için enzimleri kullanarak yapı linearize. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig2.jpg"> Resim 2 . RNA yoklama jel elektroforez ile görselleştirme. RNA problar (~ 700 ng) UV ışık altında görüntülenir ve ticari bir jel görüntüleme sistemi kullanarak yansıma bir formaldehit özel jel, electrophoresed. Bir temsilci kaliteli, lane 1; ve kalitesiz RNA prob, lane 2.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig3.jpg"> Şekil 3 . 48 h beslemeli cesaret bütün-mount situ hibridizasyon temsilcisi bir bakış. Cesaret keneler üzerinden beslenen 48 h antisens RNA ile bir korunmuş 16S ribozomal RNA dizisine tamamlayıcı lekeli fark gut divertikül boyama gösterir. Ölçek çubuğu temsil eden 200 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig4.jpg"> Şekil 4 . Başarılı temsilcisi görüntüleri tüm- in situ hibridizasyon Ixodes scapularis cesaret içinde monte edin. Belirtilen süreyi için beslenen keneler gelen cesaret lekeli her iki anlamda (negatif kontrol) kullanarak veya antisens RNA sondalar. Antianlamlı probları korunmuş 16S ribozomal RNA dizisi (Evrensel 16S) veya belirli bir bakteriyel cins (belirtildiği gibi) belirli bir 16S RNA dizisi için tamamlayıcı. Enterokok değil sağlam 48 h'de ölçek çubukları temsil 140 µm. boyama verim <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig5.jpg"> Şekil 5 . Uzun süreli chromogenic reaksiyon zamanı yol non-spesifik boyama için. Bağırsaklar için 48 h beslenen keneler üzerinden bir anlamda RNA sonda veya bir antianlamlı sonda bir korunmuş 16S RNA dizisine tamamlayıcı probed. Doku reaksiyonu durdurmadan önce alkalen fosfataz substrat BM gecede 4 ° C'de ve oda sıcaklığında yaklaşık 4 h için mor ile inkübe. Ölçek çubukları temsil 140 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig6.jpg"> Şekil 6 . Bütün-mount situ hibridizasyon tartılı kullanarak veya 24 h beslenen kene cesaret. Cesaret tartılı veya 24 h beslemeli keneler üzerinden lekeli anlamda RNA problar kullanarak veya antisens probları korunmuş 16S RNA dizisi veya cins için belirli bir sıra için tamamlayıcı Rickettsia'nin. Antianlamlı örnekleri boyama sonraki zaman noktalarda gözlenen daha az sağlam ve cesareti de daha kolayca zarar görebilir. Ölçek çubukları temsil 60 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>Son konsantrasyonları</td>
			<td>Son pH</td>
			<td>Depolama notlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEMFA</td>
			<td>0,1 M BEZLERİ</td>
			<td>-</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2 mM EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1 mM magnezyum sülfat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>%3.7 formaldehit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS-ara (PTw)</td>
			<td>1 x PBS, % 0,1 ara-20</td>
			<td>7.0</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>% 0.1 ara-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Trietanolamin arabellek</td>
			<td>1 x PBS</td>
			<td>7.0-8.0</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,1 M trietanolamin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hibridizasyon arabellek</td>
			<td>% 50 formamide</td>
			<td>-</td>
			<td>-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>5 x SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1 mg/mL Torula RNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>100 µg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Denhart'ın çözüm x 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>% 0.1 ara-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>%0.1 DERİ PANTOLON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>10 mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Maleik asit tampon (MAB)</td>
			<td>100 mM Maleik asit</td>
			<td>7.0</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>150 mM sodyum klorür</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Alkalen fosfataz (AP) arabellek</td>
			<td>100 mM Tris</td>
			<td>9.5</td>
			<td>-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>50 mM magnezyum klorür</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>100 mM sodyum klorür</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>% 0.1 ara-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>5 mM levamisol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çamaşır suyu çözüm</td>
			<td>%1 hidrojen peroksit</td>
			<td>-</td>
			<td>Taze hazırlamak</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>%5 formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,5 x SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Yemek tarifleri iletişim kuralında kullanılan çözümler.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Video: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Floresan Reporter miktar tayini ile tüm organ patojen takibi

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Yazar Spotlight: Dokularda Antibiyotiklere ve Bağışıklık Sistemine Bakteriyel Tepkilerin Çözülmesi

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi

Mikrobiyal enfeksiyonların yüksek çözünürlüklü üç boyutlu tüm organ tomografisi