Yazarlar, teknik destek için Nicole Hasenkampf ve Amanda tardo teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr teşekkür ederim. Kılcal besleme yöntemiyle ilgili talimatlar için ıhlamur Hu ve Adriana Marques LeFlap muhafaza cihazı önerisi için, ve Dr Lise Gern. Bu çalışma NIH / NCRR Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) tarafından ve Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi ve hibe P51OD011104/P51RR000164 ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Araştırma Altyapı Programları Ofisi (OriP) tarafından desteklenmiştir.

Lyme hastalığı araştırma için hayvanlar üzerinde kene aşılama ve besleme deneysel taslağı Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1.. Aşılayarak Nymphal Ixodes B ile keneler Kılcal Tüp-besleme kullanarak burgdorferi Kene ile manipülasyonlar yaparken, elastik kollu, eldiven ve tek bouffant kapakları beyaz laboratuvar mont giyilir. <ol><li> Bizim teknik Broadwater ark. 49 tarafından bildirilen değiştirilmiş bir versiyonu. Bir pipet çektirmenin kullanarak kırma inceliği Pasteur pipetlerini ısıtma ve çekerek kılcal tüpleri hazırlayın. Forseps kullanma ve diseksiyon kapsamı, optimum çapı (yaklaşık 0.2 mm) için ipuçları bölünürler. Kene mouthpart boyutuna standart bir tüp, bir boyutlandırma kılavuz olarak kullanılır. Pipetlerini hazırlarken bir yüz maskesi giyilmelidir. </li><li> B&#39;yi büyüyecek BSK-H ortamı (Sigma) içinde 10 x con 2-8 7 / ml (orta log fazı) burgdorferi% 6 tavşan serumu yakıtını içerir. </li><li> 4-6 hafta sonrası larva dökücü için 23 ° C&#39;de saklanan nimf kenelerin kullanın. Yeri yemeğin dış alt yüzeyinde çift taraflı bant ile bir küçük 60 x 15 mm petri üzerine keneler. Yukarı bakacak keneler ventral tarafı yerleştirin. </li><li> B. içine kılcal boru ucu batırın Karıştırma sonrası burgdorferi kültür tüpü. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak kene ağız parçaları hypostome üzerinde kılcal tüpü yerleştirin. Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, yerinde tüp düzeltmek için döküm kil kullanın. </li><li> Çevreleme bir katma düzeyi için büyük bir saydam plastik küvet içinde yapıştırılmış kene ile petri kapları yerleştirin. Islak kağıt havlular nem temin etmek üzere ilave edilir. Defekasyon belirgin olana kadar 30 dakika-2 saat boyunca 37 ° C ısı inkübatör keneler yerleştirin. Bu spiroketlerine içeren ortam kene geçti gösterir. </li><li> Beslemeden önce kene çevreye uyum sağlamak için 23 ° C&#39;de 2-4 hafta boyunca keneler dinlendirinhayvanlar üzerinde onları. </li></ol> 2. B. Fareler bulaşmasını Kene tarafından burgdorferi <ol><li> , Steril su içinde ketamin stokları 1:10 seyreltin. Bir tüberkülin şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin 100 mg / kg, her fare anestezisi </li><li> Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, geri (Remington pürüzsüz ve ipeksi) elektrik düzeltici cezasına kullanarak orta kulakları fare tıraş. </li><li> Başka nesneler ile beyaz bir tavada yakın, fare tüysüz bölgeye nemli bir fırça ile nimf keneler (o liman B. burgdorferi) aktarın. Seçenek olarak ise, enfekte olmamış keneler şüpheli enfeksiyon ile farelerin xenodiagnosis için fareler üzerinde yerleştirilebilir. Kene yerleştirme için temiz, beyaz bir yüzey kullanımı herhangi bir bekâr kenelerin kolayca görülebilir sağlamak için yardımcı olur. </li><li> Uzman caging (Allentovvn Caging Allentovvn, PA) fare yerleştirin. Kafes Kafesin altından yükselen bir paslanmaz çelik ızgara oluşur. TO kafes üst altındaki fare serbest hareketine izin vermek için yeterince su şişesi tutucu yükseltmek bizim in-house makine atölyesi tarafından modifiye edildi. Pan tuzak su yaklaşık ½ inç fareleri (Şekil 3A) düşmek herhangi bir kene ile doludur. Fareler anestezi tamamen uyanmak kadar hipotermi riskini en aza indirmek için, mikro dalgada yeniden ısıtma pedleri, kullanımdan önce, kafeslere altına yerleştirilir. Anestezi ve gıda ve su tepsiler karşı ovmak kurtarmak gibi hayvanlar genellikle Ataksik, bu nedenle bu çıkarılmalıdır. Su seviyesi altında kalma farelerin bacaklarda önlemek için yeterince düşüktür. </li><li> Eklembacaklıların sürüklenmesini sağlamak için Arapsaçı tuzak macunu (Contech, Victoria, BC, Kanada) ve bant ile kaplı olan bir tepsinin içine kafes yerleştirin. Fareler tek başına kafesli ve anestezi süresince sürekli izlenir. </li><li> Fareler anestezi tamamen uyanık olduğunda 2 saat içinde, yemek tepsisi ve su şişesi kafese değiştirilir. 2 sonra4 saat, plastik bir kulübe ve Nylabone kapsayan muhafaza zenginleştirme değiştirilir. </li><li> 3, 4 ve 5 gün sonra, beslenen keneler için fare, kafes ve kafes suyunu kontrol edin. Kafes su (yani &quot;altın kaydırma&quot;) bir beyaz metal bir tavada elenirken. Beslenen temiz suyla durulayın keneler ve plastik kavanoz (Şekil 3B) saklayabilirsiniz. Günde 3 ve 4, temiz su ile kafes su değiştirin. 5. günde, kafes, ancak kene iyice fareyi sadece kontrol edin. Genellikle bu noktada bütün keneler beslenen ve fareler normal caging iade edilebilir. </li><li> Otoklav ve bertarafı için biyolojik tehlike kaplarda, sıvı içeren fare kafesleri, tüm atık yerleştirin. Fareler ve her zaman iyileşmiş yerleştirilen kenelerin sayısının bir günlük tutun. </li></ol> 3. B. Enfeksiyon için primatlarla üzerinde Keneler Besleme burgdorferi veya xenodiagnosis <ol><li> Kene tutma cihazını hazırlayın: 3 inç x 1 ¾ inç çaplı daire kesiniz3 inç LeFlap (flep) temiz bir neşter ve ölçüm kılavuzunu kullanarak. Biatane köpük ve Duoderm özdeş büyüklükte daireler kesmek için bir şablon olarak cut-out kullanın. Köpük, cilt yüzeyi üzerinde kanadı yükseltmek ve kene olası kırma önlemek için kullanılır. Duoderm yastıklama başka bir katman ekler ve kene kaçış eklenen güvenlik için çevreleme cihazın kenarlarını bindirmeleri. Tutucu cihazın bir diyagramı Şekil 4 de gösterilmiştir. </li><li> Veteriner personel kas içine enjeksiyon ile 5-8 mg / kg Telazol ile hayvan uyutmak olacaktır. </li><li> Büyüklüğü 40 bıçakları ile donatılmış elektrik trimmer (Oster) kullanarak hayvanın saç Klip. Ceket tarafından karşılanacaktır tüm alanlar kırpılmış vardır: sırt, ön, üst kollar. Tıraş kremi ve çift bıçak tek jilet kullanarak, yakından x 20 cm yatay, dikey, yaklaşık 25 cm&#39;lik bir alan tıraş. Nemli kağıt havlu ile silerek temizleyin ve cildi kuru düşük ısı ile kuru darbe. </li><li> T kapağı yerleştirino hayvanın sırtı sadece skapula altında, omurganın her iki tarafında yer alıyor. Bu noktada daire izlemek için bir kalem kullanın. SkinPrep ile silerek daire etrafında deri alanını hazırlayın. Bu tutkal ve muhafaza cihazları yapışmasını etkileyebilecek cilt yağı temizler. Daire çevresinde bir alan 1 cm çevresi boyunca bırakarak-4 sm bir genişliğe sahip deri yapıştırıcı (SkinBond) bir tabaka uygulanır. </li><li> Biatane köpüğü yapışkan destek çıkarın ve uygun bir noktada cilde yapıştırmayın. Hayvanlar daha 5 mg / kg Telazol veteriner personeli ile anestezi altına alınır. Cilt tutkal ve Hypafix bant ile kenarları mühür. Kanadın yapışkan destek çıkarın ve Biatane üstüne yapıştırın. LeFlap kenarlarında Hypafix bandı yerleştirin, daha sonra flep örgü kanadını aşağı bant ve hayvan üzerinde ceket yerleştirin. Bant ve Arapsaçı Trap macunu ilave güvenlik için insan olmayan primat caging çevreleyen bir çevre içinde kat uygulanır. </li><li> Chemic etkilerini en aza indirmek içinçevreleme cihaz yerde sonra kene beslenmeye Adım 3.4 kullanılan als, keneler 24 saat eklenir. Bu noktada, cihazın güvenlik de kontrol edilir ve gerekirse güçlendirilir. Tipik haliyle, 20 beslenmemiş nimfleri (4-8 hafta sonrası larval dökücü) bir fırça ile cihaz içinde deriye eklenir. </li><li> Kanadın ağdan yapışkan destek çıkarın ve yerine mühür. Son olarak, yapıştırıcı maruz Duoderm desteğini çıkartın, çevreleme cihazın üstüne yerleştirin. Açık örgü daire genelinde Hypafix bir parça bant ekleyin ve ceket değiştirin. Tamamlanmış tutucu aygıt Şekil 5A&#39;da gösterilmiştir. </li><li> 5 gün sonra, yukarıda olduğu gibi hayvanlar anestezi ve ceketler kaldırılır. Örgü (Şekil 5B) ile kene beslenmesini incelemek için ilk bandı çıkarın. Dikkatle uzak kanadın Duoderm soyun. </li><li> Keneler erişim sağlamak için kenarlarında gözenekli kısmını geri çekin. Fed keneler sıklıkla yakın veya altında bulunurKöpük daire (Şekil 5C) ve bir fırça ile çıkarılır ve temiz su yerleştirilir. Cihazı bir kez tüm görünür beslenen keneler toplanır (Şekil 5D) sökün. </li></ol> Not: Çoğu zaman, tutucu cihaz sadece uzak deriden sıyrılabilir. Yapışma güçlü ve potansiyel olarak cilde zarar olabilir, Unisolve çözgen uzaklaştırılması için hafif bir bölgeye uygulanır. Cilt izopropanol ile sildi ve keneler, 23 ° C&#39;de saklanır Enfeksiyonu için kullanılırsa, keneler B ihtiva numarayı onaylamak için ezilebilir burgdorferi. xenodiagnosis için kullanılırsa, keneler önceki midgut içeriklerinin analizi için 1-3 hafta boyunca tutulur.

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

O liman B. keneler elde etmek için alt çalışmaları için burgdorferi, keneler şunlar olabilir: (1) larva aşamasında enfekte olan fareler üzerinde beslenen, (2) B daldırıldı ya larva veya nimf aşamasında 48-burgdorferi kültürler; (3) B. microinjected burgdorferi 47, ya da (4) kılcal boru beslenen B. 49. burgdorferi. bu yöntemlerin her biri, kene büyük bir kısmının enfeksiyon liman B için kullan...

2011 yılında, Lyme hastalığı Kuzey Amerika&#39;da (6. en yaygın Ulusal Bildirimi zorunlu hastalık oldu <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi hem genetik ve antijenik (1 gözden), çok yönlü bir mikroptur. Onun genetik anayasa büyük (&gt; 900 kB) kromozomu içeren ve plazmid içerik izolatlar arasında değişen 21 plazmidler (12 doğrusal, dairesel 9), kadar. Çok plazmid açık okuma çerçevelerinin% 90 üzerinde bilinen herhangi bir bakteriyel dizilerine 2,3 ilgisiz olarak, bu spiroketlere öğrendim olmaktır. B. burgdorferi konak bağışıklık potansiyel hedefler olarak antijenleri geniş bir yelpazede sunar. Bununla birlikte, işlenmemiş bir enfeksiyon genellikle devam eder. Kene çevre ve omurgalı konak çevre ile spiroketlerine etkileşim B. tarafından alınmasını gerektirir Enfeksiyon süreci boyunca burgdorferi. Çeşitli plasmidle kodlanmışgenler farklı olarak sıcaklık, pH, hücre yoğunluğu ve kene ömrü 4-8, hatta aşamasında değişikliklere yanıt olarak ifade edilebilir olduğu bilinmektedir. B. Çalışma doğal yoldan neden olduğu enfeksiyona takip eden enzootik döngüsü boyunca burgdorferi adaptasyon ve konakçı tepkileri uygun hayvan modelleri üzerinde keneler beslemek için yeteneğine dayanır. Bu tür çalışmalar B. liman kenelerin üretme teknik zorlukları ile karşılanmaktadır burgdorferi ve modeli konak üzerinde kene verimli iletim ve / veya besleme sağlanması. Buna ek olarak, enfekte kenelerin tutucu ve geri gereklidir. Kullanılan modeller arasında farenin ve Lyme hastalığı araştırmalarında değerli bir araç olarak hizmet eder, her biri insan olmayan primatlar, bulunmaktadır. B için doğal bir rezervuar bir ana beyaz ayaklı fare gibi burgdorferi, laboratuvar fare B. tarafından kalıcı enfeksiyon destekleyen son derece duyarlı bir ana 9 burgdorferi. FolBöyle C3H suşu olarak hastalığa duyarlı farelerin enfeksiyonu lowing, spiroket cilt, mesane, kas, eklem ve kalp dahil olmak üzere birden dokulara yaymak. Neden olduğu enfeksiyona enflamatuar tepkiler hastalıklı kalp ve eklem dokusu yol açar. Spiroket bu ana inat ve bulaşıcı devam ederken, iltihabi lezyonlar değil insanlarda sürecinin aksine, aralıklı olabilir. Fare modeli böylece B. fazla bilgi vermiştir artrit ve karditis ve bağışıklık tepkileri dahil olmak üzere 10-12 ev burgdorferi kaynaklı patoloji,. Kene vektör 13-21 aktarım için bazı gerekli olması halinde patojenin açısından bakıldığında, farklı olarak memeli enfeksiyon sırasında ifade edilen bazı genlerin, karakterize edilmiştir. Çeşitli hayvan türlerinin Lyme hastalığı 22 incelemek için kullanılmış olmasına rağmen, rhesus macaques en yakın insan hastalığı 23&#39;ün çoklu organ karakter taklit eder. Diğer aksinehayvan modelleri, örneğin eritema migrans, Kardit, artrit ve periferal ve merkezi sinir sistemleri nöropati gibi hastalık belirtileri genişliği makaklarda gözlenmektedir. Farelerde, B. ana hazne erken ve geç-yaygın belirtileri nadir 9 iken burgdorferi, hastalık, fare zorlanma ve 24 yaş ile değişir. Buna ek olarak, diğer kemirgenler, Lagomorphs ve köpek her B&#39;den nörolojik hastalık sergilemek başarısız burgdorferi enfeksiyonu 25. Önemlisi, makaklar Lyme borreliosis, yani, erken lokalize, erken yaygın, ve geç evre Lyme hastalığının 26-28 her üç aşamadan karakteristik belirtileri gösterirler. Eritem migranlan (EM) insan vakalarının 29% 70-80 meydana düşünülmektedir, ve aynı zamanda rhesus makaklarda 28,30 görülür. Enfeksiyonu takiben spiroket çoklu organ inokülasyon sitesinden yaymak. Spirochetal DNA iskelet mu tespit edildiscles, kalp, safra kesesi, periferik sinir ve sinir ağı, hem de merkezi sinir sistemi (beyin, beyin sapı ve beyincik, omurilik ve dura mater) 31. Rezervuar yetkinlik 32-36 inceleyen ve B. çalışmalarda kene fareler üzerinde beslemek, kene kolonilerinin yayılması için bize ve diğer araştırma ekipleri tarafından kullanılmıştır burgdorferi 37-40 patogenezine. Bu teknik aynı zamanda xenodiagnosis ve farelerde 41-44 aşı etkinliğinin test edilmesi için kullanılmıştır. Biz Ixodes model geliştirme 28 için maymunları üzerinde kene beslenen, aşı etkinliği 45 bir çalışma, sebat ve sonrası antibiyotik tedavisine 46 değerlendirilmesinde xenodiagnosis için. O liman B. Keneler burgdorferi spiroket yaşam evrelerinde üzerinden iletilen olarak, enfekte fareler üzerinde larva besleme ve çalışmalar için perileri kullanılarak doğal bir enzootik döngüsü içinde muhafaza edilebilir. Bu rapordaBiz vahşi tip veya mutant B ile enfekte kene oluşturmak için nasıl talimat burgdorferi, kılcal tüp besleme kullanarak. Bu da mikroenjeksiyon ile 47 ve daldırma 48 ile gerçekleştirilebilir. B. yapay getirilmesi amacı keneler, kimin iletebilirliği bilinmeyen mutant suşlar çalışma olabilir, yüksek enfeksiyon oranı ile keneler bir grup oluşturmak için, ve bir temiz ve aksi bulaşmamış kene koloniyi koruyarak hata potansiyelini azaltmak için içine burgdorferi. Tutma ve dolu kenelerin iyileşme sağlamak için, böylece ek olarak,, fareler ve insan olmayan primatlar üzerinde kene besleme göstermektedir. Kene beslenmenin kullanımı B. bağışıklık tepkilerinin gelecek çalışmalar için gerekli olan burgdorferi enfeksiyonu, olası Lyme aşı etkinliği ve gizli enfeksiyonların tespiti için xenodiagnosis.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

Lyme hastalığı, Borrelia burgdorferi etken İletim, memeli bilgisayarlar üzerinde kene Ixodes türlerin eki ve kan beslenmesi ile oluşur. Doğada, bu zoonotik bakteriyel patojen rezervuar konak çeşitli kullanabilirsiniz, ancak beyaz ayaklı fare (Peromyscus leucopus) Kuzey Amerika&#39;da larva ve nimf keneler için birincil rezervuar olduğu. İnsanlar en sık B ile enfekte arızi ana nimf aşamasında. B. kene ısırması ile burgdorferi burgdorferi enzootik döngüsü boyunca onun ana uyarlar, böylece memeli konaklarda bu spiroketlerine ve bunların etkileri fonksiyonlarını keşfetmek yeteneği kene besleme kullanımını gerektirir. Buna ek olarak, (tespiti ve bulaşıcı bir maddenin geri kazanılması için doğal vektörü kullanılarak) xenodiagnosis tekniği şifreli enfeksiyonun çalışmalarda yararlı olmuştur. Elde etmek amacıyla nimf o liman B. keneler burgdorferi,Keneler kılcal tüpler aracılığıyla kültür canlı spiroketlerine beslenir. İki hayvan modelleri, fare ve insan olmayan primatlar, en çok kene besleme ilgili Lyme hastalığı çalışmaları için kullanılır. Biz, bu keneler üzerine beslenir ve enfeksiyon veya xenodiagnosis biri için hayvanlardan elde edilebilir olan yöntemleri göstermektedir.

Bu aktarım için hayvanlar üzerinde beslenir önce kılcal besleme tamamlanmasından sonra, keneler, genellikle 2-3 hafta boyunca 23 ° C&#39;de dinlenmiş. Kılcal-besleme tekniği kullanarak, beslenen% 90 üzerinde liman B. keneler bulduk burgdorferi. pozitif kenelerin yüzdesi yıkama ile tespit edilir daha sonra bir mikrofüj boru şeklindeki havan tokmağı ile steril PBS içinde onları ezme, peroksit ve etanol keneler. Orta bağırsak içeriği PBS içine dökülen slaytlar üzerinde sabit ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research at JoVE.com

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Lyme hastalığı Kuzey Amerika&#39;daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

feeding-ticks-on-animals-for-transmission-xenodiagnosis-lyme-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Görüntüleme.  Tulane University Health Sciences Center.  Lyme hastalığı Kuzey Amerika'daki en sık bildirilen vektör kaynaklı bir hastalıktır. Etkeni, Borrelia burgdorferi keneler kene ile bulaşan bir spioket bakteridir. Hayvan modellerinde enfeksiyonun İletim ve saptama burada açıklandığı kene besleme, kullanılmasıyla optimize edilir. 

Video: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

Keneler de RNA Girişim

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Pamuk Yeşilkurt bir densovirüs Host Fitness Host doku Dağılımı, İletim-modunu ve Etkisi incelenmesi için Protokoller

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

In Vitro Transcribed mRNA ile Primer Makrofajların Yüksek Verimli Transföytüsü

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...