Agradecemos sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Yale University, para proporcionar a utilização dos seus recursos de laboratório. Agradecemos ao Sr. Wu Ming-Jie excelente assistência técnica. EF é um investigador HHMI. Este trabalho foi apoiado por um presente do John Monsky e Jennifer Weis Monsky fundo de pesquisa de doença de Lyme.

1. elaboração de modelos de DNA
<ol><li>Download a sequência de 16S rRNA específica para cada gêneros bacterianos do NCBI design e banco de dados de cadeia polimerase (PCR) compatível para a frente e reverter as primeiras demão que vão amplificar regiões específicas de gêneros (~ 200-250 pares de base long), conforme descrito anteriormente 19. também referir os código-fonte aberto bancos de dados SILVA20,21 e probeBase22 recursos online para pontas de prova do oligonucleotide rRNA-alvo e primers, como sondas de RNA para alguns gêneros de bactérias podem ser comercialmente disponível. Nota: É importante selecionar regiões do gene que são específicos para específicos gêneros e certifique-se de que projetado primeiras demão não amplificar gêneros bacterianos relacionados. Isto é crítico para obter a hibridização da sonda de gêneros/gene-específico.</li>
	<li>Alimente os carrapatos para 24, 48 ou 72 h em ratos, dissecar a coragem de carrapato e preparar RNA e cDNA de guts carrapato como descrito anteriormente23. Uso de cDNA como modelo para PCR amplificar amplicons de gêneros específicos usando um thermocycler. Executar uma parte alíquota do PCR-produto/amplicon em um gel de agarose 1,5% e confirmar que o amplicon corresponde o tamanho esperado pela visualização sob luz ultravioleta (UV), usando um sistema de imagem de gel.</li>
	<li>Clone o bacteriano 16S RNA ribossomal amplicon de interesse em um vetor de TA comercialmente disponível (Tabela de materiais) contendo RNA polimerase promotores apropriados para polymerases do bacteriófago (SP6, T7 ou T3). Sequenciar os clones para confirmar a identidade do amplicon e a direcionalidade do clone em relação a cada um dos promotores. Com base nisso, determine que o promotor de escolha para gerar sentido ou RNA antisenso sondas (Figura 1).</li>
	<li>Linearizar 1 mg do plasmídeo com uma enzima de restrição apropriada em um volume de reação de até 30 µLfor 2 h à temperatura recomendada pelo fabricante. Escolha as enzimas de restrição baseadas o promotor que será utilizado para gerar o sentido ou antisentida sonda (Figura 1). Verifique se a linearização por visualização de 2 µ l de reação de síntese em um gel de agarose 1%.</li>
	<li>Purificar as restantes 28 μL de DNA digerido usando um comercialmente disponível kit de purificação de coluna de produto do PCR e quantificar a concentração de DNA por Espectrofotômetro. Nota: Algumas sondas de sentido podem causar coloração de fundo muito maior do que a sonda antisentida correspondente e outras opções podem precisar de ser explorado. Controles negativos alternativos incluem plasmídeos codificação sequências não representadas na amostra ou outra sonda que produz um padrão distinto de hibridização.</li>
</ol>2. construção de sondas de RNA Digoxygenin-UTP
<ol><li>Prepare a mistura de nucleótidos combinando 7,5 µ l de 100mm UTP, 25 µ l de 10mm digoxygenin-UTP e 10 µ l de cada de 100mm ATP, GTP, CTP e num tubo de centrífuga 1,5 mL.</li>
	<li>Executar em vitro transcrição usando comercialmente disponível T7 ou Sp6 RNA polimerase kits, usando 1 µ l da mistura do nucleotide (passo 2.1) e 0,25 - 1 µ g do modelo de DNA. Trazer o volume até 20 µ l com água. Agite o tubo para combinar e rotação do pulso. Incube a 37 ° C para 2,5-3 h. Nota: A construção da sonda foi bem sucedida com plasmídeo digerido concentrações tão baixas quanto 7 ng / µ l, mas concentrações típicas a esta distância de passo de 15-25 ng / µ l. A reação de transcrição pode também ser incubada durante a noite a 37 ° C, mas isto não aumenta significativamente o rendimento de RNA.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de DNase (2.000 unidades / µ l) e incubar a 37 ° C por 10 min. Não exceda 10 min, ou a enzima pode começar a degradar o RNA.</li>
	<li>Adicione 30 µ l de cloreto de lítio gelada 7,5-8 M e 30 µ l de água livre de nuclease refrigerada para precipitar o RNA. Agite o tubo para misturar. Permitir que a precipitação do RNA para prosseguir durante a noite a-20 ° C.</li>
	<li>Recolher o RNA por centrifugação a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar o sedimento com 1 mL de etanol a 75% acabadas em água de pyrocarbonate (DEPC) dietílico e, em seguida, repita a centrifugação.</li>
	<li>Remover e descartar o sobrenadante, inverter o tubo em uma toalha de papel limpa e deixe para secar por 10 min. resuspenda o pellet em água livre de nuclease. Se o pellet é facilmente visível, resuspenda em 25 µ l. Se o sedimento é muito pequeno ou não visível, Ressuspender em 15-20 µ l. obter uma estimativa da concentração de RNA por Espectrofotômetro. Nota: RNA típica concentrações variam de 200-500 ng / µ l.</li>
</ol>3. visualização do RNA sondas pela electroforese do Gel do RNA formaldeído para avaliar a pureza de RNA
Cuidado: Formaldeído representa um risco de inalação; Portanto, gere as soluções necessárias para a análise do gel do RNA em uma coifa. Brometo de etídio é um suspeito cancerígeno; Manuseie com cuidado.
<ol><li>Prepare um gel de agarose 1% formaldeído como descrito anteriormente24 e lançar o gel em uma caixa de gel livre de RNases. Legal, uma vez que preencha a caixa de gel com 1x tampão (1 x MOPS em pH 7,0, 5% de formaldeído) em execução.</li>
	<li>Prepare o tampão de amostra (5 µ l 400 mg/mL o brometo de ethidium, 20 µ l 10 x MOPS, 35 µ l formaldeído e 100 µ l formamida). Combine 2 µ l de sonda RNA (passo 2.6) com 8 µ l de tampão de amostra. Incube a 70 ° C durante 10 min.</li>
	<li>Prepare RNA carregando Buffer combinando glicerol 50% de 5 mL, 1 mL 10% de formaldeído, 40mg de bromofenol, 40mg xileno cianol e 20 µ l de EDTA 0,5 M (pH 7,5). Após o uso, guarde esse buffer a-20 ° C.</li>
	<li>Adicionar 3 µ l de tampão de carregamento para a amostra de RNA de passo 3.2 e misture. Manter os tubos de amostra no gelo.</li>
	<li>Carrega o volume de toda a amostra de passo 3.4 no gel. Carrega uma alíquota de escada de single-stranded RNA ao lado para verificar o tamanho do RNA. Funcione o gel a 100 V ou baixe até o corante azul migra aproximadamente 75% da descida do gel. Visualize o RNA sob luz UV, usando um sistema da imagem latente do gel. Nota: Uma sonda de RNA de boa qualidade deve aparecer como uma banda discreta com uma mobilidade correspondente para o tamanho esperado da sonda (Figura 2, faixa 1). Se a sonda aparece como uma banda difusa e manchada com (Figura 2faixa 2) e que isso não deve ser usado.</li>
</ol>4. escala Gut coleção e fixação
<ol><li>Colete Ixodes scapularis ninfas que alimentaram em ratos para os pontos de tempo de interesse. Nota: Para efeitos desta técnica, carrapatos alimentados por 48 ou 72 h trabalho melhor.</li>
	<li>Disse o intestino do carrapato em MEMFA (tabela 1) em uma corrediça de vidro sob um microscópio de dissecação, evitando danos ao órgão, tanto quanto possível. Coloque uma marca em uma corrediça do microscópio limpa em 20-30 µ l de MEMFA. Usando um par de alto-carbono lâmina de barbear estéril aço #11 fatia da região da cabeça com o escudo do tique-taque, deixando o corpo do carrapato. Pressione suavemente o corpo para empurrar os divertículos de intestino e glândulas salivares para fora a cutícula do corpo. Separar as glândulas salivares e intestino e colher as entranhas sobre a lâmina de barbear.</li>
	<li>Colete a coragem em um tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l MEMFA. Incubar o tubo em temperatura ambiente com balanço suave por 1h ou overnight a 4 ° C. Nota: As glândulas salivares do carrapato também e podem ser dissecadas e similarmente manchadas.</li>
	<li>Desidrate o tecido lavando suavemente 3 vezes com 1 mL de etanol a 100% gelada. Deixe a coragem afundar naturalmente para o fundo do tubo entre cada lavagem, centrifugação pode danificar o tecido. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras em etanol 100% a-20 ° C.</li>
</ol>5. construção de malha amostra cestas e titular da cesta 24-poço
<ol><li>Corte a parte de baixo de 2 mL ou 5 mL tubos de centrífuga de agarrar-parte superior usando uma lâmina de barbear com arestas único aquecida em um bisturi. Cuidado: A lâmina pode precisar de ser reaquecido várias vezes antes de terminar o corte.</li>
	<li>Corte quadrados de uma malha de nylon 110 µm ligeiramente maior do que a nova abertura do tubo. Bond a malha para o fundo do tubo, pressionando-os juntos levemente em um prato quente em fogo médio-baixo até que seja feita uma boa vedação. Deixe esfriar, garantir que não haja lacunas entre a malha e o tubo e corte malha em excesso em torno das bordas.</li>
	<li>Faça furos na tampa de uma placa de 24 tal que o lábio do cesto de amostra feita no passo 5.2 irá sentar-se no buraco e não cair, rendendo uma armadilha onde as partes inferiores das cestas amostra se sentará lá em poços quando eles são colocados na buracos na capa.</li>
	<li>Use este suporte de cesto montado para transferir cestas de uma placa para outra com relativa facilidade para a totalidade do protocolo em situ da hibridação. Use duas placas de 24 poços, para que enquanto uma incubação ocorre, a outra chapa é preparada para a próxima lavagem.</li>
</ol>6. hibridação in Situ : dia 1 (tempo: 4-5 h)
<ol><li>Coragem de transferência de rotulado cestas de amostra, separados por condição experimental e se destina a sonda de RNA. Nota: Mancha de pelo menos 5 coragem por condição para contabilizar a variação natural entre repetições.</li>
	<li>Hidratar as amostras com cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar no tecido, gradualmente aumentando a proporção de fosfato-salino com 0,1% de tensoativo não-iônico (PTw; A tabela 1) para etanol nas lavagens. Nota: Complete todos os lava no suporte do cesto 24-bem à temperatura ambiente com agitação suave a menos que indicado o contrário. Alíquotas de 500-600 µ l das soluções de lavagem em cada poço do titular tal que coragem em cada cesto está completamente submersos. Prepare todas as soluções com água tratada DEPC para prevenir a degradação de RNA.<ol>
<li>Lave as amostras por 5 min em 500 µ l 100% de etanol.</li>
		<li>Preparar pelo menos 500 µ l por cesta de amostra de 75%, 50% e 25% de etanol no PTw. Re-hidratar as amostras por lavagem por 5 min em cada solução de etanol, movendo-se para o mais baixo da maior concentração de etanol.</li>
		<li>Lave as amostras 4 vezes por 5 min cada no PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize as amostras com Proteinase K (10 µ g/mL) no PTw por 5 min.</li>
	<li>Prepare o tecido para a hibridização com as sondas de RNA.<ol>
<li>Lave as amostras duas vezes como descrito em 6.2 no suporte do cesto 24-bem à temperatura ambiente com agitação suave por 5 min em buffer de trietanolamina 500 µ l (0,1 M, pH 7.0-8.0) (tabela 1) para manter as amostras em um ambiente livre de amina.</li>
		<li>Tratar as amostras duas vezes com 500 µ l 0,25% ácido acético anidrido no buffer de trietanolamina (0,1 M, pH 7.0-8.0) por 5 min cada e, em seguida, lavar as amostras duas vezes no PTw por 5 min cada. Nota: O anidrido acético acetylates aminas gratuito para neutralizar a carga positiva, que é fundamental para evitar interações eletrostáticas não-específica e certifique-se de ligação específica da sonda para mRNA.</li>
		<li>Corrigir a coragem por 20 min com paraformaldeído de 4% 500 µ l no PTw e, em seguida, lavar 5 vezes no PTw por 5 min cada.</li>
		<li>Prehybridize por incubar as amostras em 500 µ l hibridização /in reserva o titular 24-bem cesta em prato bem 24 (tabela 1) para o 1,5-2,5 h a 60 ° C com agitação suave em um tremendo banho de água. Salve o tampão de hibridização, usado para a etapa de prehybridization para reutilizar no protocolo 2 dia (passo 7.1).</li>
		<li>Prepare soluções de hibridização da sonda diluindo-se sondas de RNA em tampão de hibridização para uma concentração final de 1 µ g/mL.  Incubar amostras com soluções de hibridização da sonda no suporte do cesto 24-bem a 60 ° C com agitação suave durante a noite em um tremendo banho de água (tabela 2). Cobrir a placa carregando o titular cesta confortavelmente com folha de alumínio para evitar a evaporação da solução de hibridação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. hibridação in Situ : dia 2 (Timing: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Remover as amostras de soluções de hibridização da sonda e colocá-los para o buffer de hibridização reservada do dia anterior. Incube a 60 ° C, com agitação suave para 3 min. Nota: Soluções de hibridização da sonda podem ser armazenadas a-20 ° C para reutilização até 3 vezes.</li>
	<li>Prepare 2 x tampão citrato de sódio-solução salina (SSC), diluindo 20 x SSC na água tratada DEPC (tabela 1). Lavar as amostras, duas vezes por 3 min com 2 x SSC e, em seguida, 3 vezes por 20 min com 2 x SSC a 60 ° C para remover todos os vestígios de buffer de sonda e hibridação.</li>
	<li>Tratar com RNase A (20 µ g/mL) e RNase T1 (10 µ g/mL) em 2x SSC por 30 min a 37 ° C para remover único encalhado sonda RNA representando livre não-hibridizadas RNA.</li>
	<li>Lave uma vez com 2 x SSC por 10 min à temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por diluição 2 x SSC na água tratada DEPC, Então lave duas vezes com 0.2 x SSC por 30 min a 60 ° C para remover o excesso RNases.</li>
	<li>Lave duas vezes com 500 µ l de tampão de ácido maleico (MAB; A tabela 1) para cada 10 min.</li>
	<li>Incube as amostras com bloqueio de solução (2% bloqueio reagente no MAB) para 1,5 a 2 h. Nota: O reagente de bloqueio pode ser difícil de dissolver; aquecimento suave auxilia a dissolução.</li>
	<li>Substitua a solução bloqueio anti-Digoxigenina alcalina fosfatase-conjugado 500 µ l do anticorpo a uma diluição de 1:3,000 em solução de bloqueio e incubar à temperatura ambiente por cerca de 4 h ou a 4 ° C durante a noite.</li>
</ol>8. hibridação in Situ : dia 3 (Timing: 6 h durante a noite)
<ol><li>Lave as amostras de pelo menos 5 vezes por 30 min cada com 500 µ l MAB para remover o excesso anticorpo. Nota: Estas lavagens são flexíveis e podem ser prorrogadas para h 1-2, ou 3-4 lavagens podem ser substituídas por uma lavagem durante a noite a 4 ° C, com impacto mínimo sobre a eficácia.</li>
	<li>Lave duas vezes por 5 min com buffer de fosfatase alcalina, pH 9.5 (tampão de AP; A tabela 1).</li>
	<li>Começa a reação de cor, substituindo a última lavagem com 500 µ l de substrato cromogênico para fosfatase alcalina (Tabela de materiais). Cobrir a placa da amostra com papel alumínio e deixe a coloração proceder à temperatura ambiente por 3 - 5 h ou durante a noite a 4 ° C. Monitore periodicamente a reação de coloração, exibindo o tecido sob um microscópio dissecação para evitar overstaining. Nota: Quando a coloração é completa, uma tonalidade roxa é detectável pelo olho nas amostras antisentido-sondado sob o microscópio, mas o tecido não devem tornar-se muito escuro. Coloração prossegue lentamente a 4 ° C e pode demorar até 20-24 h.</li>
	<li>Parar a reação de cor por lavagem por 5 min em 500 µ l do MAB, em seguida, corrigir o tecido durante a noite em solução de Bouin. Atenção: Lidar com a solução do Bouin em uma coifa; é um carcinógeno corrosivo.</li>
</ol>9. hibridação in Situ : dia 4 (Timing: 3-3.5 h)
<ol><li>Preparar pelo menos 7 mL por cesta de amostra de 1 x SSC por diluição 20 x SSC na água tratada DEPC. Remover a solução do Bouin por lavar as amostras de 4 a 6 vezes com etanol 70% em 1 x SSC até que o tecido não é mais amarelo.</li>
	<li>Preparar 500 µ l por cesta de amostra das soluções de etanol 75%, 50% e 25% em 1 x SSC. Lave as amostras por 5 min em cada solução, movendo-se da maior concentração de etanol para a mais baixa para Re-hidratar o tecido. Lave duas vezes por 5 min cada 1 em x SSC.</li>
	<li>Incube as amostras na solução de água sanitária (tabela 1) para 90 min em uma mesa de luz em uma coifa. Nota: Este passo permite que qualquer pigmentação na coloração da solução de Bouins a ser removido ou amostras e aumenta o sinal de sonda para visualização clara.</li>
	<li>Lavar as amostras duas vezes com 500 µ l de 1 x SSC por 5 min.</li>
	<li>Realocar as entranhas com danos mínimos, invertendo-se o cesto de amostra num poço de uma nova placa de 24 e lavagem com etanol 70% através do fundo de malha usando uma pipeta de transferência. Armazenar a-20 ° C, se necessário.</li>
	<li>Para obter uma visão geral dos padrões de coloração de amostras múltiplas, como mostrado na Figura 3,, manter a coragem em etanol a 70% no 24-placa e vista com qualquer microscópio de campo claro. Para examinar a coragem individual sob um microscópio de campo claro, conforme mostrado na Figura 4, Figura 5, e Figura 6, montar a coragem em 100% glicerol sob as lamelas. Use uma espátula de plástico para manipular suavemente o tecido com danos mínimos. Nota: A alta viscosidade do glicerol ajuda a proteger o tecido de danos por compressão e permite o posicionamento cuidadoso dos divertículos, tais que o tecido pode ser visto de forma otimizada em ampliações.</li>
	<li>Capturar imagens no microscópio usando software de captura de imagem específica do microscópio (Tabela de materiais) e exportar como Tiff imagens para uma software de edição de imagem genérica. Para quantificar as diferenças relativas de coloração entre os tratamentos experimentais, baixe um software de análise de imagem genérico (Tabela de materiais). Abra a imagem dentro do software de análise e siga as instruções dentro do software para medir a intensidade do pixel da coloração e computar parcelas de histograma da coloração.</li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces.">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+and+&amp;#34;All-species+Living+Tree+Project+(LTP)&amp;#34;+taxonomic+frameworks.">The SILVA and &amp;#34;All-species Living Tree Project (LTP)&amp;#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization.">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).</li><li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Este é o primeiro uso de uma técnica de hibridização (WMISH) toda a montagem em situ para estudar a microbiota de um vetor de artrópodes de patógenos. Nosso protocolo foi adaptado de um usado para estudar o desenvolvimento em Drosophila e em embriões de rã25,26. Toda a montagem do RNA em situ hibridização tem sido usada rotineiramente para localizar transcritos do gene espacialmente e temporalmente27 e ...

Humanos e gado patógenos transmitidos por artrópodes são encontrados em todo o mundo e representam cerca de 20% das doenças infecciosas globalmente1, mas eficaz e seguras vacinas contra a maioria desses patógenos não estão disponíveis. Nossa compreensão do importante papel dos microorganismos comensais, simbióticos e patogénicos, conhecidos coletivamente como o microbiome2, na modulação e moldar a saúde de quase todos os metazoários3 está se expandindo. Agora é evidente que os artrópodes vetores de patógenos também abrigam a microbiota do intestino e estes microbiota associada vetor foram mostrados para influenciar diversos patógenos vetor4,5. O artrópodes microbiome é composto de eubacteria, archaea, vírus e micróbios eucariontes como protozoários, nematoides e fungos6. No entanto, o foco de investigação predominante tem sido em eubacteria devido, em parte, à existência de genes marcadores e bancos de dados de referência para identificar membros bacterianos específicos.
Com foco em Ixodes scapularis, o vetor de escala de vários patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi7, o agente causador da doença de Lyme, a otimização de uma técnica de visualização microbiana visava melhorar a nossa compreensão da microbiota do intestino carrapato no contexto das interações de vetor-patógeno. Várias questões permanecem para ser respondida no campo microbiome carrapato. O intestino é o local do primeiro encontro estendido entre o carrapato e o patógeno recebido no contexto de patógenos transferidos horizontalmente; Portanto, compreender o papel da microbiota do intestino vector em modulação interações vetor-patógeno irá revelar ideias significativas. Carrapatos têm um modo exclusivo de digestão da refeição de sangue, onde o processamento de farinha de sangue componentes leva intracelular Coloque8. O lúmen do intestino, aparentemente, serve como um recipiente para conter a refeição de sangue como os feeds de carrapato e assimilação e digestão de nutrientes ensue ao longo de vários dias de alimentação e continuam repletion pós. Os patógenos adquiridos pelo carrapato durante a alimentação entram o lúmen do intestino junto com a farinha de sangue e o lúmen torna-se assim um local principal de interações entre o carrapato, patógeno e microbiota residente. Como digestão prossegue através do repletion e carrapato Ixodid muda, o intestino sofre alterações estruturais e funcionais9. A composição e a organização espacial das bactérias do intestino também é susceptível de variar em concerto com o meio de intestino a mudança. É, portanto, importante compreender a arquitetura de bactérias residentes no intestino carrapato para compreender inteiramente a interação de carrapato, patógeno e microbiota do intestino.
Técnicas moleculares para descrever a microbiota associado anfitrião rotineiramente utilizam estratégias de sequenciamento paralelo elevado-throughput10 para amplificar e sequência de ADN ribossómico de 16S bacteriano (rDNA). Estas estratégias de sequenciamento contornar a necessidade de obter axénica culturas de bactérias específicas e fornecer uma descrição detalhada de todos os membros bacterianas representada na amostra. No entanto, tais estratégias são confundidas pela incapacidade de distinguir as contaminações ambientais de residentes de bona fide . Além disso, quando avaliar amostras, tais como carrapatos, que são pequenos em tamanho e, portanto, contenham baixa microbiota específica DNA produz, a probabilidade de amplificação dos contaminantes ambientais é o aumento de11 e resulta na interpretação ambígua de Microbiome composição. Caracterização funcional em conjunto com a visualização de determinadas bactérias viáveis, portanto, será fundamental para definir e discernir a microbiome do tique-taque, temporalmente e espacialmente. Para atingir este objectivo, aproveitamos a toda a montagem do RNA em situ da hibridação. Esta técnica é usada rotineiramente para avaliar padrões de expressão de genes em embriões e órgãos12,13,14 e permite análise semiquantitativa de expressão ao longo de toda a amostra de interesse. Isso difere do tradicional em situ hibridização as técnicas que utilizam cortes de tecido e muitas vezes exigem extensa análise do material seccionado com uma montagem computacional para prever a expressão em todo os órgãos15. Enquanto toda a montagem geralmente se refere a toda organismos12, aqui toda a montagem refere-se a toda coragem ou órgãos. As vantagens de usar a conjunto de montagem do RNA em situ hibridização abordagem para avaliar a arquitetura da microbiota do intestino de carrapato são múltipla. O intestino do carrapato é composto de 7 pares de divertículos, cada par variando em tamanho16. As diferenças funcionais, se algum, entre esses divertículos, não são compreendidas no contexto da biologia de carrapato, assinale a microbiota ou carrapato-patógeno interações. Manipulações do intestino que rompem os divertículos de intestino deslocaria a microbiota presente no lúmen do intestino ou os associados frouxamente o intestino e resultar em erros de interpretação da localização espacial da microbiota. Fluorescência-etiquetada do RNA em situ hibridização tem sido utilizada anteriormente para examinar o carrapato intestino transcrições17 fixação e abrindo divertículos de intestino individuais para garantir a hibridização da sonda e localizar b. burgdorferi transcrições secionando parafina toda carrapatos18. Ambas essas abordagens exigem manipulações dos tecidos carrapato antes da hibridização que afetaria a arquitetura de microbiota do intestino.
Neste relatório, descrevemos em detalhe o protocolo para examinar a escala viável gut microbiota usando toda a montagem em situ da hibridação (WMISH). O uso de toda a montagem do RNA em situ da hibridação permite um entendimento global da presença e abundância de bactérias do intestino específicas nas diferentes regiões do intestino e pode estimular novos insights sobre biologia de intestino carrapato no contexto da colonização do patógeno e transmissão. Além disso, a utilização de sondas de RNA dirigida contra RNA bacteriano específico permite a detecção de bactérias viáveis no intestino carrapato.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC-treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA from torula yeast</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Single stranded RNA ladder</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;#11 High-Carbon steel blades&amp;nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>DS-500E Digital Orbital shaker</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&amp;nbsp; documentation system</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Gel documentation system</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Light box</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Image capture software</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Image editing software&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&amp;nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Doenças infecciosas transmitidas por vetores artrópodes continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana em todo o mundo. Os patogénios causadores dessas doenças, não existem isoladamente quando colonizam o vetor; em vez disso, eles provavelmente se envolvem em interações com microorganismos residentes no lúmen do intestino. A microbiota do vetor tenha demonstrada que desempenham um papel importante na transmissão de patógeno para várias doenças transmitidas por vetores. Se bactérias residentes no intestino do carrapato Ixodes scapularis , o vetor de diversos patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi, influenciam a transmissão de carrapato de patógenos não é determinado. Precisamos métodos para caracterizar a composição das bactérias associadas com o instinto de carrapato para facilitar uma melhor compreensão dos potenciais interações entre espécies no intestino carrapato. Usando toda a montagem em situ hibridização Visualizar transcritos de RNA associados a determinada espécie bacteriana permite a recolha de dados qualitativos sobre a abundância e a distribuição da microbiota no tecido intacto. Esta técnica pode ser usada para examinar as mudanças no meio de microbiota do intestino ao longo da escala de alimentação e também pode ser aplicada para analisar a expressão de genes de carrapato. Coloração de carrapato todo coragem rendimento informações sobre a distribuição espacial bruta do alvo do RNA no tecido sem a necessidade de reconstrução tridimensional e é menos afetada pela contaminação ambiental, que muitas vezes confunde o sequenciamento baseado métodos frequentemente utilizados para o estudo de comunidades microbianas complexas. Em geral, esta técnica é uma ferramenta valiosa que pode ser usado para melhor compreender a microbiota-vetor-patógeno interações e seu papel na transmissão da doença.

A medição e avaliação da qualidade das sondas RNA são essenciais antes de iniciar a coloração. In vitro a transcrição eficácia depende altamente a quantidade e a qualidade do modelo de DNA. Nós rotineiramente visualizado as sondas de RNA em um gel de formaldeído para verificar a pureza e a quantidade de sonda gerada pelas reações da transcrição. As sondas devem aparecer como bandas brilhantes, discretas (Figura 2). Espectrofotométric...

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Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K visualizações.  Yale University School of Medicine. Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.

Vídeo: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Imunologia e Infecção

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Rastreamento de patógenos de órgãos inteiros por meio de quantificação fluorescente de repórter

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor em destaque: Desvendando as respostas bacterianas aos antibióticos e ao sistema imunológico nos tecidos

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Resumo

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In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Visualização de candida albicans no trato gastrointestinal murina usando fluorescente in situ hibridização

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas