Merkel Hücreli Poliomavirüs enfeksiyonu için ilk hücre kültürü modelini sunduk. Protokol dermal fibroblastların izolasyonunu, MCPyV virüs enfeksiyonunun hazırlanmasını, immünororesan boyamayı ve floresan in situ hibridizasyonunu içerir. Bu protokol, viral genlerin aşırı ekspresyonu ile ilişkili eserlerkaçınArak MCPyV enfeksiyöz döngüsü ve konak hücreleri ile etkileşimleri çalışma mümkün kılar.
Başlamak için, insan yenidoğan sünnet derisi yağ ve deri altı doku kesmek için makas bir çift kullanın. Cilt örneğini yarıya veya dörtte kesin. Antibiyotik-antimikotik ile desteklenen mililitre dis tabanlı II NPBS başına 10 miligram 5 mililitre doku yerleştirin.
Bir gecede 4 derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün, 10 santimetrelik bir çanakta epidermisi dermal tabakalardan dikkatlice ayırmak için mikrodisese forceps kullanın. Ortaya çıkan dermal dokuyu, antibiyotik-anitmikotik ile desteklenen FBS içermeyen orta alanda mililitre başına 2 miligram lık 5 mililitre lik konik tüpe aktarın.
Sadece birkaç makroskopik doku agregaları kalana kadar, dört ila altı saat boyunca periyodik sallayarak% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece de örnek kuluçka. Bundan sonra, dermisten tek hücre bırakarak, numune çözeltisini 10 kez yukarı ve aşağı inip çıkarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Santrifüj 180 g beş dakika ve supernatant atın.
Tamamlayıcı DMEM ortamında ayrışmış hücreleri plakalayın. Geç öğleden sonra veya akşam, tohum 6 milyon 293TT28 hücreleri 10 santimetre çanak takviye DMEM orta içeren içine. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.
Ertesi sabah, hücrelerin yaklaşık %50 konfluent olduğundan emin olun, sonra 66 mikrolitre transfeksiyon reaktifi, 12 mikrogram yeniden bağlanan MCPyV R17B DNA'sını izole edin, 8.4 mikrogram ST ekspresyonu plazmid pMtB ve 9.6 mikrogram LT plazmid pADL ile hücreleri dönüştürün. Hücreleri bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, transfected hücreler neredeyse confluent olduğunda, hücreleri trypnize ve genişlemeye devam etmek için 15 santimetrelik bir çanak aktarın.
Bu çanak neredeyse confluent hale geldiğinde, üç yeni 15 santimetre yemekleri içine hücreleri aktarın. Bu yeni yemekler neredeyse confluent hale geldiğinde, metin protokolünde belirtildiği gibi hücreleri hasat. Beş dakika oda sıcaklığında 180 g santrifüj.
Sonra supernatant çıkarın ve DPBS magnezyum bir hücre hacmi ekleyin. 25 mikromolar amonyum sülfat ekleyin, ardından %0.5 Triton X-100, %0.1 benzonaz ve ATP'ye bağımlı DNAE'nin %0.1'i gelir. İyi bir şekilde karıştırın ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, 15 dakika buz üzerinde karışımı soğutun. Sonra, sodyum klorür 0.17 hacim ekleyin. Karıştırın ve 15 dakika daha buz üzerinde kuluçkaya yat.
Santrifüj 12 bin g 4 santigrat derecede 10 dakika. Supernatant net değilse, yavaşça tüp ters ve santrifüj tekrarlayın. Bundan sonra, yeni bir tüp için supernatant aktarın.
0,8 mol sodyum klorür ile desteklenen 1 dpbs hacminde peleti yeniden askıya alın. Santrifüj 12 bin g 4 santigrat derecede 10 dakika. Supernatant net değilse, yavaşça tüp ters ve santrifüj tekrarlayın.
10 dakika boyunca dört santigrat derece de 12 bin g tekrar iki supernatants ve santrifüj birleştirin. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi ince duvarlı beş mililitrelik poliallomer tüpler içine iodixanol gradyanları yatırmak için bir pipet kullanın. Hazırlanan iodixanol gradyan üstüne açıklık virüs içeren supernatant 3 mililitre yükleyin.
Santrifüj bir SW 55 Ti rotor ile 234 bin g ve 16 derece santigrat 3,5 saat, hızlanma ve yavaşlama yavaş ayarlamak için emin olun. Ultracentrifugation tamamlandıktan sonra, silikonlu tüpler 12 fraksiyonları toplamak. Muhafaza ve hücreleri ayırmak sonra, çanak için eklenmiş DMEM ve F12 orta 10 mililitre.
Hücre çözeltisini 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Santrifüj 180 g iki dakika. Supernatant atın ve mililitre başına 20 bin ila 40 bin hücre arasında bir hücre yoğunluğu nda eklenmiş DMEM ve F12 ortamda hücreleri yeniden askıya.
Daha sonra, tohum 200 veya 400 hücre süspansiyon mikrolitre bir 24 veya 96 iyi plaka her kuyuiçine kollajenaz tip IV mililitre başına 1 miligram ile desteklenir, sırasıyla. MCPyV viron stoğunu eksi 80 derece santigrat derin dondurucudan çıkarın ve çözülmek için buza yerleştirin. Enfekte olmak için her 2500 ila 5000 hücre için iodixanol bir mikrolitre başına MCPyV virions 1 milyar viral genom eşdeğerleri ekleyin.
Plakanın yan tarafına hafifçe dokunun ve %5 karbondioksit le 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın. İlk olarak, 10 dakika pbs% 4 PFA ile kapak fişleri üzerine hücreleri düzeltmek, sonra PBS ile iki kez kapak fişleri yıkayın ve hücreleri permeabilize etmek için dört derece santigrat gecede% 70 etanol ile tedavi. Ertesi gün, etanol yerine prob hidrasyon tamponu koyun ve numuneleri önceden hibridize etmek için 60 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Melezleme öncesi kuluçka süresinin bitiminden 30 dakika önce, prob hibridizasyon çözeltisindeki probları 1:500 seyreltme ve 45 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkalar tamamlandığında, pipet her kapak kayma için bir mikroskop slayt üzerine seyreltilmiş prob karışımı yaklaşık 10 mikrolitre. Her kapak kayma hücre tarafı aşağı hibridizasyon karışımı kendi damlacık üzerinde yerleştirin.
Kauçuk çimento liberal bir miktar kullanarak, kenarları ve arka her kapak kayma slayt için mühür. Bir ısı bloğunun düz tarafında slayt ayarlayın ve üç dakika boyunca 94 derece santigrat ısıtın. Bundan sonra, bir nemlendirilmiş odasına slayt aktarın ve 45 santigrat derece bir gecede onları kuluçka.
Ertesi gün, dikkatle kauçuk çimento soymak için forceps kullanın. Kapak kayar hücre tarafını 24 kuyu plakasının kuyularına yerleştirin ve oda sıcaklığında üç kez sonda yıkama tamponu ile yıkayın. Her kuyuya 200 mikrolitre amplifikasyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika kuluçkaya yatırın.
Bu arada, anneal her iki etiketli oligonükleotid saç tokaları 90 saniye boyunca 94 derece santigrat ısıtın ve daha sonra 30 dakika oda sıcaklığına onları soğutma tarafından ayrı PCR tüplerde probları tanıyan. 1:50 bir seyreltme amplifikasyon tampon birlikte saç tokaları karıştırın. Daha sonra, amplifikasyon reaksiyonu için bir yüzey yapmak için 12 kuyu plaka kapağı açık yüzü üzerinde streç parafin film.
Pipet 50-100 mikrolitre saç tokası karışımı damlacıkları her kapak kayma için parafin film üzerine. Forseps kullanarak, ön amplifikasyon çözeltisinden her kapak fişini dikkatlice çıkarın ve kenarına kuruması için gözenekli bir silmeye dokunun. Bir amplifikasyon damlatma üzerine aşağı her kurutulmuş kapak kayma hücre tarafı yerleştirin.
Tabak kapağını nemli bir odaya aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 24 kuyu plaka kuyularına kapak fişleri dönün. Her kuyuya mililitre başına 0,5 mikrogram konsantrasyonda DAPI içeren 5X SSCT ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, örnekleri oda sıcaklığında 5X SSCT ile iki kez yıkayın. Yıkanmış kapak kaymalarını mikroskop slaytlarına monte edin ve hücreleri analiz etmek ve örnekleri görüntülemek için ters floresan mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, insan dermal fibroblastların neredeyse homojen bir popülasyon izole edilmiştir.
İmmünofloresan boyama izole insan dermal hücrelerinin yaklaşık% 100 pozitif dermal fibroblast belirteçleri, vimentin ve kollajen için lekeli olduğunu ortaya koymaktadır, ancak insan foreskin keratinosit marker K14 için negatif. McPyV virions sonra oluşturulur ve degrade çekirdeğinde yoğunlaşmış MCPyV virions bant görselleştirildikten sonra, 500 mikrolitre kesirler toplanır ve MCPyV qPCR pik kesirleri tanımlamak için yapılır. MCPyV ile enfekte HDF'lerin immünüffloresan lekeli görüntüleri burada gösterilmiştir, LT pozitif olan hücreler, VP1 pozitif, ya da hem LT hem de VP1 pozitif MCPyV enfeksiyonu için pozitif olarak kabul edilir.
Hücrelerin %30'undan fazlası LT pozitif, %10'dan fazlası VP1 pozitiftir. Enfekte hücrelerde çoğaltılan MCPyV genomları hem HCR-DNA FISH hem de Immunofluorescent-HCR-DNA FISH kullanılarak tespit edilir. HCR-DNA FISH çoğaltma fabrikasında bulunan MCPyV DNA lokalizasyonunu ortaya çıkarırken, İmmünfloresan-HCR-DNA FISH yöntemleri hem MCPyV DNA'sının hem de LT proteininin çoğaltma merkezlerinde eş zamanlı olarak algılanmasını sağlar.
En iyi virüs enfeksiyonu verimliliğini elde etmek için, iodoxanol hücreler için toksik olduğundan, MCPyV mikrolitre başına en az 2 x 10 ila 8 virüs genomu konsantre olması çok önemlidir. Dermal fibroblastların MCPyV enfeksiyonundan sonra immünoresans, immünblokaj, immünopozitivicasyon ve qPCR bazlı test gibi birçok moleküler biyolojik analiz yapılabilir. Tarif ettiğimiz enfeksiyon sistemi, araştırmacıların nükleer insan ticareti ve viral paketleme gibi MCPyV enfeksiyonunun evrelerini incelemelerini mümkün kılıyor.
MCPyV bir BSL-2 virüsüdür, ancak laboratuvar ortamında elde edilen miktarlarda patoloji potansiyeli hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, araştırmacılar virüse maruz kalmamak için önlemler almalıdır.
