Name: in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples at JoVE.com

Bu eser Ödülü tarafından finanse edildi yok. OCE-1323652 Ulusal Bilim Vakfı okyanus bilimi doktora sonrası Bursu ve Ödülü no.1012629 Burroughs Wellcome Fonu doktora sonrası zenginleştirme programı aracılığıyla.

1. parafin kaldırılması
Dikkat: bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>İnce kesitli parafin Katıştırılmış slaytlar ile % 100 ksilen Coplin kavanozların 10 dk içinde başlık altında dewax. Ksilen plastik erir olarak plastik Coplin kavanoz, kullanmayın. Bir otoklav kullanmadan önce Coplin kavanozlarda sterilize.</li>
	<li>Aşağıdaki dört steril cam Coplin kavanoz hazırlamak: % 100 etanol, % 80'i etanol, % 70 etanol ve % 60 etanol. Etanol RNase free suyla seyreltik.<ol>
<li>10 dakikadır onları emmek ve steril cam Coplin % 100 etanol ile slaytlar transfer. 10 dk sonra cam Coplin boş ve yeni % 100 etanol ile değiştirin. Slaytları 10 min için tekrar ıslatın.</li>
		<li>Slaytları steril cam Coplin kavanoza 1 dk. için % 80 etanol ile aktarın.</li>
		<li>Slaytları steril cam Coplin % 70 etanol için 1 dk ile aktarın.</li>
		<li>Slaytları steril cam Coplin kavanoza 1 dk. için % 60 etanol ile aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA sonda hibridizasyon hazırlanması için slaytların Önarıtma
<ol><li>Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında, aşağıdaki yıkar gerçekleştirin. Oda sıcaklığında yıkar bir orbital çalkalayıcı yavaş hızda gerçekleştirin. Steril slayt postaları slaytları yıkama için en çok beş slaytlar için oda ile birlikte kullanın.</li>
	<li>Slaytlar ile 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 18 mL steril slayt mailler aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>1 x PBS dökün ve hemen sonda penetrasyon dokusunun etkinleştirmek için İndinavir K bulunan slaytlarda doku tedavi. Yaklaşık 18 mL İndinavir K çözeltisi slayt mailler eklemek (çözüm konsantrasyonu çalışmak için bkz. Tablo 1 ). 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya. Sallama.<ol>
<li>Slaytları kuluçka iken, prehybridization arabellek (Prehybe arabellek) hazırlayın. Prehybe arabellek 10 dakika kaynar su banyosu içinde yer, o zaman bir buz banyosu 5 min için serin. Prehybe arabellek tarifini bkz. Tablo 1.</li>
		<li>Sindirim İndinavir K tepki dışarı İndinavir K eriyik dökerek durdurmak ve hemen slayt mailler için 18 mL % 0,2 glisin-PBS çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için oturup slayt mailler izin.</li>
		<li>% 0,2 glisin-PBS solüsyonu dökün ve her slayt mailler için 18 mL 2 x Serum sodyum sitrat (SSC) çözeltisi ekleyin. Slaytları 2 yıkama x SSC 100-150 rpm'de sallayarak ile 10 dakika oda sıcaklığında.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. prehybridization slayt RNA sonda hibridizasyon için hazırlık
<ol><li>Slaytları 2 ile yıkanır iken x SSC, yeni bir steril slayt mailler alın ve yaklaşık 18 mL Prehybe arabelleği slayt mailler koymak. Slayt mailler hibridizasyon hibridizasyon sıcaklık fırında yerleştirin. Not: Hibridizasyon sıcaklık genellikle 50-60 ° c arasında değişmektedir ama kullanılan sonda göre değişir</li>
	<li>2 x SSC yıkama tamamlandığında, 2 x SSC ve yere dökmek Slaytları Slayt mailler Prehybe arabellek için 1s hibridizasyon fırında içinde.</li>
</ol>4. hibridizasyon RNA sonda
<ol><li>Slaytları hibridizasyon fırın Prehybe arabelleği ile kuluçka iken, hibridizasyon-sonda çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Her sonda hibridizasyon arabelleği (24.5 µL hibridizasyon arabelleği ile inceleyebilirsek 0.5 µL) oranında seyreltin. Not: Tarifi hibridizasyon arabellek için Tablo 1' de bulunur. Sonda hazırlık ve konsantrasyonları örneği-ebilmek bulunmak içinde Traylor Knowles vd. 11.</li>
		<li>12 dk bir 86-90 ° C ısı blokta seyreltilmiş sonda yer, o zaman buz üzerinde 1 dk. için serin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slayt mailler hibridizasyon Fırından çıkarın ve tek tek slaytlar steril Cımbız kullanarak slayt mailler kaldırın. Düz kağıt havlu üzerinde slaytlar yatıyordu ve dikkatle doku örnekleri geçici aşırı Prehybe arabellek yok etmek. Örnekleri, dokunmak dikkatli olun ve iş hızlı doku örnekleri kurutma önlemek için.</li>
	<li>Doku PAP kalemle çevreler. Bir pipet ile seyreltilmiş sonda çözümün 25 µL uygulamak ve bir plastik coverslip ile örnek kapak.<ol>
<li>Örnekleri slayt nem odası ile 4 x SSC + % 50 formamide çözüm içinde belgili tanımlık dip odasının yerleştirin.</li>
		<li>Probları tüm slaytlara eklendikten sonra slayt nem odası hibridizasyon hibridizasyon sıcaklık 50-60 ° c en az 24 saat fırında yerleştirin Kuluçka süresi sonda konsantrasyonu bağlı olarak değişebilir ama en az 24 saat olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seyreltilmiş probları ile gece kuluçka sonra slayt nem odası hibridizasyon Fırından çıkarın.<ol>
<li>Coverslips doku yerinden değil dikkatli olmak slaytların herbirinden kaldırın. 1000 µL pipet 1000 µL 2 x SSC çözüm ekleyin ve slayt nazikçe yıkayın.</li>
		<li>Slayt 18 mL oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC çözeltisi ile steril slayt mailler yerleştirin. Solüsyonu dökün ve eski yerine koymak o ile 18 mL taze 2 x SSC. Kuluçka nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 5 min için tekrar.</li>
		<li>2 x SSC solüsyonu dökün. 1 x SSC çözüm ve 5 min için yıkama 18 mL oda sıcaklığında ekleyin. 1 x SSC solüsyonu dökün ve eski yerine koymak o ile 18 mL taze 1 x SSC. Kuluçka nazik sallayarak ile Oda sıcaklığında 5 min için yineleyin.</li>
		<li>1 dökmek x SSC. 18 mL 0.5 x SSC ve 10 min için yıkama 42 ° C'de sallayarak olmadan ekleyin. SSC ve Değiştir x 0.5 dökmek 18 mL taze 0,5 ile x SSC. Tekrar sallayarak olmadan 42 ° C'de 10 dakika yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA sonda görselleştirme
Not: sonda görüntülenmesi için BM mor geliştirme süreci sırasında kullanılır. Ancak, bu adımdan önce birkaç yıkama için boyama örnekleri hazırlamak için gereklidir.
<ol><li>Olmadan MgCl2 1 dk. AP-tampon MgCl2olmadan dökmek ve 18 mL 1 x Boehringer-Mannheim engelleme arabellek Maleik asit tampon ile seyreltilmiş ekleyin slaytlar alkalen fosfataz arabelleği (AP-tampon) 18 mL ile yıkayın. Nazik sallayarak ile bir slayt mailler içinde oda sıcaklığında en az 1 h için kuluçkaya. Not: Boehringer-Mannheim engelleme tampon ve kullanılan Maleik asit tampon erken ve kazmak yıkama ve blok arabellek ayarla satın (mevcut ticari olarak).<ol>
<li>Alternatif olarak, kuluçka gecede 4 ° C'de gerçekleştirilir. Artık bu engelleme bir süre belirsiz bağlama görünümünü azaltmak olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seyreltilmiş kazmak anti-digoxigenin-AP Fab parçaları 20 mL hazırlamak (Anti-kazmak antikor Anti-kazmak antikor + 20 mL 1 x Boehringer-Mannheim engelleme arabellek 2 µL =). Bu 1 Plastik slayt mailler kullanımda yeterli olur. Birden fazla slayt mailler kullanılacak ise bu çözüm daha fazla hazırlanmalıdır.</li>
	<li>Anti-kazmak antikor yeni bir steril slayt mailler ekleyin ve Slaytları Slayt mailler Anti-kazmak antikor çözüm ile aktarın. Nazik sallayarak ile 3 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka sonra anti-kazmak antikor dökmek ve Slaytları Slayt mailler AP-tampon 18 mL MgCl2 nazik sallayarak ile 5 min için olmadan ile yıkayın.</li>
	<li>AP-tampon MgCl2, olmadan dökmek ve AP-tampon 18 mL ekleyin. Nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. 5 dk kuluçka sonra AP-tampon dökün, eski yerine koymak o ile 18 mL taze AP-arabelleği ve nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Karanlıkta, AP-tampon dökmek ve BM mor 18 mL slayt mailler için ekleyin. Slayt görüntüleme için her ½ h. tepki süreleri değişir mor renk geliştirme geliştirilmektedir prob dayanarak denetleniyor karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya. Not: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) ve nitro mavi tetrazolium (NBT) kullanarak BM mor görselleştirme yerine geliştirme çözümü yapılabilir. Yönergeler için bkz: Tablo 1 .</li>
	<li>Renk geliştirme Tris-EDTA (TE) arabelleği karanlık oda sıcaklığında 5 min için 18 mL ile yeni bir steril slayt mailler için slaytları aktararak durdurmak.</li>
	<li>TE tampon dökün ve slayt mailler ve karanlıkta 1 dk. için yıkama 18 mL RNase free su ekleyin.</li>
	<li>Slaytları sudan çıkarın ve kuru onları dokuyu kenarlarda. Ve coverslips yer Orta montaj gliserol ekleyin. Resimler alınacak hazır olana slaytlar 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+economic+damage+of+climate+change+on+global+coral+reefs.">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li><li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification.">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742 (2007).</li><li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development.">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).</li><li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss.">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).</li><li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora:+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa.">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).</li><li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family.">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li><li>Darby, I. A., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization protocols. , (2006).</li><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization. , (1987).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals.">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li><li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900 (2013).</li><li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation.">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).</li><li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li><li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+(Leucoraja+erinacea).">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).</li><li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için açıklanan yöntemi tıbbi ve evrimsel gelişim araştırma8,9,10,12,17önceki işten değiştirildi. Bu iletişim kuralı bir in situ hibridizasyon nüansları korunmuş ve parafin içinde gömülü yetişkin mercanlar üzerinde kazmak etiketli RNA Anti-anlamda sonda ile odaklanır. Bu yöntem ayrıca parafin gömülü olan mercan ...

Mercan çoğu kritik ekosistem inşaatçılar ve okyanus ve insan sağlığı1,2,3' te biyoçeşitlilik için önemli. İklim değişikliği ve diğer antropojenik stres nedeniyle tehdit altında olduklarını ve birçok mercan türünün kritik tehlike altında olarak kabul edilir. Böylece, mercan stres altında tanılamak hücresel ve moleküler araçları için önemli bir ihtiyaç vardır. Ayrıca, orada az nerede genler yetişkin mercan doku ve bu genlerin fonksiyonları bu nedenle küçük anlayışı içinde ifade edilir hakkında anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için sık kullanılan insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi, parafin gömülü doku örnekleri yetişkin mercanlar üzerinde kullanım için in situ hibridizasyon (ISH) protokolü adapte olması. Isı stres maruz gibi stresli bir olay geçiren yetişkin mercanlar üzerinde kullanıldığında en güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknik çok çeşitli doku ve mercan hayat aşamalarında kullanılan ve sadece ısı vurguladı mercan4,6,7için sınırlı değildir. Ayrıca, orada olduğu sürece cDNA sırası bilgi kullanılabilir Bu teknik dokular veya herhangi bir metazoan hücreleri üzerinde kullanılabilir.
Bu yöntemin amacı RNA probları yetişkin mercan doku korunmuş ve parafin içinde gömülü ve slaytlar kesitli içinde görselleştirmek etmektir. Bu yöntem, nükleik asitler yetişkin mercan doku içinde görselleştirme sağlar güçlü bir tanı aracıdır. Başlangıçta bu yöntem tıbbi teşhis için geliştirilmiş ve beri alanlarda gelişim biyolojisi ve evrimsel gelişim biyolojisi8,9,10gibi popüler bir araç haline gelmiştir. ISH da kritik, özellikle sigara modeli sistemlerinde, genomik zaman yöntemidir ve transcriptomic sıra veri mevcut ancak kayma gen ifade desenleri bilinmemektedir. Hangi hücre ve dokuların bir gen ilgi hızlı ve daha fazla hedefli tedavi yaklaşımları8,9,10' aaçabilir belirtebilirsiniz tanılama iş için model olmayan sistemlerde, bu teknik güçlü çünkü, 11,12. Son olarak, bu teknik nitel ve nicel gen ifadesi verileri11ile eşleştirilmiş durumdayken daha güçlü olur.
Bu makalede özetlenen yaklaşım zaten bir digoxigenin (kazmak) tasarladık araştırmacılar için ilgi olacaktır-RNA sonda (anlam ve antisens probları) ve are şimdi bir örnek probları in situ hibridizasyon gerçekleştirmek için hazır etiketli. Bu yöntemi gerçekleştirmek için iki seri bölümler parafin mercan doku test edilen her sonda için gerekli olacaktır. Bir bölümü anlamda sonda diğeri antianlamlı sonda kullanılacaktır. Anlamda sonda non-spesifik bağlama belirtmek için bir kontrol olacak. Boyama anlamda soruşturma görülmektedir, faiz RNA için belirli antianlamlı sonda tek değil. Probları ifade herhangi bir gen için tasarlanabilir. Bu protokol için birkaç örnek daha önce mercan ısı stres sırasında ifade edilecek bulunan kullanılmıştır: FBJ fare osteosarkom viral onkogen homolog B (Fos-B), aktivatör protein (AP1) ve tümör nekroz faktör reseptör 41 (TNFR 41)11. KAZMAK etiketli RNA problar kullanarak ISH kullandıklarında daha fazla daha güvenli10olduğundan radyoaktif problar kullanarak üzerinden tercih edilir. Buna ek olarak, bu teknik son derece hassas ve çok çeşitli doku ve ısı vurguladı yetişkin mercan13,14,15,16ötesinde embriyo üzerinde gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Denhardt&#039;s solution</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Slide mailers</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide white apex superior adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS solution, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

Mercan genel okyanus sağlığı hem de insan sağlığı için önemlidir önemli okyanus omurgasızlar vardır. Ancak, yükselen okyanus sıcaklıklar ve okyanus asitleştirme gibi insan etkileri nedeniyle, mercan giderek tehdit altında vardır. Bu sorunları çözmek için hücre ve moleküler biyoloji gelişmeler mercan sağlık tanılamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. İnsan tıpta çok kullanılan tekniklerden bazıları değiştirme tedavi ve mercan kaydetmek için araştırmacıların yeteneği büyük ölçüde artırabilirsiniz. Bu sorunu çözmek için öncelikle insan tıp ve evrimsel gelişim biyolojisi kullanılan in situ hibridizasyon için bir protokol yetişkin mercan stres altında kullanmak için adapte edilmiştir.
Bu yöntemin amacı bir RNA sondayı parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan doku içine kayma ifade görselleştirmek etmektir. Bu yöntem parafin ve rehydration örnek kaldırma, ön örnek, öncesi hibridizasyon kuluçka, RNA sonda hibridizasyon ve RNA sonda görselleştirme geçirgenliği sağlamak için örnek üzerinde odaklanır. Sigara model organizmalar nerede belirli genlerin ifade edilir ve protokol diğer sigara model organizmalar için kolayca adapte edilebilir keşfetmek için kullanırken bu güçlü bir yöntemdir. Öncelikle nitel, çünkü ifade yoğunluğu görselleştirme adım ve sonda konsantrasyonu sırasında harcanan zamanı miktarına bağlı olarak değişebilir ancak, yöntem sınırlı olmamasıdır. Bu iletişim kuralı-ebilmek almak ilâ 5 gün (ve birçok durumda daha uzun) kullanılan sonda bağlı olarak Ayrıca, sabır, gerekmemektedir. Son olarak, non-spesifik arka plan boyama yaygındır, ama bu sınırlamanın üstesinden gelebilir.

Bu iletişim kuralı tamamlandıktan sonra hücreleri ve RNA sonda ilgi ifade eden dokular elde edilecektir. Bu iletişim kuralı için temsilcisi fark AP-1, FosB ve TNFR41 için sonuçlarıdır. Bu sonuçlar, daha önce Traylor Knowles ve ark. tarafından yayınlandı 11, ısı stres maruz kaldılar yetişkin mercanlar üzerinde gösteri kayma ifade RNA'ın sondalar. İki farklı boyama türü örnekleri Şekil 1' de sunulmak...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples at JoVE.com

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

in-situ-hybridization-techniques-for-paraffin-embedded-adult-coral

Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K Görüntüleme.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. Bu iletişim kuralı, parafin içinde gömülü ve cam slaytlar kesitli yetişkin mercan örnekleri in situ hibridizasyon gerçekleştirileceği hedeftir. Bu bir RNA Anti-anlamda prob dokulara parafin katıştırılmış uzamsal ifade görselleştirmek için kullanılan bir nitel yöntemidir.

Video: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Modlu Optik Mikroskopi Yöntemleri Caribbean Reef Yapı Mercanlar içinde Polip Doku Morfoloji ve Yapı Göstermektedir

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Çevre

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Nörobilim

Kanser Dokusu Örneklerinde Onkojenik Etkenler için FISH Analizinin Geliştirilmesi

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

Yazar Spotlight: Kanser Örneklerinde Hassas Gen Amplifikasyon Değerlendirmesi için Bir Araç Olarak FISH

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Kanser Araştırmaları

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Gelişim Biyolojisi

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biyoloji

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Situ Parafin gömülü yetişkin mercan örnekleri için hibridizasyon teknikleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Modlu Optik Mikroskopi Yöntemleri Caribbean Reef Yapı Mercanlar içinde Polip Doku Morfoloji ve Yapı Göstermektedir

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme

Tüm Dağı

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

RNA

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon