Name: in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
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Este trabalho foi financiado pelo prêmio nenhum. OCE-1323652 através da no.1012629 nacional Science Foundation oceano ciência Postdoctoral Fellowship e prêmio da Burroughs Wellcome fundo pós-doutorado programa de enriquecimento.

1. remoção da parafina
Atenção: Execute as seguintes etapas sob uma coifa.
<ol><li>Dewax os slides fino-seccionado de parafina com xilol 100% sob o capô em potes de vidro Coplin por 10 min. Não use frascos plásticos de Coplin, xileno derrete o plástico. Esterilize os frascos de Coplin em autoclave antes de usar.</li>
	<li>Prepare-se quatro frascos de Coplin de vidro estéril com o seguinte: etanol 100%, 80% de etanol, etanol 70% e 60% de etanol. Dilua o etanol com água livre de RNase.<ol>
<li>Transferir os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com 100% de etanol e embeba-os por 10 min. Depois de 10 min, esvaziar o copo de Coplin e substitua por nova 100% de etanol. Mergulhe os slides novamente por 10 min.</li>
		<li>Transferi os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com 80% de etanol por 1 min.</li>
		<li>Transferi os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com etanol a 70% por 1 min.</li>
		<li>Transferi os slides para a jarra de Coplin vidro estéril com etanol 60% por 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pré-tratamento de Slides para preparação de hibridização da sonda RNA
<ol><li>Execute as lavagens seguintes à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. Realize lavagens de temperatura em um agitador orbital a uma velocidade lenta. Use utentes slide estéril com espaço para até cinco slides para a lavagem dos slides.</li>
	<li>Transferi os slides para um mailer slide estéril com 18 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS). Lavagem por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Despeje a PBS 1x e tratar imediatamente o tecido nos slides com proteinase K, para permitir a penetração da sonda do tecido. Adicionar aproximadamente 18 mL de solução de proteinase K ao mailer slide (ver tabela 1 para trabalhar a concentração da solução). Incube a 37 ° C por 15 min. Não agite.<ol>
<li>Enquanto os slides estão incubando, prepare o prehybridization buffer (Buffer de Prehybe). Coloque o Buffer de Prehybe em um banho de água fervente durante 10 minutos e, em seguida, deixe esfriar sobre um banho de gelo por 5 min. Para uma receita de Prehybe de Buffer, consulte tabela 1.</li>
		<li>Parar a digestão da reação de proteinase K derramando a solução de proteinase K e imediatamente adicionar 18 mL de solução de glicina-PBS de 0,2% para o mailer de slide. Deixe o mailer slide sentar-se à temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Deite fora a solução de glicina-PBS de 0,2% e adicionar 18 mL de solução de citrato de sódio salina (SSC) 2 x para mailer cada slide. Lave os slides no 2 x SSC por 10 min à temperatura ambiente, com agitação em 100-150 rpm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. prehybridization de Slides em preparação para a hibridização da sonda RNA
<ol><li>Enquanto os slides estão sendo lavados com 2 x SSC, obter um novo mailer slide estéril e colocou o mailer slide aproximadamente 18 mL de tampão de Prehybe. Coloque o mailer slide no forno na temperatura de hibridização hibridização. Nota: A temperatura de hibridização dependerá da sonda a ser usada, mas geralmente varia de 50-60 ° C.</li>
	<li>Concluída a lavagem de 2 x SSC, despeje o 2x SSC e lugar os slides dentro o mailer slide no Buffer de Prehybe o forno de hibridização por 1h.</li>
</ol>4. hibridização da sonda RNA
<ol><li>Enquanto os slides estão incubando com o Buffer de Prehybe no forno da hibridação, prepare a solução de hibridação-sonda.<ol>
<li>Dilua cada sonda em tampão de hibridização (0,5 µ l de sonda com 24,5 µ l de tampão de Hibridização). Nota: A receita para o tampão de hibridização encontra-se na tabela 1. Um exemplo de preparação de sonda e concentrações pode ser encontrado em Traylor-Knowles et al 11.</li>
		<li>Coloque a sonda diluída em um bloco de calor de 86-90 ° C por 12 min e, em seguida, deixe esfriar por 1 min no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover o mailer slide do forno de hibridização e retire slides individualmente o mailer de slide usando uma pinça estéril. Coloque os slides sobre uma toalha de papel e cuidadosamente Limpe o excesso de Prehybe de Buffer ao redor as amostras de tecido. Tenha cuidado para não tocar as amostras e trabalho rapidamente para impedir a secagem das amostras de tecido.</li>
	<li>Cercar o tecido com uma caneta PAP. Aplicar 25 µ l de solução diluída de sonda com uma pipeta e cobrir a amostra com uma lamela de plástico.<ol>
<li>Coloca as amostras na câmara de umidade de slide com 4 x SSC + solução de formamida 50% na parte inferior da câmara.</li>
		<li>Depois de sondas foram adicionadas a todos os slides, colocar a câmara de umidade de slide no forno hibridização pelo menos 24 h a uma temperatura de hibridação de 50-60 ° C. O tempo de incubação pode variar dependendo da concentração da sonda, mas deve ser por um período mínimo de 24 horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a incubação durante a noite com as sondas diluídas, remova a câmara de umidade de slide do forno de hibridização.<ol>
<li>Remova as lamelas de cada um dos slides, tomando cuidado para não deslocar o tecido. Em uma pipeta de 1000 µ l, adicionar 1000 µ l de solução de x SSC 2 e delicadamente lave o slide.</li>
		<li>Coloque o slide em um mailer slide estéril com 18 mL de solução de x SSC 2 por 5 min à temperatura ambiente. Deite fora a solução e substituí-lo com 18 mL de fresco 2 x SSC. Repeti a incubação por 5 min à temperatura ambiente com agitação suave.</li>
		<li>Despeje a solução de x SSC a 2. Adicione 18 mL de 1 solução x SSC e lavagem por 5 min à temperatura ambiente. Deite fora a solução de x SSC 1 e substituí-lo com 18 mL de fresco 1 x SSC. Repita a incubação por 5 min à temperatura ambiente com agitação suave.</li>
		<li>Deite fora a 1 x SSC. Adicione 18 mL de 0.5 x SSC e lavagem por 10 min a 42 ° C sem tremer. Deite fora a 0,5 x SSC e substituir com 18 mL de 0.5 fresco x SSC. Lave novamente por 10 min a 42 ° C, sem agitação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. visualização da sonda RNA
Nota: Para visualizar a sonda, o roxo BM será usado durante o processo de desenvolvimento. No entanto, antes desta etapa, várias lavagens são necessárias para preparar as amostras para a coloração.
<ol><li>Lave os slides com 18 mL de tampão de fosfatase alcalina (AP-tampão) sem MgCl2 por 1 min. Despeje o AP-Buffer sem MgCl2e adicionar 18 mL de tampão de bloqueio 1 x Boehringer Mannheim diluído com tampão de ácido maleico. Incube durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente em um mailer slide com agitação suave. Nota: Os buffers de bloqueio Boehringer Mannheim e ácido maleico utilizados foram premade e comprados na lavagem de escavação e bloco Buffer definido (disponível comercialmente).<ol>
<li>Alternativamente, pode ser realizada a incubação durante a noite a 4 ° C. Um período mais bloqueio irá diminuir a aparência de ligação não-específica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar os 20 mL diluídos fragmentos Fab anti-Digoxigenina-AP de escavação (anticorpo antiescavação = 2 µ l de anticorpo antiescavação + 20 mL 1 x tampão de bloqueio Boehringer Mannheim). Isto é suficiente para uso em 1 mailer corrediça plástica. Mais esta solução devem ser preparada se mais de um slide mailer é para ser usado.</li>
	<li>Adicione o anticorpo antiescavação para um mailer estéril slide novo e transferir os slides para o mailer slide com a solução de anticorpo antiescavação. Incube a temperatura ambiente por 3 h com agitação suave.</li>
	<li>Após a incubação, deite fora o anticorpo antiescavação e lavar as lâminas no mailer slide com 18 mL de AP-tampão sem MgCl2 por 5 min com agitação suave.</li>
	<li>Deite fora o AP-Buffer sem MgCl2 e adicionar 18 mL de AP-tampão. Lavagem por 5 min com agitação suave. Após a incubação de 5 min, deite fora o AP-Buffer, substituí-lo com 18 mL de AP-Buffer fresco e lavar por 5 min com agitação suave.</li>
	<li>No escuro, deite fora o AP-Buffer e adicionar 18ml de BM roxo ao mailer slide. A incubar à temperatura ambiente no escuro, à procura de desenvolvimento de cor roxa que cada ½ h. tempos de reação para visualização irá variar com base na sonda que está sendo desenvolvida. Nota: Em vez de visualização BM roxo, solução de desenvolvimento pode ser feita usando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) e nitro-azul de tetrazólio (NBT). Para obter instruções, consulte a tabela 1 .</li>
	<li>Pare o desenvolvimento de cor pela transferência de slides para um mailer estéril slide novo com 18 mL de tampão Tris-EDTA (TE) por 5 min à temperatura ambiente, no escuro.</li>
	<li>Despeje o tampão TE e adicionar 18 mL de água livre de RNase para o slide mailer e lavagem por 1 min, no escuro.</li>
	<li>Retire as lâminas da água e seque-as ao redor das bordas do tecido. Adicionar o glicerol médio de montagem e coloque as lamelas. Armazene os slides a 4 ° C até fotos esteja prontas para ser levado.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation.">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).</li><li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li><li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+(Leucoraja+erinacea).">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).</li><li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O método descrito neste protocolo foi modificado do trabalho anterior em médicos e evolutiva do desenvolvimento pesquisa8,9,10,12,17. Este protocolo incide sobre as nuances de uma hibridação in situ com uma sonda de anti-sentido RNA escavar-etiquetadas em corais adultos, que foram preservados e incorporados em parafina. Esse método pode ser facil...

Os corais são construtores de ecossistema crítico e importante para a biodiversidade no oceano e a saúde humana1,2,3. Eles estão sob ameaça devido à mudança climática e outros estressores antropogênicas, e muitas espécies de corais são considerados criticamente em perigo. Assim, há uma necessidade significativa de ferramentas celulares e moleculares diagnosticar os corais sob estresse. Além disso, lá é pouco compreendida sobre onde os genes são expressos dentro tecido coral adulto e, portanto, pouca compreensão das funções destes genes. Para resolver esse problema, nós adaptamos o protocolo hibridação (ISH) em situ , comumente usado em medicina humana e biologia do desenvolvimento evolutiva, para uso em amostras de tecido de parafina de corais adultos. Esta técnica é mais poderosa quando usado em corais adultos que foram submetidos a um evento estressante como a exposição ao stress de calor. No entanto, esta técnica pode ser usada em uma ampla gama de tecidos e estágios de vida em corais e não está limitada a apenas tensão térmica corais4,6,7. Além disso, esta técnica pode ser usada em tecidos ou células de qualquer metazoan enquanto há informações de sequência de cDNA disponível.
A finalidade desse método é a visualização de sondas de RNA dentro de tecido coral adulto que foi preservada e incorporado em parafina e seccionados em slides. Este método é uma poderosa ferramenta de diagnóstico que permite a visualização dos ácidos nucleicos dentro de tecido coral adulto. Este método foi desenvolvido inicialmente para o diagnóstico médico, e ele se tornou uma ferramenta popular em campos como a biologia do desenvolvimento e biologia evolutiva do desenvolvimento8,9,10. ISH é também um método crítico, particularmente em sistemas não-modelo, quando genômica e dados de sequência de transcriptomic estão disponíveis, mas padrões de expressão de gene espaciais são desconhecidos. Para o trabalho de diagnóstico em sistemas não-modelo, essa técnica é poderosa porque pode indicar quais as células e tecidos expressam um gene de interesse e podem levar a mais abordagens terapêuticas alvo8,9,10, 11,12. Por último, esta técnica é qualitativa e mais poderoso quando combinado com a expressão de gene quantitativa dados11.
A abordagem descrita neste documento será de interesse para os investigadores que já projetou uma Digoxigenina (DIG)-rotulado sonda RNA (tanto o sentido e antisentido sondas) e estão agora prontos para realizar a hibridação in situ das sondas para uma amostra. Para executar este método, duas seções seriais de um tecido de parafina coral serão necessários para cada sonda sendo testada. Uma seção será usada para a sonda de sentido e o outro para a sonda antisentida. A sonda de sentido será um controle para indicar a ligação não-específica. Se a coloração é observada na sonda de sentido, então, a sonda antisentida não é específica para o RNA de interesse. Sondas podem ser projetadas para qualquer gene expressada. Neste protocolo, são usados vários exemplos que anteriormente foram encontrados para ser expressa durante o stress de calor em corais: homólogo B (Fos-B), proteína ativador (AP1), do oncogene viral do osteossarcoma murino de Fernandes e fator de necrose tumoral receptor 41 (41 TNFR)11. ISH usando sondas de RNA escavar-etiquetadas é preferível usando sondas radioactivas porque sua manipulação é muito mais seguro,10. Além disso, esta técnica é altamente sensível e pode ser executada em uma ampla gama de tecidos e embriões além da tensão térmica corais adultos13,14,15,16.

<table><tbody><tr><td>Denhardt&#039;s solution</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Slide mailers</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide white apex superior adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS solution, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

Os corais são invertebrados oceano importantes que são cruciais para a saúde geral do oceano, bem como a saúde humana. No entanto, devido a impactos humanos tais como o aumento das temperaturas do oceano e a acidificação dos oceanos, os corais são cada vez mais sob ameaça. Para enfrentar esses desafios, avanços na biologia celular e molecular provaram para ser crucial para o diagnóstico da saúde dos corais. Modificar algumas das técnicas usadas em medicina humana poderia melhorar consideravelmente a capacidade dos investigadores para tratar e salvar os corais. Para resolver isso, um protocolo para a hibridação in situ utilizada principalmente em medicina humana e biologia do desenvolvimento evolutiva foi adaptado para uso em adultos corais sob estresse.
A finalidade desse método é Visualizar a expressão espacial de uma sonda de RNA no tecido coral adulto que foi incorporado em parafina e seccionado em lâminas de vidro. Este método concentra-se na remoção da parafina e reidratação da amostra, pré-tratamento da amostra para garantir a permeabilidade da amostra, pré-hibridação de incubação, hibridização da sonda RNA e visualização da sonda RNA. Este é um método poderoso quando usando organismos não-modelo para descobrir onde genes específicos são expressos, e o protocolo pode ser facilmente adaptado para outros organismos não-modelo. No entanto, o método é limitado, em que é essencialmente qualitativa, porque a intensidade de expressão pode variar dependendo da quantidade de tempo utilizado durante a etapa de visualização e a concentração da sonda. Além disso, a paciência é necessária, como este protocolo pode levar até 5 dias (e em muitos casos, mais tempo) dependendo da sonda sendo usado. Finalmente, coloração de fundo específico é comum, mas essa limitação pode ser superada.

Depois de completar este protocolo, identificação de células e tecidos que estão expressando a sonda RNA de interesse será alcançada. Os resultados representativos para este protocolo são para a AP-1, FosB e TNFR41. Estes resultados, publicados anteriormente por Traylor-Knowles et al 11, sondas de mostrar a expressão espacial do RNA em corais adultos que foram expostos ao stress de calor. Dois exemplos de diferentes tipos de coloração são aprese...

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

O objetivo do presente protocolo é executar hibridação in situ em amostras de coral adultas que foram incorporadas em parafina e seccionadas em lâminas de vidro. Este é um método qualitativo usado para visualizar a expressão espacial de uma sonda de anti-sentido RNA em tecidos de parafina.

In Situ Técnicas de hibridização para amostras de Coral adultas parafina

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

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Research

JoVE Journal

Environment

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K visualizações.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. O objetivo do presente protocolo é executar hibridação in situ em amostras de coral adultas que foram incorporadas em parafina e seccionadas em lâminas de vidro. Este é um método qualitativo usado para visualizar a expressão espacial de uma sonda de anti-sentido RNA em tecidos de parafina.

Vídeo: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Ambiente

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Neurociência

Aprimorando a análise de FISH para drivers oncogênicos em amostras de tecido cancerígeno

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

Autor em destaque: FISH como uma ferramenta para avaliação precisa de amplificação de genes em amostras de câncer

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Pesquisa do câncer

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Hibridização In Situ fluorescente e marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina para células-tronco em águas-vivas hidrozoárias Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Biologia do Desenvolvimento

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologia

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

In Situ Técnicas de hibridização para amostras de Coral adultas parafina

Resumo

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Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais

Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Hibridização In Situ fluorescente e marcação de 5-etil-2'-desoxiuridina para células-tronco em águas-vivas hidrozoárias Cladonema pacificum

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

RNA

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados