Name: in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
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Questo lavoro è stato finanziato dal premio no. OCE-1323652 attraverso la National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship e il premio no.1012629 dal programma di arricchimento Postdoctoral di Burroughs Wellcome fondo.

1. rimozione di paraffina
Attenzione: Eseguire la procedura seguente sotto cappa aspirante.
<ol><li>Sparaffinatura le diapositive di paraffina sottile-sezionato con xilene 100% sotto il cofano in barattoli di vetro Coplin per 10 min. Non usare barattoli di plastica Coplin, come xilene si scioglie la plastica. Sterilizzare i barattoli di Coplin in autoclave prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare quattro barattoli di Coplin di vetro sterili con il seguente: etanolo al 100%, 80% etanolo, etanolo al 70% e 60% di etanolo. Diluire l'etanolo con acqua RNAsi-libera.<ol>
<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 100% e metterli a bagno per 10 min. Dopo 10 min, svuotare la vaschetta di Coplin vetro e sostituire con etanolo al 100% nuove. Immergere i vetrini ancora per 10 min.</li>
		<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo di 80% per 1 min.</li>
		<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 70% per 1 min.</li>
		<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 60% per 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pretrattamento di diapositive per la preparazione della sonda del RNA ibridazione
<ol><li>Eseguire i seguenti lavaggi a temperatura ambiente, se non specificato diversamente. Eseguire lavaggi a temperatura ambiente su agitatore orbitale a bassa velocità. Utilizzare buste sterili diapositiva con spazio per fino a cinque scivoli per il lavaggio dei vetrini.</li>
	<li>Trasferire i vetrini per un mailer di diapositiva sterile con 18 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS). Lavare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Versare il PBS 1X e immediatamente trattare il tessuto sulle diapositive con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda del tessuto. Aggiungere circa 18 mL di soluzione di proteinasi K per il mailer di diapositiva (Vedi tabella 1 per la concentrazione della soluzione di lavoro). Incubare a 37 ° C per 15 min. Non ti agitare.<ol>
<li>Mentre le diapositive sono incubando, preparare il prehybridization buffer (Buffer di Prehybe). Posizionare il Buffer di Prehybe in un bagno di acqua bollente per 10 minuti, poi raffreddare su un bagno di ghiaccio per 5 min. Per una ricetta di Prehybe Buffer, vedere tabella 1.</li>
		<li>Interrompere la digestione della reazione proteinasi K versando la soluzione di proteinasi K e immediatamente aggiungere 18 mL di soluzione di glicina-PBS 0,2% per il mailer di diapositiva. Lasciate che il mailer di diapositiva riposare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Versare la soluzione di glicina-PBS 0,2% e aggiungere 18 mL di soluzione di citrato di sodio Salina (SSC) 2 x mailer ogni diapositiva. Lavare i vetrini in 2 x SSC per 10 min a temperatura ambiente con agitazione a 100-150 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. prehybridization di diapositive in preparazione per l'ibridazione della sonda del RNA
<ol><li>Mentre le diapositive sono essere lavate con 2 x SSC, ottenere un nuovo mailer diapositiva sterile e messo circa 18 mL di Buffer di Prehybe nel mailer di diapositiva. Inserire il mailer di diapositiva in forno a temperatura di ibridazione ibridazione. Nota: La temperatura di ibridazione dipenderà la sonda utilizzata ma solitamente varia da 50-60 ° C.</li>
	<li>Una volta completato il lavaggio x SSC 2, versare il 2 x SSC e posto le diapositive all'interno il mailer di diapositiva nel Buffer di Prehybe al forno di ibridazione per 1 h.</li>
</ol>4. l'ibridazione della sonda RNA
<ol><li>Mentre le diapositive sono incubando con il Buffer di Prehybe al forno di ibridazione, preparare la soluzione di ibridazione-sonda.<ol>
<li>Diluire ogni sonda in tampone di ibridazione (0,5 µ l di sonda con 24,5 µ l di tampone di ibridazione). Nota: La ricetta per il tampone di ibridazione si trova nella tabella 1. Un esempio di preparazione della sonda e concentrazioni può essere trovato in Traylor-Knowles et al. 11.</li>
		<li>Posizionare la sonda diluita su un blocco di calore 86-90 ° C per 12 min, poi raffreddare per 1 min sul ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il mailer di diapositiva dal forno ibridazione e individualmente Togliere i vetrini dal mailer di diapositiva utilizzando pinzette sterili. Posare le diapositive su un asciugamano di carta e pulire con cura tampone in eccesso Prehybe intorno i campioni di tessuto. Fare attenzione a non toccare i campioni e lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione dei campioni di tessuto.</li>
	<li>Circondano il tessuto con una penna PAP. 25 µ l di soluzione della sonda diluita con una pipetta e riguardano il campione con un vetrino coprioggetto di plastica.<ol>
<li>Porre i campioni nella diapositiva umidità camera con 4x SSC + 50% formammide soluzione nella parte inferiore della camera.</li>
		<li>Una volta che le sonde sono state aggiunte a tutte le diapositive, è possibile posizionare la camera di umidità diapositiva nel forno ibridazione per almeno 24 ore ad una temperatura di ibridazione di 50-60 ° C. Il tempo di incubazione può variare a seconda della concentrazione della sonda ma dovrebbe essere per un minimo di 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'incubazione overnight con le sonde diluite, è necessario rimuovere la camera di umidità diapositiva dal forno ibridazione.<ol>
<li>Rimuovere le lamelle da ciascuna delle diapositive, facendo attenzione a non spostare il tessuto. In una pipetta 1000 µ l, 1000 µ l di soluzione di x SSC 2 e lavare delicatamente il vetrino.</li>
		<li>Porre il vetrino in un mailer di diapositiva sterile con 18 mL di soluzione di x SSC 2 per 5 min a temperatura ambiente. Versare la soluzione e sostituirlo con 18 mL di fresco 2 x SSC. Ripetere l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Versare la soluzione di x SSC 2. Aggiungere 18 mL di 1 x SSC soluzione e lavare per 5 min a temperatura ambiente. Versare la soluzione di x SSC 1 e sostituirlo con 18 mL di fresco 1 x SSC. Ripetere l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Versare il 1 x SSC. Aggiungere 18 mL di 0.5 x SSC e lavare per 10 min a 42 ° C senza agitazione. Riversare il 0,5 x SSC e Sostituisci con 18 mL di 0.5 fresco x SSC. Lavare nuovamente per 10 min a 42 ° C senza agitazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. visualizzazione della sonda RNA
Nota: Per visualizzare la sonda, viola BM verrà utilizzato durante il processo di sviluppo. Tuttavia, prima di questo passaggio, alcuni lavaggi sono necessari per preparare i campioni per la colorazione.
<ol><li>Lavare i vetrini con 18 mL di buffer di fosfatasi alcalina (AP-buffer) senza MgCl2 per 1 min. Pour il buffer di AP senza MgCl2e aggiungere 18 mL di tampone bloccante di Boehringer Mannheim 1x diluito con il tampone acido maleico. Incubare per almeno 1 h a temperatura ambiente in un mailer di diapositiva con agitazione delicata. Nota: Il tampone bloccante Boehringer Mannheim e acido maleico buffer utilizzato erano premade e acquistati nel lavaggio DIG e blocco Buffer Set (disponibile in commercio).<ol>
<li>In alternativa, può essere eseguita incubazione overnight a 4 ° C. Un periodo di blocco più diminuirà l'aspetto del legame non specifico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare i 20 mL di diluito frammenti Fab di DIG anti-digossigenina-AP (anticorpo anti-DIG = 2 µ l di anticorpo anti-DIG + 20 mL 1 x tampone bloccante Boehringer Mannheim). Questo è sufficiente per l'uso in 1 mailer di scivolo di plastica. Più di questa soluzione deve essere preparata se più di una slide mailer è utilizzabile.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo anti-scavare un nuovo mailer diapositiva sterile e trasferire i vetrini per il mailer vetrino con la soluzione di anticorpo anti-DIG. Incubare a temperatura ambiente per 3 ore con agitazione delicata.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, versare l'anticorpo anti-DIG e lavare i vetrini in mailer diapositiva con 18 mL di Buffer di AP senza MgCl2 per 5 min con agitazione delicata.</li>
	<li>Versare il buffer di AP senza MgCl2 e aggiungere 18 mL di Buffer di AP. Lavare per 5 minuti con agitazione delicata. Dopo l'incubazione di 5 minuti, versare il AP-tampone, sostituirlo con 18 mL di fresco AP-Buffer e lavare per 5 minuti con agitazione delicata.</li>
	<li>Nel buio, versare il buffer di AP e aggiungere 18 mL di BM viola per il mailer di diapositiva. Incubare i vetrini a temperatura ambiente al buio, il controllo per lo sviluppo di colore viola che ogni ½ h. tempi di reazione per visualizzazione variano basato sulla sonda che è in fase di sviluppo. Nota: Invece di visualizzazione BM viola, soluzione di sviluppo può essere fatto utilizzando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) e nitro blu di tetrazolio (NBT). Per istruzioni, vedere la tabella 1 .</li>
	<li>Interrompere lo sviluppo del colore trasferendo le diapositive a un mailer nuova diapositiva sterile con 18 mL di tampone Tris-EDTA (TE) per 5 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Versare il tampone TE e aggiungere 18 mL di acqua RNAsi-libera la diapositiva mailer e lavaggio per 1 min, al buio.</li>
	<li>Rimuovere le diapositive dall'acqua e asciugarle intorno ai bordi del tessuto. Aggiungere glicerolo mezzo di montaggio e inserire i coprioggetti. Memorizzare le diapositive a 4 ° C fino a quando le immagini sono pronte per essere adottate.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Climate+Change,+Human+Impacts,+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs.">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933 (2003).</li><li>Chen, P. -. Y., Chen, C. -. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+(Leucoraja+erinacea).">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).</li><li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata.">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).</li><li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubozoan+jellyfish:+an+Evo/Devo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems.">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo descritto in questo protocollo è stato modificato dal lavoro precedente in ricerca inerente allo sviluppo evolutivo medico8,9,10,12,17. Questo protocollo si concentra sulle sfumature di un'ibridazione in situ con una sonda di scavare-contrassegnate RNA anti-senso sui coralli adulti, che sono stati conservati e inclusi in paraffina. Questo m...

Coralli sono costruttori di ecosistema critico e importante per la biodiversità nell'oceano e salute umana1,2,3. Sono minacciata a causa del cambiamento climatico e altri fattori di stress antropogenici, e molte specie di corallo sono considerate in pericolo critico. Così, c'è un forte bisogno di strumenti molecolari e cellulari per diagnosticare Coralli sotto stress. Inoltre, là poco è capito circa dove i geni sono espressi all'interno di tessuto adulto corallo e quindi poca comprensione delle funzioni di questi geni. Per risolvere questo problema, abbiamo adattato il in situ (ISH) protocollo di ibridazione, comunemente utilizzato in medicina umana e biologia evolutiva dello sviluppo, per l'uso su campioni di tessuto paraffina-incastonato di coralli adulti. Questa tecnica è più potente quando viene utilizzato su Coralli adulti che hanno subito un evento stressante come l'esposizione allo stress da calore. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata su una vasta gamma di tessuti e fasi della vita di coralli e non è limitata al solo calore-sollecitato coralli4,6,7. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata su tessuti o cellule di qualsiasi metazoi finché sono disponibili informazioni di sequenza di cDNA.
Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare le sonde del RNA all'interno di tessuto adulto corallo che è stata conservata e inclusi in paraffina e sezionati sui vetrini. Questo metodo è un potente strumento di diagnostica che permette di visualizzare degli acidi nucleici all'interno di tessuto adulto corallo. Inizialmente questo metodo è stato sviluppato per la diagnostica medica, e da allora è diventato uno strumento popolare in campi come la biologia dello sviluppo e biologia inerente allo sviluppo evolutiva8,9,10. ISH è anche un metodo critico, specialmente in sistemi non-modello, quando genomica e trascrittomica dati di sequenza sono disponibili ma pattern di espressione genica spaziale sono sconosciuti. Per lavoro diagnostico in sistemi non-modello, questa tecnica è potente perché può indicare quali cellule e tessuti esprimono un gene di interesse e possono portare a ulteriori approcci terapeutici mirati8,9,10, 11,12. Infine, questa tecnica è più potente quando accoppiato con espressione genica quantitativa dei dati11e qualitativa.
L'approccio descritto in questo articolo sarà di interesse per i ricercatori che hanno già progettato un digossigenina (DIG)-scritta sonda RNA (sonde sia il senso e antisenso) e sono ora pronti per eseguire in situ di ibridazione delle sonde ad un campione. Per eseguire questo metodo, due sezioni di serie di un tessuto paraffina corallo saranno necessari per ogni sonda in fase di test. Una sezione sarà utilizzata per la sonda di senso e l'altra per la sonda antisenso. La sonda di senso sarà un controllo per indicare il legame non specifico. Se si osserva una colorazione della sonda di senso, quindi la sonda antisenso non è specifica per il RNA di interesse. Sonde possono essere progettati per qualsiasi gene espresso. In questo protocollo, alcuni esempi sono utilizzati che precedentemente sono stati trovati per essere espressi durante lo stress da calore in Coralli: omologo FBJ osteosarcoma murino oncogene virale B (Fos-B), proteina dell'attivatore (AP1) e fattore di necrosi tumorale recettore 41 (TNFR 41)11. ISH usando le sonde Scavare-contrassegnate RNA è preferito rispetto all'uso di sonde radioattive perché la loro gestione è molto più sicuro10. Inoltre, questa tecnica è altamente sensibile e può essere eseguita su una vasta gamma di tessuti ed embrioni oltre ha sottolineato calore adulto coralli13,14,15,16.

<table><tbody><tr><td>Denhardt&#039;s solution</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Slide mailers</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Alkaline phosphatase buffer</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Salmon Sperm DNA solution</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Slide white apex superior adhesive</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>PBS solution, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Liquid Blocker</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution, 500 mL size</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X concentration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, AR (ACS), For Histological Use</td><td>VWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>VWR</td><td>PAV6232</td><td></td></tr><tr><td>hybridization oven</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples

I coralli sono invertebrati oceano importanti che sono critici per la salute generale dell'oceano così come la salute umana. Tuttavia, a causa di impatti antropici come aumento delle temperature dell'oceano e l'acidificazione degli oceani, coralli sono sempre più minacciati. Per affrontare queste sfide, i progressi nella biologia cellulare e molecolare hanno dimostrato di essere fondamentale per la diagnosi della salute dei coralli. Modificare alcune delle tecniche comunemente utilizzate in medicina umana potrebbe migliorare notevolmente la capacità dei ricercatori di trattare e salvare i coralli. Per risolvere questo problema, un protocollo per l'ibridazione in situ utilizzato principalmente in medicina umana e biologia inerente allo sviluppo evolutiva è stato adattato per l'uso in adulti Coralli sotto stress.
Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda RNA in tessuto adulto corallo che è stato incastonato in paraffina e sezionato su vetrini. Questo metodo si concentra sulla rimozione della paraffina e reidratazione del campione, il pretrattamento del campione per garantire permeabilità del campione, pre-l'ibridazione incubazione, ibridazione della sonda RNA e la visualizzazione della sonda RNA. Si tratta di un metodo potente quando si utilizza organismi non-modello per scoprire dove sono espressi geni specifici, e il protocollo può essere facilmente adattato per altri organismi non-modello. Tuttavia, il metodo è limitato in quanto è soprattutto qualitativa, perché espressione intensità può variare a seconda della quantità di tempo utilizzata durante il punto di visualizzazione e la concentrazione della sonda. Inoltre, pazienza è necessaria, in quanto questo protocollo può richiedere fino a 5 giorni (e in molti casi, più a lungo) a seconda della sonda viene utilizzata. Infine, una colorazione di fondo non specifico è comune, ma questa limitazione può essere superata.

Dopo aver completato questo protocollo, si otterrà l'identificazione di cellule e tessuti che stanno esprimendo la sonda RNA di interesse. I risultati rappresentativi per questo protocollo sono per AP-1, FosB e TNFR41. Questi risultati, precedentemente pubblicati da Traylor-Knowles et al. 11, Visualizza espressione spaziale di RNA sonde sui coralli adulti che sono stati esposti allo stress da calore. Due esempi di diversi tipi di colorazione sono presenta...

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

L'obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

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Research

JoVE Journal

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In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

7.0K Views.  University of Miami, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences. L'obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.

Video: In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Ricerca

Ambiente

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

Neuroscienze

Miglioramento dell'analisi FISH per i driver oncogenici nei campioni di tessuto tumorale

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

Autore in primo piano: La FISH come strumento per una valutazione precisa dell'amplificazione genica nei campioni di cancro

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

Rilevamento robusto dell'amplificazione genica in campioni inclusi in paraffina fissati in formalina mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Ricerca sul cancro

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and free-swimming medusae. As exemplified in established models such as Hydra and Nematostella, stem cells and/or proliferative cells contribute to the development and regeneration of cnidarian polyps. However, the underlying cellular mechanisms in most jellyfish, particularly at the medusa stage, are largely unclear, and, thus, developing a robust method for identifying specific cell types is critical. This paper describes a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. Cladonema medusae possess branched tentacles that continuously grow and maintain regenerative capacity throughout their adult stage, providing a unique platform with which to study the cellular mechanisms orchestrated by proliferating and/or stem-like cells. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) using a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, while pulse labeling with 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU), an S phase marker, enables the identification of proliferating cells. Combining both FISH and EdU labeling, we can detect actively proliferating stem-like cells on fixed animals, and this technique can be broadly applied to other animals, including non-model jellyfish species.

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Here, we describe a protocol for visualizing stem-like proliferating cells in the jellyfish Cladonema. Whole-mount fluorescent in situ hybridization with a stem cell marker allows for the detection of stem-like cells, and 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine labeling enables the identification of proliferating cells. Together, actively proliferating stem-like cells can be detected.&#160;

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

Biologia dello sviluppo

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Biologia

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Riepilogo

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Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Rilevamento robusto dell'amplificazione genica in campioni inclusi in paraffina fissati in formalina mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Rilevamento robusto dell'amplificazione genica in campioni inclusi in paraffina fissati in formalina mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Rilevamento robusto dell'amplificazione genica in campioni inclusi in paraffina fissati in formalina mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

Tutto il monte In Situ di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

RNA

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati