Bu yöntem, sinyal transdüksiyon substrat taşıma ve atık temizleme beyin hücre dışı alanlarda meydana nasıl hakkında nörolojik araştırma alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, interstisyel sıvı veya isf serbestçe hareket eden hayvanların büyük hücre dışı moleküllerin örnekleme ve niceliksel sağlar. Ayak ucurlemeye yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezili bir farenin kafatasındaki saçı çıkarın ve kulağı ve burun kelepçesini kullanarak hayvanı bir adaptöre sabitleştirin.
Merhemi hayvanın gözlerine uygulayın ve adaptörü stereotaksik cihaza yerleştirin. Kafatası üzerinde sagittally bir deri kesi yapmak ve stereotaksik çerçeve manipülatör üzerine bir matkap eklemek için bir neşter kullanın. Lambda'ya hafifçe dokunana kadar matkabı düşürün ve matkabın DV koordinatını sıfırlayın.
Daha sonra, AP ve ML koordinatlarının sıfırlanması için matkabı bregma'ya sıfıra taşıyın. Matkabı bregma'dan dikey koordinata taşıyın. Matkabı kafatasına indirin ve DV koordinatını tekrar sıfıra ayarlayın.
Üçüncü bir koordinat için prosedürü tekrarladıktan sonra, hedef koordinatında dikkatlice bir çapak deliği delin ve ardından parietal kemiğin kontralateral tarafında ikinci bir delik açıl. İkinci deliğe bir kemik vidası yerleştirin ve kilit parçasını 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp kapağından kafatasının üzerine yerleştirin, böylece çapak delikleri dairenin içinde dir. Daha sonra, stereotaksik bağdaştırıcının kısa koluna bir kılavuz kanül yerleştirin ve kanülü bir kap somunla sabitle.
Stereotaksik adaptörün uzun kolunu elektrot kelepçesi üzerine ayarlayın ve kolu stereotaksik aygıtın manipülatöre takın. Manipülatör kolundaki DV stereotaksik tertibatını 12 derece döndürün ve kılavuz kanüllerini çapak deliğine taşıyın. Sonra, yavaşça beyne kılavuz kanül 1.2 milimetre indirin.
Kılavuz kanül, kemik vidası ve herhangi bir maruz kafatası metal parçası kaplı ve güvenli ve çimento kurumasını sağlar kadar taç diş çimento ekleyin. 12 ila 20 dakika sonra stereotaksik adaptörü elektrot kıskaçından çıkarın, kapak somunu çıkarın ve stereotaksik adaptörü sahte bir sondayla değiştirin. Daha sonra, kapak somunu yeniden bağlayın, fareyi stereotaksik cihazdan bırakın ve fareyi tek bir kafeste tek başına barındırın.
Mikrodiyaliz kurmadan önce, distile su ile tek kullanımlık bir mililitreşile şırınga doldurun ve bir mikrodiyaliz prob çıkışına şırınga bağlamak için bir viton tüp kullanın. Havalandırma deliklerini manuel olarak kapatın ve sondayı suyla aşılamak için şırınga pistonuna hafifçe bastırın. Sonda girişinde suyun göründüğünü ve mikrodiyaliz membranının yüzeyine sızıntı olduğunu doğrulayın.
Sondayı etkinleştirmek için, sonda membranlarını iki saniye boyunca %70-100 etanolle batırın ve ardından ikinci bir distile su infüzyonu yapın. Bir giriş ve bir çıkış hattına bir bağlantı iğnesi takın ve tek kullanımlık üç mililitrelik şırıngayı taze hazırlanmış perfüzyon tamponuyla yükleyin. Borunun girişine künt uçlu bir iğne yle donatılmış bir şırınga bağlayın ve tüm tüpü perfüzyon tamponuyla doldurmak için bir şırınga pompası kullanın.
Tüp dolduğunda, giriş ve çıkış hatları arasındaki bağlantı iğnesini aktif mikrodiyaliz sondası ve kapak somunu ile değiştirin ve bir silindir pompası üzerindeki çıkış borusuna bir rulo tüp monte edin. Dakikada 10 mikrolitre ve dakikada 9,5-9,8 mikrolitre de silindir pompası şırınga pompası başlatın. Şimdi anestezi kılavuzu kanül implante hayvan boynuna yaka yerleştirin ve kapak somun ve kukla sonda kaldırın.
Mikrodiyaliz sondasını yavaşça kılavuz kanüle takın ve kapak somunu sabitle. Daha sonra fareyi serbest hareket sistemine bağlı bir kafese yerleştirin ve fareyi yakayla bağlayın. En az bir saat sonra, sırayla silindir pompası ve şırınga pompası durdurmak, şırınga pompası ile pompaları yeniden başlatArak 20% daha hızlı silindir pompası daha ve beyin ISF toplamak için bir soğutmalı fraksiyon toplayıcı üzerinde çıkış boru serbest ucunu yerleştirin.
Uygun deneysel hacim elde edildiğinde, sondayı çıkarın ve fare kurtarmayı az önce gösterildiği gibi ele alın. Önceki gözlemlerile tutarlı, uyanık C57B6J farelerde gösterildiği gibi ters mikrodiyaliz ile 50 mikromolar Picrotoksin uygulandığında, interstisyel endojen tau düzeylerinde bir artış bir araç kontrolü ile tedavi edilen hayvanlarda ölçülen seviyelere göre gözlenmektedir. İlaç yönetimlerine ek olarak, mikrodiyaliz EEG kayıt veya optogenetik gibi diğer in vivo yöntemleri ile nöronal aktivite NIN SUBSTRAT konsantrasyonunu nasıl etkilediği ne kadar ek soruları yanıtlamak için kombine edilebilir.
