Yazarlar Prof. J. Lebacq eleştirel yazının düzenleme için teşekkür ederiz. CFTRtm1Eur (homozigoz F508del-CFTR (FVB/129) fareler tarafından geliştirilen Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda, Avrupa Ekonomik Topluluğu Avrupa koordinasyon eylem kistik fibrozis Avrupa Birliği FP6 araştırma desteği ile LHHM-CT-2005-018932.

Çalışmalar ve yordamlar hayvan araştırma (2017/UCL/MD/015) UCL'nin ve hayvan araştırma (CEE n ° 86/609) kullanımda Avrupa Birliği Yönetmeliği ile anlaşma için Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Araştırmacılar bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması yönergesi 2010/63/AB sayılı Avrupa Parlamentosu ve Konsey, 22 Eylül 2010 aşağıdaki hayvan deneme için nitelikli.
1. değerlendirmesi ve yönetimi ön test
<ol><li>Çift lümen burun kateter hazırla. Not: Bir çift lümen kılcal tüp, bir lümen için çözümler, perfüzyon sürekli kullanılan bir burun kateter yapılır ve diğer bir ölçüm olarak kanal.<ol>
<li>Bir parça, yaklaşık 20 cm uzunluğunda, Polietilen boru (2.0 mm iç çap; 3.0 mm dış çap; orta bölümünü oluşturmak ısı Resim 1 bir) gaz (10-15 s) çekmek için yumuşak olana yakıcı Alevi olarak.</li>
		<li>İki ucu bir çok ince kılcal tüp uygun uzunluk (~ 15 cm) ve dış çap (~0.1 mm) (resim 1b) burun sonda için edinmek için ayır.</li>
		<li>Temiz ve saf etanol ile iki tür kılcal ısıtınız, onlara kaseti ile (Şekil 1c) katılmak ve birlikte cyanoacrylate tutkal kullanarak yapıştırın.</li>
		<li>Probları bir jilet veya çift lümen kateteri yaklaşık 8 cm (Şekil 1d) en uygun bir uzunluğu elde etmek için bir neşter ile aşırı uzunluğu kes gitsin.</li>
		<li>Suyu geçirgen olduklarını doğrulamak için her iki lümen yoluyla enjekte.</li>
		<li>Bir işareti bir 5 mm mesafe ucundan uygulanır. Not: tüm ölçümler aynı site içinde burun boşluğuna yapılır böylece burun içine mark kadar sonda eklenir.</li>
		<li>Çift lümen kateteri kuru bir kutuda saklayın. Not: Bu kullanılan 6 - 10 kat uygun şekilde test hemen sonra temizlenmiş olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Krem karışımı hazırlayın.<ol>
<li>Karışımı yavaşça elektrolit krem ve minik hava kabarcıkları oluşumu kaçınarak doymuş 3 M KCl çözüm 1:1 oranında (birim/birim). Not: Krem karışımı Ag/AgCl elektrotlar, ölçme ve referans elektrot köprüler kurmak için Şekil 1' de gösterildiği gibi kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> Resim 1 : Probes elektrotlar ve köprüleri ile. Şekilde Polietilen boru önce (a) ve Isıtma ve (b), (c), Çift lümen kateteri (d), silikon tüp bağlayıcılar (e) ve elektrotlar (f) iki kılcal damar parçalar katılmadan teyp çekerek sonra gösterilmektedir. Resim netliği için bağlayıcılar krem karışımı ile dolu değil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Çözüm etiketi</td>
			<td>Çözüm açıklaması</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Bazal tamponlu tuz solüsyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>Klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M amiloride hisse senedi çözüm</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>10-3 M forskolin hisse senedi çözüm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: çözüm farelerde burun PD test için hazır.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tuz</td>
			<td>mM</td>
			<td>Molekül ağırlığı</td>
			<td>g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum klorür (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalsiyum klorür dihydrate (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0,244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium fosfat (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium fosfat (KH2PO4)</td>
			<td>0,4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Kompozisyon bazal tuz solüsyonu (stok çözelti A) arabelleğe alınmış.
<ol start="3"><li>Çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Deneysel iletişim kuralı (Tablo 1) için gerekli dört hisse senedi çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Bazal tamponlu çözüm (hisse senedi çözüm A; hazırlamak Tablo 2) ve klorür-Alerjik tamponlu çözüm (hisse senedi çözüm B; Tablo 3) Oda sıcaklığında saf suda tuzu karıştırarak. 1 N NaOH pH, düşük pH 1 N HCl yükseltmek için kullanarak pH 7,4 (aralığı 7.0-7,6) için ayarlayın. (275 mOsm/L) çözümünün Osmolarite kontrol edin.</li>
			<li>Etiketli cam şişe 4 ° C'de 3 aya kadar veya donmuş olarak plastik şişeler için 6 aya kadar saklayın.</li>
			<li>10-2 M amiloride çözüm (hisse senedi çözüm C) amiloride hidroklorid 26,6 mg 10 mL saf su ekleyerek hazırlayın. 70 ° C'de 5-10 dakika için karışım ısı Amiloride ışığa duyarlı olduğu için çözüm C karanlık bir kap içinde tutun. Etiket kapsayıcının ve 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
			<li>10-3 M forskolin çözüm (hisse senedi çözüm D) forskolin 10 mg 24.36 mL saf su ekleyerek hazırlayın. 0.1 mL aliquots forskolin hisse senedi çözüm etiket ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Taze çözümleri A1, B1 ve B2 hazırlamak (Tablo 4).<ol>
<li>Taze çözüm A1 hazırlamak (bazal tamponlu tuz solüsyonu artı 10-4 M amiloride) 10 mL bazal tuz çözeltisi (stok çözelti A) alma ve 0.1 mL 10-2 M amiloride çözeltisi (hisse senedi çözüm C) ekleyerek. Etiket kapsayıcının ve hazırlık içinde 24 h kullanın.</li>
		<li>Taze çözüm B1 hazırlamak (klorür arabelleğe alınmış çözüm artı 10-4 M amiloride) klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (hisse senedi çözüm B) 10 mL alma ve 0.1 mL 10-2 M amiloride çözeltisi (hisse senedi çözüm C) ekleyerek. Etiket kapsayıcının ve hazırlık 24 saat içinde kullanın.</li>
		<li>Taze çözüm B2 hazırlamak (klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu artı 10-4 M amiloride ve 10-5 M forskolin) klorür-Alerjik tamponlu tuz solüsyonu (hisse senedi çözüm B) 10 mL elde etmek ve 10-2 M 0.1 mL ekleyerek amiloride çözüm (hisse senedi çözüm C) ve 0.1 mL 10-3 M forskolin çözeltisi (hisse senedi çözüm D). Etiket kapsayıcının ve hazırlık 2 saat içinde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Tuz</td>
			<td>mM</td>
			<td>Molekül ağırlığı</td>
			<td>g/M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum Glukonat (Monosodyum tuz)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalsiyum glukonat (susuz toz)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>Magnezyum sülfat heptahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium fosfat (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium fosfat (KH2PO4)</td>
			<td>0,4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Çözüm (hisse senedi çözüm B) klorür-Alerjik kompozisyon arabelleğe alınmış.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> Resim 2 : Nazal mukoza perfüzyon sırasında farenin konumunu. Şekilde gösterilmektedir (a) ısıtma yastığını, voltmetre (b), bir arka bacak (c), proksimal (d) ve distal (e) çıkışları peristaltik pompa, yastık (f), subkutan uzayda takılı referans elektrot ve yatak levha (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
2. değerlendirme ve Test sırasında yönetim
<ol><li>Deneysel kurulum hazırlamak.<ol>
<li>Hipotermi sırasında ve sonra testi engellemek için ölçüm Kur (18,8 x 37,5 cm; için fizyolojik sıcaklıklarda muhafaza iki Isıtma pedleri kullanın Resim 2 bir) ve diğeri (15,5 x 15,5 cm) kutusunda hangi hayvan kurtarma test sonunda için alınacaktır.</li>
		<li>Veri yakalama için veri bellek yüksek giriş empedansı bağlı yazılımı yüklü bilgisayarda geçiş (> 1012Ω) ve yüksek çözünürlüklü (0,1 mV) Voltmetre (Şekil 2b).</li>
		<li>Elektrotlar için voltmetre bağlanır. Olumlu ölçüm elektrot burun kateter ve arka bacak, subkutan uzayda takılı kateter için olumsuz referans elektrot Şekil 2cgösterildiği gibi bağlayın.</li>
		<li>Krem karışımı içinde birlikte elektrot uçları daldırma. İlk elektrot uzaklık değeri denetleyin. Değeri (±) 2 mV büyükse, elektrotlar reddetmek (ideal olarak 0 mV).</li>
		<li>Peristaltik pompa geçiş ve pompa tüp pozisyona, Şekil 2' de gösterildiği gibi yerleştirin.</li>
		<li>Burun perfüzyon (Şekil 2d) için seçili solüsyon içeren flakon pompa tüp proksimal çıkış bağlayın. Pompa tüp distal çıkış burun kateter (Şekil 2e) perfüzyon lümen bağlayın.</li>
		<li>Burun kateterin bir lümen 10 µL pipet ucu ile elektrolit krem karışımı ile doldurun. Silikon tüp konektörüne (Şekil 1e) kateter uyum, bağlayıcı krem karışımı ile doldurun ve pozitif elektrot konektörünü (Şekil 1f) takın. Ölçüm elektrot köprü uzaklık değeri denetleyin. Değeri (±) 2 mV büyükse, köprüleri reddetmek (ideal olarak 0 mV).</li>
		<li>Burun kateter ikinci lümen taze çözüm A1 ile doldurun. A. 10'a karşılık gelen burun Kateter uzunluğu doldurmak için ters yönde peristaltik pompa solüsyon içeren flakon burun kateter ucu daldırma perfüzyon s. Not: Bu 10 için bazal PD değerleri kayıt imkanı sunan amiloride uygulamadan önce s. Krem karışımı içine referans elektrot (Şekil 1) bağlayıcı burun kateter ucu daldırma.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare işleme başlayın.<ol>
<li>Anestezi mayi (IP) rota17tarafından enjekte edilir tam doz hesaplamak için fare ağırlık kaydedin.</li>
		<li>26 G (0.45 x 10 mm) iğne kullanarak enjekte premedication intraperitoneally anestezi indüksiyon tanıtmak için: sabit doz 5 mg/mL midazolam 50 µL. İçin 5 dakika bekleyin.</li>
		<li>Anestezik karışım hazırlamak (fentanil, medetomidine, droperidol son konsantrasyonlarda 0,05, 0,40 ve 20 mg/kg vücut ağırlığı sırasıyla ve klonidin 0.375 µg sabit doz itibariyle) en iyi ve istikrarlı derinlik17 anestezi (Aşama III, uçak 2) izin . Anestezik mix hacmi intraperitoneally enjekte ve klonidin hacmi enjekte et. Not: 15 dk sonra fare uyuyor olmalı ve anestezi en az 30 dakika sürebilir.</li>
		<li>3 cm 'ısıtma yastığını (Şekil 2bir) üst kısmındaki fare kafa için bir destek olarak kapsayacak geniş yastık' (Şekil 2f) yapmak için doku emici bir sayfa katlayın.</li>
		<li>Isıtma yastığını doku ('çarşaf'; emici bir levha ile kapak Resim 2 g). ısıtma yastığını sırtını fare yatıyordu. Teyp bacaklarda ve kuyruk (Şekil 2).</li>
		<li>Başvuru intravenöz kateter (Şekil 1g) hind riske subkutan alana yerleştirin. İğneyi çıkarın ve silikon tüp konektörü (Şekil 1e, 2 c) uyum.</li>
		<li>Kateter doldurun ve krem konektörle mix ve negatif elektrot (Şekil 1f) konektöre takın.</li>
		<li>Kateter ve elektrot herhangi bir öteleme önlemek için gerektiği şekilde bant ile düzeltmek. Köprüler ve referans elektrot yerleştirme sonra elektrot krem karışımı IV kateter bağlayıcı içinde burun kateter ucu daldırma tarafından ölçüm elektrot köprü uzaklık değeri tekrar doğrulayın. Kayıt istikrarlı son uzaklık değeri (ideal daha az (±) 2 mV).</li>
		<li>"Nazik" bant Isıtma panelindeki emici doku ('yastık' (Şekil 2f) ve 'çarşaf'; iki parça arasında boş bir alan ile kulakları fare düzeltmek (Şekil 2g)). Vibrissae (sert kıllar burun delikleri büyüyen) gözleri dokunmadan düzeltmek.</li>
		<li>Ağız boşluğu sıvı emmek için dili yanları gösteren (Şekil 3bir) taşıyın ve filtre kağıdı ('boru'; sivri uçlu bir fitil ekleyin Şekil 3 b) yaklaşık 1 cm ağız içine. Perfused burun sıvı çalışan emmek için filtre kağıdı ('mendil'; ikinci bir parça yerleştirin Şekil 3 c) burun ucunda düzenledi.</li>
		<li>Ağız içi temas burun kateter ucu yerleştirerek epitel potansiyeli olumlu denetim değerini denetleyin. Not: Okuma istikrarlı ve Aralık -10 arasında olmalıdır mV ve -20 mV.</li>
		<li>İyi forseps ile ve iyi doğrudan aydınlatma altında tutarak, ince burun kateter içine bir burun deliği en fazla 4 - 6 mm burun ucu tanıtmak. Not: Burun PD kateter orta burun concha maksimal istikrarlı temel PD değeri17,20verir konumda yer alır.</li>
		<li>5 dakika sonra enjeksiyon anestezik ilaçların hafifçe tarafından yaklaşık 30° hayvan baş aşağı doğru ile ısıtma yastığını eğ. Maksimal bazal PD değeri izlemek.</li>
		<li>Olduğunda istikrarlı bir yaklaşık 30 boyunca s, 10 µL sabit bir hızda nazal mukoza ventriküler Başlat / min, art arda 4 tamponlu çözümleri (A, A1, B1, B2) ile. Belgili tanımlık ilk eriyik (adım 1.3.1.1) 10 için sıvı s ve her aşağıdaki çözüm (adım 1.4) 5 min için veya sabit bir değere ulaşıncaya kadar. Geçici forskolin yanıt düşmeye başladığında forskolin (B2) ventriküler durdurmak.</li>
		<li>Veri kayıt için 1 s aralığı seçin. Perfüzyon başlangıç sırasında veri kaydetmeye başlamak. Zaman bilgisayar ekranından bir fonksiyonu olarak verileri görüntüler.</li>
		<li>Çözüm B2 ile perfüzyon sonundaki dur veri yakalama. Verilerini bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin.</li>
		<li>Son uzaklık değeri çıkarılarak tarafından doğru veri.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> Şekil 3 : Burun kateter ve filtre kağıtları ile ısıtma yastığını üzerinde farenin konumunu yerde. Şekilde yana doğru (a), kanal (b) ve mendil (c) koymak dil gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
3. test değerlendirmesi ve yönetimi sonrası
<ol><li>Isıtma yastığını üzerinden fare düğmesini serbest bırakın.</li>
	<li>'Çarşaf' ile fare burun silin (Şekil 2g).</li>
	<li>İntraperitoneally bir sabit doz nalokson, rekabetçi morfin antagonisti ve atipamezole, bir medetomidine belirli panzehir (2 mg/kg vücut ağırlığı) (4 µg) oluşan anestezik antagonisti karışımı enjekte et.</li>
	<li>Fare kurtarma kutusunda küçük ısıtma yastığını genellikle 1-2 h sonra gözlenen tam kurtarma kadar yatıyordu. Not: UCL laboratuvarda yaklaşık % 10 mortalite, esas olarak bronchoaspiration nazal kavite test sırasında periosteum çözümleri ile ilgili cinsiyet veya genotip bağımsız olarak görülmektedir.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt amacı çözümleri farelerde kendiliğinden nefes iyon taşıyıcılar, esas olarak CFTR ve ENaC bütünlüğünü test etmek için gereken süreyi için sürekli perfüzyon altında burun PD ölçmek için yeterli bir iletişim kuralı tarif etmektir. İletişim kuralının tüm adımları dikkatlice tam hayvan kurtarma ve kaliteli ve tekrarlanabilir veri sağlamak için optimize edilmiştir. Özellikle, kritik adımlarda anestezi değerlendirmesi ve yönetimi ve yeterli hayvan pozisyon ve bakım sırasında...

Neredeyse üç yıl için elektrik potansiyel farkı (PD) ölçümleri transmembran iyon taşıyıcılar, nazal mukoza, distal airways1temsilcisi olarak ifade edilen fonksiyonel durumunu değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bir multistep dinamik test olarak2,3, nazal PD Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR) ve epitel sodyum kanal (ENaC) etkinlik, fonksiyonel diseksiyon sağlar her ikisi de apikal zarı lokalize epitel hücreleri ve hava yolu yüzey hidrasyon önemli rollerde uygulamakla. Büyük klinik uygulama burun PD testinin CF, 1 dışarı-in 2500 canlı Doğum Avrupa ülkelerinde ortalama bir insidans ile beyaz nüfus en yaygın ölümcül genetik bozukluk tanısında yardımcı olmaktır. Test uzun zayıflatılmış, oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların tanısında yararlı kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi4. Daha yakın zamanlarda,5,6,7,8,9,10,11 defect temel CFTR tedavi modülasyon clinometric değerlendirilmesi ,12,13,14,15,16 burun PD klinik çalışmalarda yeni CF tedavilerin kullanımı yaptı. Preklinik ayarında test yeni CF hedef terapiler18,19,20,21bioactivity incelenmesi izin vermek için fare17 ' ye uyarlanmıştır. Farelerde, kemirgenler ve insan arasındaki burun bölgenin boyutunu türler ile ilgili anatomik farklılıkları ve ağırlıklı olarak Rodents nasofacial bölgesinden duyusal girdilerin önemli rol dayalı hassas, bir tekniktir. Eğitimli ve vasıflı operatörler, özel ekipman ve malzemeleri gerektirir.
CF ekzokrin bezleri, çok sistemik bir hastalığı olduğunu hangi kronik solunum yolu hastalığı klinik resim hakim. Hastalığı siklik adenozin monofosfattır (kampı) kodlama gen mutasyonlar neden olur-CFTR klorür kanal22düzenlenir. Bugüne kadar 2.000'den fazla CFTR mutasyonları tespit23olmuştur. CF gen, neredeyse % 90 bulundu en yaygın mutasyon24,25, Fenilalanin polipeptid zinciri protein (F508del-CFTR) 508 pozisyonda silinmesiyle karşılık gelir. CFTR proteini bir tamamen içinden küçük gürültülerinden klorür kanalıdır. CFTR diğer taşıma mekanizmaları, özellikle de ENaC26,27düzenleyen önemli kanıtlar vardır. Arızalı elektrolit taşıma azaltılmış CFTR bağımlı klorür gürültülerinden ve artan ENaC bağımlı sodyum gürültülerinden, dahil olmak üzere, CF epiteli özelliğidir. Eski kusur küçültülmüş veya kaldırılmış repolarization bir elektrokimyasal gradyan favour klorür sızma ve isoprenaline (hücre içi kampı artıran bir β-adrenergic agonist) veya forskolin (bir adenilat eklenmesi karşısında yansıtır klinik kullanım için onaylanmamış cyclase agonist,). İkincisi kusur bazal hyperpolarization nazal mukoza (daha olumsuz PD) ve amiloride, ENaC28blok bir idrar söktürücü ilaç için artan bir tepki yansıtır.
CF fare modelleri sık CF araştırmalarında kullanılan ve CF patoloji dissekan çok değerli olmuştur. Günümüzde, en az on beş modelleri açıklanan üç olan en klinik F508del mutasyon30,31,32için homozigoz29, olmuştur. Bir Rotterdam, Erasmus Üniversitesi'nde geliştirilen bu üç suş30, yaklaşık 20 yıldır Université catholique de Louvain (UCL) laboratuvar olarak kullanılmıştır. Cftrtm1Eur modeli30 CF hastalığı multiorgan Patofizyoloji çalışmaya ve yeni tedavi stratejileri18,19,20etkinliğini test etmek için çok yararlı olduğunu kanıtlamıştır, 21. Çok sayıda sorunları sırasında veya erken sonra ortaya çıkabilir (< 24 h) farelerde burun PD testi. Bu yazıda, anestezi solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için sürekli perfüzyon ve önlemleri burun kateter situ içinde tutmak için gereken yeterli derinliği açıklanmıştır. Test sonunda hayvan bakımı da, panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere tanımlanır. Özet olarak, bu yordamları güvenilir ölçümler spontan solunum fareler, azaltılmış testi ile ilgili mortalite ve aynı hayvan içinde belgili tanımlık sınav yinelenen sağlar. Temsilcisi veri burun PD testinden bir CF ve vahşi-tipi fare elde gösterilen ve tartışıldı.
Fare burun PD test protokolü üç oturumlarda bildirilmektedir: değerlendirmesi ve yönetimi öncesinde, sırasında ve sonra testi. Ön-test değerlendirmesi ve yönetimi hazırlık çift lümen burun kateter ve çözümleri sürekli burun perfüzyon için kullanılan protokolü ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Değerlendirme ve test yönetimi bölümleri sırasında deneysel kurulum ve fare kullanımı özenle kesmiştim. Son olarak, hayvan test sonunda yönetiminin tam hayvan kurtarma geliştirmek için tanımlanır.

<table><tbody><tr><td>Portex polyethylene tube&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td><td>to prepare capillary tubes for nasal probe</td></tr><tr><td>Electrode cream</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux cream</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrodes</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>measuring and reference electrodes</td></tr><tr><td>amiloride hydrochloride</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>to prepare perfusion solutions</td></tr><tr><td>forskolin</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>to prepare perfusion solutions</td></tr><tr><td>Knick Portamess voltmeter</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Portavo 904 pH</td><td>to measure potential difference</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 Software&amp;nbsp;</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Paraly SW112 software</td><td>to capture potential difference data</td></tr><tr><td>midazolam&amp;nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgium</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>to serve as anaesthetic premedication</td></tr><tr><td>fentanyl</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>medetomidine</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>droperidol&amp;nbsp;</td><td>Janssen&amp;nbsp; Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>clonidine&amp;nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>refernce IV catheter</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>Dumont #5, Fine science Tools</td><td>to place the nasal catheter</td></tr><tr><td>naloxone&amp;nbsp;</td><td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td><td>Narcan, 0.4 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic antagonist</td></tr><tr><td>atipamezole&amp;nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>to serve as a medetomedine specific antidote&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heating pads&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>to avoid hypothermia during and after the test</td></tr><tr><td>Peristaltic pump P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td><td>18111091</td><td>to perfuse solutions in the mouse nose</td></tr><tr><td>cyanoacrylate glue</td><td>Loctite, Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>super glue 3</td><td>to glue together two capillary tubes&amp;nbsp; for nasal probe</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Na gluconate</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Ca gluconate</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>BD needle&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0.45x10 mm)</td><td>intraperitoneal injection</td></tr></tbody></table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

Burun potansiyel farkı test neredeyse üç yıldır kistik fibrozis (CF) tanısında yardımcı olmak için kullanılmıştır. Durumlarında yardımcı olmak, zayıflatılmış oligo veya mono semptomatik formlar genellikle daha sonra hayatında tanısı CF ve vas deferens, idiyopatik kronik pankreatit, Alerjik ikili konjenital yokluğu gibi CF ile ilgili hastalıkların kanıtlamıştır bronkopulmoner aspergilloz ve bronşiektazi. CF. uyarlayarak test etmek için bir fare için hedeflenmiş tedavi stratejileri yanıtlarını ölçmek için bir biyomarker meydan okuyor ve ilişkili bir ölüm gerektirecektir preklinik ve klinik ayarları, testi kullanılmıştır. Bu kağıt için sürekli perfüzyon burun kateter in situ korumak için gerekli anestezi yeterli derinliği açıklar. Solunum-aspirasyon burnuna periosteum çözümleri önlemek için ölçülerin listeler. Ayrıca hayvan bakımı panzehir hızla anestezi hayvanların tam kurtarma ile geri için önde gelen anestezik ilaçların bir arada, yönetimi de dahil olmak üzere test sonunda açıklar. Temsilcisi veri bir CF ve test CF ve sigara-CF arasında ayrımcılık bir vahşi tipi fare Haritayı aldı. Özet olarak, burada açıklanan protokol test ile ilgili güvenilir ölçümler spontan solunum farelerde trans-epitel klorür ve sodyum taşıyıcılar gibi azaltırken aynı hayvan birden çok test fonksiyonel durumu sağlar ölüm.

CF karakteristik iyon taşıma anormallikleri göstermek için burun PD ölçümleri bir F508del-CF fare ve Brüksel kolonisi FVB/129 genetik kökenli bir vahşi tipi kontrol yukarıda açıklanan protokol sonrası gerçekleştirilen CFTRtm1Eur fareler30. En yaygın ve en ağır F508del-CFTR mutasyon23,24,25, birini barındıran bu klinik modeli en iyisi şu and...

Watch this Scientific Journal Video about Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice at JoVE.com

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Burada, farelerde burun potansiyel farkı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Test transmembran iyon taşıyıcılar Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatör ve epitel sodyum kanalı gibi işlev quantifies. Kistik fibrozis için roman tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.

Trans-epitel iyon taşıma farelerde ölçmek için burun potansiyel fark

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Görüntüleme.  Université Catholique de Louvain. Burada, farelerde burun potansiyel farkı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Test transmembran iyon taşıyıcılar Kistik Fibrozis Transmembran gürültülerinden regülatör ve epitel sodyum kanalı gibi işlev quantifies. Kistik fibrozis için roman tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için değerlidir.

Video: Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Biyomühendislik

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Nörobilim

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

Beyin Ekstraselüler Alanının Hacim Fraksiyonu ve Kıvrımını Nicelleştirmek için Tetrametilamonyum ile Gerçek Zamanlı İyontoforez

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and the epithelial sodium channel (ENaC) function are monitored by the change in voltage across the nasal epithelium after the superfusion of solutions that modify ion channel activity. This is enabled by the measurement of the potential difference between the subcutaneous compartment and the airway epithelium in the nostril, utilizing a catheter in contact with the inferior nasal turbinate.
The test allows the measurement of the stable baseline voltage and the successive net voltage changes after perfusion of 100 &#181;M amiloride, an inhibitor of Na+ reabsorption in Ringer&#39;s solution; a chloride-free solution containing amiloride to drive chloride secretion and 10 &#181;M isoproterenol in a chloride-free solution with amiloride to stimulate the cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent chloride conductance related to CFTR.
This technique has the advantage of demonstrating the electrophysiological properties of two key components establishing the hydration of the airway surface liquid of the respiratory epithelium, ENaC, and CFTR. Therefore, it is a useful research tool for phase 2 and proof of concept trials of agents that target CFTR and ENaC activity for the treatment of cystic fibrosis (CF) lung disease. It is also a key follow-up procedure to establish CFTR dysfunction when genetic testing and sweat testing are equivocal. Unlike sweat chloride, the test is relatively more time consuming and costly. It also requires operator training and expertise to conduct the test effectively. Inter- and intra-subject variability has been reported in this technique especially in young or uncooperative subjects. To assist with this concern, interpretation has been improved through a recently validated algorithm.

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Here, we present a standardized protocol to measure the nasal potential difference (NPD). Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and epithelial sodium channel (ENaC) function are evaluated by the change in the voltage across the nasal epithelium after superfusion of solutions that modify ion channel activity, providing an outcome measure.

Burun membran Transepithelial potansiyel farkının (NPD) standart ölçüm

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

Tıp

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Biyoloji

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog skin. Since then, this technique has been applied to many different tissues to study the physiological parameters of transport across membranes. The Ussing chamber method is preferable to other methods because native tissue can be used, making it more applicable to what is happening in vivo. However, because native tissue is used, throughput is low, time is limited, and tissue preparation requires skill and training. These chambers have been used to study specific transporter proteins in various tissues, understand disease pathophysiology such as in Cystic Fibrosis, study drug transport and uptake, and especially contributed to the understanding of nutrient transport in the intestine. Given the whole epithelial transport process of a tissue, not only transepithelial pathways, but also paracellular pathways are important. Tight junctions are a key determinant of tissue specific paracellular permeability across the intestine. In this article, the Ussing chamber technique will be used to assess paracellular permselectivity of ions by measuring transepithelial conductance and dilution potentials.

Intestinal epithelium confers not only nutrient absorption but protection against noxious substances. The apical-most epithelial intercellular junction, i.e., the tight junction, regulates paracellular solute and ion permeability. Here, a protocol for the preparation of mucosal sheets and assessment of the ion selectivity of tight junctions using Ussing chamber technique is described.

Doğal Dokuda İntestinal Sıkı Bileşke Bariyeri ve İyon Geçirgenliğinin Ussing Oda Tekniği ile Fonksiyonel Olarak Değerlendirilmesi

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and differentiated into a pseudo-stratified epithelium in air-liquid interface conditions to quantify cyclic AMP-mediated Chloride (Cl-) transport as an index of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) function. If critical steps such as quality of nasal brushing and cell density upon cryopreservation are performed efficiently, HNE cells can be successfully biobanked. Moreover, short-circuit current studies demonstrate that freeze-thawing does not significantly modify HNE cells&#39; electrophysiological properties and response to CFTR modulators. In the culture conditions used in this study, when less than 2 x 106 cells are frozen per cryovial, the failure rate is very high. We recommend freezing at least 3 x 106 cells per cryovial. We show that dual therapies combining a CFTR corrector with a CFTR potentiator have a comparable correction efficacy for CFTR activity in F508del-homozygous HNE cells. Triple therapy VX-445 + VX-661 + VX-770 significantly increased correction of CFTR activity compared to dual therapy VX-809 + VX-770. The measure of CFTR activity in HNE cells is a promising pre-clinical biomarker useful to guide CFTR modulator therapy.

Here we describe the isolation, amplification, and differentiation of primary human nasal epithelial (HNE) cells at the air-liquid interface and a biobanking protocol allowing to successfully freeze and then thaw amplified HNE. The protocol analyzes electrophysiological properties of differentiated HNE cells and CFTR-related chloride secretion correction upon different modulator treatments.

Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery campaigns targeting recombinant ion channel proteins overexpressed in cells such as HEK-293 cells. However, there is increasing emphasis on the use of tissue-relevant cell lines for studying the effects of small molecule interventions. The following protocol describes the adaptation of a fluorescence-based membrane potential assay for the study of ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines. The membrane potential assay details a high-throughput assay for chloride channel activity of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in two commonly studied epithelial cell lines, Caco-2 and Calu-3. In addition, this paper describes a novel application of this system to measure the activity of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) in a high-throughput format in the same epithelial cell lines. Together, these fluorescence-based assays provide a robust and flexible platform for studying small molecule modulators, targeting two epithelial channels in a relevant cellular context.

This protocol describes a method for the study of electrogenic membrane proteins by measuring changes in membrane potential. This assay provides a platform for the functional readout of multiple ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...