著者が原稿を批判的に編集教授 j. Lebacq をありがちましょう。Cftrtm1Eur (F508del CFTR (FVB/129) のホモ接合体マウスは欧州経済共同体が欧州の連携アクション EU FP6 の嚢胞性線維症の研究のためのサポートと、エラスムス MC、ロッテルダム、オランダによって開発されました。LHHM-CT-2005-018932。

研究は、研究 (CEE n ° 86/609) 動物用欧州共同体規則に一致して UCL (2017/UCL/MD/015) の動物研究の倫理委員会によって承認されました。調査官は、動物実験の科学的な目的に使用される動物の保護に関する指令 2010年/63/EU 欧州議会及び理事会 2010 年 9 月 22 日の次の修飾されています。
1. 事前テストの評価と管理
<ol><li>ダブル ルーメン鼻カテーテルを準備します。 注: 鼻カテーテルはダブル ルーメン キャピラリー チューブ、ソリューション、持続灌流に使用されている 1 つのルーメンとして行われます、なり他の測定として 1 つのチャネルします。<ol>
<li>ポリエチレン管 (内径 2.0 mm; 3.0 mm 外径; の部分、20 センチぐらいの中央部を加熱します。図 1) (10-15 秒) を引っ張るために十分に柔らかくなるまでガス ・ バーナーの炎で。</li>
		<li>離れて適切な長さ (~ 15 cm) と鼻プローブ (図 1b) の外径 (~0.1 mm) の非常に薄いキャピラリー チューブを取得する 2 つの端を引き出します。</li>
		<li>きれいと純粋なエタノールと 2 つこのような毛細血管を脱脂、テープ (図 1c) でそれらを結合、接着剤、シアノアクリ レート系接着剤を使用して一緒にそれら。</li>
		<li>かみそりの刃や約 8 cm (図 1d) のダブル ルーメン カテーテルの最適な長さを取得するメスとプローブの余分な長さを切り取る。</li>
		<li>透過性を確認する両方のルーメンを通して水を注入します。</li>
		<li>先端から 5 mm でマークを適用します。 注: プローブが挿入され、鼻孔にマークまですべての測定は、鼻腔内の同じサイトに作られています。</li>
		<li>ドライ ボックスにダブル ルーメン カテーテルを格納します。 注: こと使用される 6 - 10 回テスト直後に適切に洗浄する場合です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリーム色のミックスを準備します。<ol>
<li>電解質クリームと飽和 3 M KCl 溶液 (ボリューム/)、1:1 の比率で小さな空気の泡の形成を回避する優しく混ぜます。 注: クリーム色のミックスは、図 1に示すよう銀/塩化銀電極、測定および参照電極橋を構築する使用は。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> 図 1: プローブの電極とブリッジで。図は前に、(a) と暖房と引っ張って (b)、(c) ダブル ルーメン カテーテル (d)、シリコーン チューブ コネクタ (e)、(f) 電極の 2 つの毛細血管部分を接合テープ後にポリエチレン管を示します。画像の鮮明さ、コネクタはクリーム色のミックスで満たされているではないです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ソリューション ラベル</td>
			<td>ソリューションの概要</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>基底緩衝塩類溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>塩素フリー バッファー塩溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M アミロライド原液</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>フォルスコリン 10-3 M 原液</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 在庫、マウスの鼻の PD のテストのためのソリューションです。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>塩</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子の重量</td>
			<td>グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>マグネシウム塩化物水和物 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸水素二カリウム (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 2: 基底の組成は、食塩 (ストック溶液) をバッファリングします。
<ol start="3"><li>ソリューションを準備します。<ol>
<li>実験的プロトコル (表 1) に必要な 4 つの貯蔵液を準備します。<ol>
<li>(原液 A 基底バッファー溶液を調製します。表 2)・塩素フリー バッファー溶液 (ストック溶液 B;表 3)室温で純粋な水に塩を混ぜて。7.4 (範囲 7.0 7.6) の pH、低い pH に 1 N の HCl を上げる 1 N NaOH を使用して pH を調整します。(275 mOsm/L) 溶液の浸透圧の変化を確認します。</li>
			<li>6 ヶ月 3 ヶ月またはの冷凍ペットボトルの 4 ° C でラベル付きのガラス瓶に格納します。</li>
			<li>10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) を準備するには、10 mL の純水にアミロライド塩酸の 26.6 mg を追加します。70 ° C で 5 ~ 10 分の混合物を熱します。アミロライドは光に敏感で、ソリューション C 暗いコンテナーにしてください。コンテナーにラベルを付けるし、最大 3 カ月の 4 ° C で保存します。</li>
			<li>24.36 mL 純水にフォルスコリン 10 mg を追加して 10-3 M フォルスコリン ソリューション (原液 D) を準備します。フォルスコリン原液の 0.1 mL 因数をラベル付けし、6 ヶ月の-20 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>A1、B1、B2 の新鮮なソリューションを準備 (表 4)。<ol>
<li>新鮮なソリューション A1 を準備 (基底のバッファリングされた塩水プラス10-4 M アミロライド) 基底塩溶液 (原液 A) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーにラベルを付けるし、準備の 24 h 内で使用します。</li>
		<li>新鮮なソリューション B1 準備 (塩化バッファー ソリューションプラス10-4 M アミロライド) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーをラベルし、準備の 24 時間以内に使用します。</li>
		<li>新鮮なソリューション B2 準備 (塩素フリー バッファー塩水プラス10-4 M アミロライドと 10-5 M フォルスコリン) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M 0.1 mL を追加アミロライド ソリューション (原液 C)、10-3 M フォルスコリン液 (原液 D) 0.1 mL です。コンテナーをラベルし、準備の 2 時間以内に使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>塩</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子の重量</td>
			<td>グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸ナトリウム (ナトリウム塩)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸カルシウム (無水粉末)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸水素二カリウム (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: 塩化物自由の組成はバッファー溶液 (ストック溶液 B) です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> 図 2: 鼻粘膜の血流中のマウスの位置。図 (a) 加熱パッド、電圧計 (b)、後肢 (c) 近 (d)、遠位 (e) アウトレットの蠕動性ポンプ枕 (f)、皮下のスペースに挿入された参照電極とベッドシーツ (g)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2. 評価・ テスト時の管理
<ol><li>実験のセットアップを準備します。<ol>
<li>低体温症を防ぐためには、テストの前後に生理温測定のセットアップ (18.8 x 37.5 cm; ための 1 つを維持 2 つの加熱パッドを使用します。図 2)、およびもう片方が (15.5 × 15.5 cm) ボックスの動物が回復テストの終わりに置かれます。</li>
		<li>データ メモリ高入力インピー ダンスに接続してデータ収集用のソフトウェアを搭載するコンピューターに切り替える (> 1012Ω) と高解像度 (0.1 mV) 電圧計 (図 2b)。</li>
		<li>電極を電圧計に接続します。図 2cに示すように、鼻カテーテルと、後肢で皮下のスペースに挿入されたカテーテルに否定的な電極に肯定的な測定電極を接続します。</li>
		<li>クリーム色のミックスで一緒に電極の先端を浸しなさい。初期の電極のオフセット値を確認します。場合は、値が (±) 2 mV より大きい電極を拒否 (理想的には 0 mV)。</li>
		<li>蠕動性ポンプに切り替え、ポンプ チューブの挿入位置を図 2に示すようします。</li>
		<li>バイアル鼻潅流 (図 2d) 選択した液ポンプ チューブの近位のコンセントに接続します。鼻カテーテル (図 2e) の血流腔ポンプ チューブの遠位部のコンセントに接続します。</li>
		<li>10 μ L ピペット チップ電解質クリーム ミックスで 1 つ鼻カテーテル内腔を埋めます。シリコーン チューブ コネクタ (図 1e) カテーテルの適応、クリーム色のミックスでコネクタを埋める、コネクタ (図 1f) の肯定的な電極を挿入します。測定電極ブリッジのオフセット値を確認します。(±) 2 mV よりも大きい場合、値は、ブリッジを拒否 (理想的には 0 mV)。</li>
		<li>新鮮なソリューション A1 で 2 番目鼻カテーテル内腔を埋めます。A. 逆蠕動性ポンプの方向 10 に対応する鼻カテーテルの長さに合わせてソリューションを含むバイアルに鼻腔カテーテルの先端を浸し灌流の s。 注: これにより、10 の基底の PD 値の記録 s アミロライドを適用する前に。参照電極 (図 1) のコネクタ内のクリーム色のミックスで鼻カテーテルの先端を浸しなさい。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス イベントを処理を開始します。<ol>
<li>腹腔内 (ip) ルート17で注入する麻酔薬の正確な線量を計算するマウスの重量を記録します。</li>
		<li>麻酔導入を促進するために腹腔内麻酔前投薬 (0.45 x 10 mm) 26 G 針を使用して注入: 5 mg/mL ミダゾラムの 50 μ L の固定投与量。5 分待ちます。</li>
		<li>麻酔のミックスを準備 (フェンタニル、メデトミジン、ドロペリドール 0.05、0.40、および 20 mg/kg の濃度で最終的な体重、それぞれと 0.375 μ g の用量固定でクロニジン) できるように最適な安定した麻酔深度 (ステージ III、平面 2)17.腹腔内、麻酔ミックス量を注入し、クロニジンのボリュームを挿入します。 注: 15 分後マウスが眠っていると麻酔は少なくとも 30 分間続くことができます。</li>
		<li>ように 3 cm 幅 '枕' (図 2f) マウスの頭のためのサポートとして (図 2、) の加熱パッドの上の部分をカバーする組織を吸収するシートを折る。</li>
		<li>組織 ('ベッド シート'; を吸収するシートを加熱パッドをカバーします。図 2g). その加熱パッド背中でマウスを置きます。手足と尻尾 (図 2) をテープします。</li>
		<li>後肢肢の皮下の空間参照の静脈のカテーテル (図 1g) を挿入します。針を除去し、シリコン チューブ コネクタ (図 1e、2 c) を適応します。</li>
		<li>カテーテルを記入し、コネクタ クリームをミックスし、コネクタ (図 1f) に否定的な電極を挿入します。</li>
		<li>任意変位を防ぐために、必要に応じてテープでカテーテルと電極を固定します。参照電極とブリッジの配置後、IV カテーテルのコネクタ内部電極クリーム ミックスで鼻カテーテルの先端を浸すことによって測定電極ブリッジのオフセット値をもう一度確認します。(理想的には (±) 2 mV 以下) 安定した最終的なオフセット値を記録します。</li>
		<li>空き ('枕' (図 2f) と 'ベッド シート'; 組織を吸収の 2 つの部分の間に加熱パッドを「優しい」テープでマウスの耳を修正します。(図 2g))。目に触れることがなくヒゲ (硬い毛が鼻の穴近くの成長) を修正します。</li>
		<li>口腔内から流体を吸収するには、舌横に (図 3、) の移動し、ろ紙 (パイプ; の先のとがった芯を挿入図 3b) 口の中に約 1 cm。液不足灌流の鼻孔を吸収するには、フィルター紙 ('ハンカチ'; の 2 番目の部分を配置します。図 3c) は、鼻の先端で開催。</li>
		<li>口の内側と接触して鼻カテーテルの先端を配置することによって上皮の可能性の肯定的な制御の値を確認します。 注: 読み取りは安定と-10 間の範囲をする必要があります mV と-20 mV。</li>
		<li>鼻から mm 6 ヒント繊細な最大 4 - 1 つの鼻孔に鼻カテーテルを紹介微細鉗子と良い直接照明の下でそれを保持しています。 注: 最大の安定したベースライン PD 値17,20を与える位置に中間の鼻コンチャに鼻 PD カテーテルがあります。</li>
		<li>麻酔薬の注射後 5 分軽く傾斜加熱パッド下に動物の頭部約 30 °。最大の基底の PD 値を監視します。</li>
		<li>それが約 30 の期間にわたって安定したが s、10 μ L の一定の速度で、鼻の粘膜を灌開始/分、連続 4 バッファー ソリューション (A、A1、B1、B2)。10 のための最初のソリューション (ステップ 1.3.1.1) を灌流 s と各次のソリューション (手順 1.4) 5 分または安定した値に達するまで。フォルスコリンの過渡応答の起動時に下がってフォルスコリン (B2) を灌を停止します。</li>
		<li>記録データの 1 秒間隔を選択します。灌流を開始時にデータの記録を開始します。コンピューターの画面に時間の関数としてデータを表示します。</li>
		<li>停止データ キャプチャ ソリューション B2 による血液灌流の終わりに。スプレッドシート ファイルとしてデータを保存します。</li>
		<li>最終的なオフセット値を減算して正しいデータ。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> 図 3: 場所の鼻カテーテルとフィルター ペーパー加熱パッドの上でマウスの位置。図では、横 ()、パイプ (b) とハンカチ (c) を入れて舌を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 事後テストの評価と管理
<ol><li>加熱パッドからマウス ボタンを離します。</li>
	<li>'ベッド シート' マウスで鼻を拭く (図 2g)。</li>
	<li>ナロキソン、競争力のあるモルヒネ拮抗薬で、アチパメゾール、メデトミジン特定の解毒剤 (2 mg/kg 体重) の固定投与量 (4 μ g) から成る麻酔拮抗薬のミックスを腹腔内注入します。</li>
	<li>完全復旧、通常 1 ~ 2 時間後に観察されるまで [回復] ボックスより小さい加熱パッドにマウスを置きます。 注: UCL 研究室で約 10% 死亡率、主にソリューションのテスト中に鼻腔内灌流の bronchoaspiration に関連が観察される性別や遺伝子型に関係なく。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿の目的は、自発的に呼吸マウス イオン運送者、主に CFTR と ENaC の整合性をテストするために必要な時間の長さのためのソリューションの持続灌流の下鼻の PD を測定するための適切なプロトコルを記述するためです。プロトコルのすべての手順は、フル動物の回復と良い品質と再現性のあるデータを確保するため慎重に最適化されています。特定、重要な手順で麻酔の評価と管理、適正?...

ほぼ三十年の電気潜在的な違い (PD) 測定は、遠位気道1の代表者として、鼻の粘膜で表される膜イオン輸送体の機能の状態を評価して使用されています。細胞膜に局在する両方多動的テスト2,3、鼻 PD により嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 活動の機能解剖と上皮細胞、気道表面の水和反応で重要な役割を発揮します。鼻の PD テストの主要な臨床応用は、CF、欧州諸国で出生数 2,500 のうち 1 の平均発生率と白人の人口で最も一般的な致命的な遺伝疾患の診断で支援するためにです。テストは長い減衰、oligo またはモノラル症候性フォーム、人生の後半は、通常診断 CF と輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の診断に有用証明しました。気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症4。最近では、基本的な「CFTR の治療の変調の clinometric 評価欠陥5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,,1516は CF の新しい治療法の臨床試験に鼻の pd を使用しました。臨床設定でテストは、新しい CF ターゲット療法18,19,20,21の生物活性の調査を許可するようにマウス17に適応されています。マウスの技術はデリケート、齧歯動物および人間の間鼻の領域のサイズの種に関連した解剖学的差異と主にげっ歯類における nasofacial 領域からの感覚入力の重要な役割に基づいてます。訓練を受け、熟練のオペレーター、専用装置および供給を必要があります。
CF は外分泌腺の多全身性疾患、慢性呼吸器疾患患者の臨床像を支配します。環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を符号化する遺伝子で突然変異によって引き起こされる-CFTR 塩化物チャネル22を規制。までに、2,000 以上 CFTR の遺伝子変異は識別された23をされています。最も一般的な変異24,25CF の対立遺伝子のほぼ 90% は、(F508del CFTR) 蛋白質のポリペプチドの鎖の位置 508 にフェニルアラニンの削除に対応しています。CFTR 蛋白質は、純粋なオーミック小さなコンダクタンス塩化物チャネルです。CFTR が他輸送のメカニズム、特に、ENaC26,27を調節するかなりの証拠があります。不良電解質輸送の削減 CFTR 依存塩化コンダクタンス増加 ENaC 依存性ナトリウム コンダクタンスは、CF 上皮細胞の特徴です。電気化学の勾配優遇塩化物フラックスとイソプロテレノール (細胞内 cAMP を増加させる β アドレナリン作動薬) やフォルスコリン (アデニルに応えて縮小または廃止再分極によって元の欠陥を反映します。シクラーゼ アゴニスト、臨床使用のために承認されない)。後者の欠陥は、鼻の粘膜 (より否定的な PD) とアミロライド、ENaC28を阻害する利尿薬に対する反応の亢進の基底過分極に反映されます。
CF マウス モデルは CF 研究で頻繁に使用されているし、CF 病理解剖で非常に貴重されています。今日では、少なくとも 15 のモデルは記述されている29、3 つのうち、最も臨床的に関連する F508del の突然変異30,31,32のホモをされています。これら 3 系統30ロッテルダムのエラスムス大学で開発されたの 1 つは約 20 年間大学カトリック大学・ デ ・ ルーヴァン (UCL の) 研究室で使用されています。Cftrtm1Eurモデル30 CF 病の中期多臓器の病態を検討し、新しい治療戦略18,19,20の有効性をテストするのには非常に有用であることを証明しています。 21。中または後早期に多数の問題が発生する (< 24 h) マウスの鼻の PD テスト。本稿では、鼻潅流ソリューションの気管支吸引を避けるために、鼻カテーテルその場で持続灌流とメジャーの維持に必要な麻酔の十分な深さを説明します。テストの終わりに動物の世話、説明などの動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる麻酔薬の解毒剤の併用投与もします。完全に、これらの手順は、自発的に呼吸マウス、テスト関連の減らされた死亡率と同じ動物でテストを繰り返しで信頼性の高い測定を許可します。鼻の PD テスト、CF と野生型マウスから得られた代表的なデータは表示され説明.
マウス鼻 PD テスト プロトコルは 3 つのセッションで報告: 評価と管理、試験中に、前後。事前テストの評価と管理は、ダブル ルーメン鼻カテーテル ・連続鼻灌流用のソリューションの準備のプロトコルは詳細で説明されます。評価および管理部分がテスト、中には実験のセットアップとマウスの処理は細かく解剖しました。最後に、動物の回復を改善するために、テストの最後に動物の管理を説明します。

<table><tbody><tr><td>Portex polyethylene tube&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td><td>to prepare capillary tubes for nasal probe</td></tr><tr><td>Electrode cream</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux cream</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrodes</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>measuring and reference electrodes</td></tr><tr><td>amiloride hydrochloride</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>to prepare perfusion solutions</td></tr><tr><td>forskolin</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>to prepare perfusion solutions</td></tr><tr><td>Knick Portamess voltmeter</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Portavo 904 pH</td><td>to measure potential difference</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 Software&amp;nbsp;</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Paraly SW112 software</td><td>to capture potential difference data</td></tr><tr><td>midazolam&amp;nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgium</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>to serve as anaesthetic premedication</td></tr><tr><td>fentanyl</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>medetomidine</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>droperidol&amp;nbsp;</td><td>Janssen&amp;nbsp; Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>clonidine&amp;nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>refernce IV catheter</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>Dumont #5, Fine science Tools</td><td>to place the nasal catheter</td></tr><tr><td>naloxone&amp;nbsp;</td><td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td><td>Narcan, 0.4 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic antagonist</td></tr><tr><td>atipamezole&amp;nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>to serve as a medetomedine specific antidote&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heating pads&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>to avoid hypothermia during and after the test</td></tr><tr><td>Peristaltic pump P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td><td>18111091</td><td>to perfuse solutions in the mouse nose</td></tr><tr><td>cyanoacrylate glue</td><td>Loctite, Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>super glue 3</td><td>to glue together two capillary tubes&amp;nbsp; for nasal probe</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Na gluconate</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Ca gluconate</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>BD needle&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0.45x10 mm)</td><td>intraperitoneal injection</td></tr></tbody></table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

鼻の潜在的な違いのテストは、ほぼ三十年の嚢胞性線維症 (CF) の診断で支援するために使用されています。それは弱毒、CF、人生の後半は、通常診断の oligo またはモノラル症候性形態、輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の場合に有用であると証明されています気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症。Cf. 適応マウスのテストの対象となる治療戦略への応答を定量化するバイオ マーカーは挑戦と関連死亡を伴なうことができる臨床および前臨床設定のテストを使用されています。本稿では、鼻カテーテルその場で持続灌流を維持するために必要な麻酔の十分な深さをについて説明します。それは鼻の灌流ソリューションの気管支吸引を避けるために措置を一覧表示します。動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる、麻酔薬の解毒剤の併用投与を含むテストの終わりに動物のケアについても説明します。CF および野生型マウスから得られた代表的なデータは、CF と CF 非差別のテストを表示します。完全に、ここで説明したプロトコルにより削減しながら同じ動物の複数のテストと同様、自発的に呼吸マウス上皮細胞の塩化物およびナトリウム トランスポーターの機能的状態の信頼性の高い計測テスト関連死亡率。

CF に特徴的なイオン輸送の異常を説明するために鼻の PD 測定を行った F508del CF マウスと野生型制御のブリュッセル コロニーから FVB/129 の遺伝的背景の上で説明したプロトコルに従うCftrtm1Eurマウス30。この臨床的に関連するモデルでは、最も一般的なと最も深刻な F508del CFTR 変異23,24,<sup clas...

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Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

ここでは、マウスの鼻の潜在的な差を測定するためのプロトコルを提案する.テストは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子など上皮性ナトリウム チャネル膜イオン輸送の機能を定量化します。嚢胞性線維症の新規治療法の有効性を評価するために貴重です。

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K ビュー.  Université Catholique de Louvain. ここでは、マウスの鼻の潜在的な差を測定するためのプロトコルを提案する.テストは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子など上皮性ナトリウム チャネル膜イオン輸送の機能を定量化します。嚢胞性線維症の新規治療法の有効性を評価するために貴重です。

ビデオ: Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

生物工学

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

神経科学

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and the epithelial sodium channel (ENaC) function are monitored by the change in voltage across the nasal epithelium after the superfusion of solutions that modify ion channel activity. This is enabled by the measurement of the potential difference between the subcutaneous compartment and the airway epithelium in the nostril, utilizing a catheter in contact with the inferior nasal turbinate.
The test allows the measurement of the stable baseline voltage and the successive net voltage changes after perfusion of 100 &#181;M amiloride, an inhibitor of Na+ reabsorption in Ringer&#39;s solution; a chloride-free solution containing amiloride to drive chloride secretion and 10 &#181;M isoproterenol in a chloride-free solution with amiloride to stimulate the cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent chloride conductance related to CFTR.
This technique has the advantage of demonstrating the electrophysiological properties of two key components establishing the hydration of the airway surface liquid of the respiratory epithelium, ENaC, and CFTR. Therefore, it is a useful research tool for phase 2 and proof of concept trials of agents that target CFTR and ENaC activity for the treatment of cystic fibrosis (CF) lung disease. It is also a key follow-up procedure to establish CFTR dysfunction when genetic testing and sweat testing are equivocal. Unlike sweat chloride, the test is relatively more time consuming and costly. It also requires operator training and expertise to conduct the test effectively. Inter- and intra-subject variability has been reported in this technique especially in young or uncooperative subjects. To assist with this concern, interpretation has been improved through a recently validated algorithm.

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Here, we present a standardized protocol to measure the nasal potential difference (NPD). Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and epithelial sodium channel (ENaC) function are evaluated by the change in the voltage across the nasal epithelium after superfusion of solutions that modify ion channel activity, providing an outcome measure.

鼻膜上皮電位差 (NPD) の標準化された測定

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

医学

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

免疫・感染学

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

生物学

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog skin. Since then, this technique has been applied to many different tissues to study the physiological parameters of transport across membranes. The Ussing chamber method is preferable to other methods because native tissue can be used, making it more applicable to what is happening in vivo. However, because native tissue is used, throughput is low, time is limited, and tissue preparation requires skill and training. These chambers have been used to study specific transporter proteins in various tissues, understand disease pathophysiology such as in Cystic Fibrosis, study drug transport and uptake, and especially contributed to the understanding of nutrient transport in the intestine. Given the whole epithelial transport process of a tissue, not only transepithelial pathways, but also paracellular pathways are important. Tight junctions are a key determinant of tissue specific paracellular permeability across the intestine. In this article, the Ussing chamber technique will be used to assess paracellular permselectivity of ions by measuring transepithelial conductance and dilution potentials.

Intestinal epithelium confers not only nutrient absorption but protection against noxious substances. The apical-most epithelial intercellular junction, i.e., the tight junction, regulates paracellular solute and ion permeability. Here, a protocol for the preparation of mucosal sheets and assessment of the ion selectivity of tight junctions using Ussing chamber technique is described.

ウッシングチャンバー技術による在来組織における腸タイトジャンクションバリアとイオン透過性の機能評価

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and differentiated into a pseudo-stratified epithelium in air-liquid interface conditions to quantify cyclic AMP-mediated Chloride (Cl-) transport as an index of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) function. If critical steps such as quality of nasal brushing and cell density upon cryopreservation are performed efficiently, HNE cells can be successfully biobanked. Moreover, short-circuit current studies demonstrate that freeze-thawing does not significantly modify HNE cells&#39; electrophysiological properties and response to CFTR modulators. In the culture conditions used in this study, when less than 2 x 106 cells are frozen per cryovial, the failure rate is very high. We recommend freezing at least 3 x 106 cells per cryovial. We show that dual therapies combining a CFTR corrector with a CFTR potentiator have a comparable correction efficacy for CFTR activity in F508del-homozygous HNE cells. Triple therapy VX-445 + VX-661 + VX-770 significantly increased correction of CFTR activity compared to dual therapy VX-809 + VX-770. The measure of CFTR activity in HNE cells is a promising pre-clinical biomarker useful to guide CFTR modulator therapy.

Here we describe the isolation, amplification, and differentiation of primary human nasal epithelial (HNE) cells at the air-liquid interface and a biobanking protocol allowing to successfully freeze and then thaw amplified HNE. The protocol analyzes electrophysiological properties of differentiated HNE cells and CFTR-related chloride secretion correction upon different modulator treatments.

初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery campaigns targeting recombinant ion channel proteins overexpressed in cells such as HEK-293 cells. However, there is increasing emphasis on the use of tissue-relevant cell lines for studying the effects of small molecule interventions. The following protocol describes the adaptation of a fluorescence-based membrane potential assay for the study of ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines. The membrane potential assay details a high-throughput assay for chloride channel activity of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in two commonly studied epithelial cell lines, Caco-2 and Calu-3. In addition, this paper describes a novel application of this system to measure the activity of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) in a high-throughput format in the same epithelial cell lines. Together, these fluorescence-based assays provide a robust and flexible platform for studying small molecule modulators, targeting two epithelial channels in a relevant cellular context.

This protocol describes a method for the study of electrogenic membrane proteins by measuring changes in membrane potential. This assay provides a platform for the functional readout of multiple ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines.

2つの上皮細胞株における2つの内因性イオンチャネルのハイスループット機能研究のための膜電位の蛍光ベースのアッセイ(英語)

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...