著者が原稿を批判的に編集教授 j. Lebacq をありがちましょう。Cftrtm1Eur (F508del CFTR (FVB/129) のホモ接合体マウスは欧州経済共同体が欧州の連携アクション EU FP6 の嚢胞性線維症の研究のためのサポートと、エラスムス MC、ロッテルダム、オランダによって開発されました。LHHM-CT-2005-018932。

研究は、研究 (CEE n ° 86/609) 動物用欧州共同体規則に一致して UCL (2017/UCL/MD/015) の動物研究の倫理委員会によって承認されました。調査官は、動物実験の科学的な目的に使用される動物の保護に関する指令 2010年/63/EU 欧州議会及び理事会 2010 年 9 月 22 日の次の修飾されています。
1. 事前テストの評価と管理
<ol><li>ダブル ルーメン鼻カテーテルを準備します。 注: 鼻カテーテルはダブル ルーメン キャピラリー チューブ、ソリューション、持続灌流に使用されている 1 つのルーメンとして行われます、なり他の測定として 1 つのチャネルします。<ol>
<li>ポリエチレン管 (内径 2.0 mm; 3.0 mm 外径; の部分、20 センチぐらいの中央部を加熱します。図 1) (10-15 秒) を引っ張るために十分に柔らかくなるまでガス ・ バーナーの炎で。</li>
		<li>離れて適切な長さ (~ 15 cm) と鼻プローブ (図 1b) の外径 (~0.1 mm) の非常に薄いキャピラリー チューブを取得する 2 つの端を引き出します。</li>
		<li>きれいと純粋なエタノールと 2 つこのような毛細血管を脱脂、テープ (図 1c) でそれらを結合、接着剤、シアノアクリ レート系接着剤を使用して一緒にそれら。</li>
		<li>かみそりの刃や約 8 cm (図 1d) のダブル ルーメン カテーテルの最適な長さを取得するメスとプローブの余分な長さを切り取る。</li>
		<li>透過性を確認する両方のルーメンを通して水を注入します。</li>
		<li>先端から 5 mm でマークを適用します。 注: プローブが挿入され、鼻孔にマークまですべての測定は、鼻腔内の同じサイトに作られています。</li>
		<li>ドライ ボックスにダブル ルーメン カテーテルを格納します。 注: こと使用される 6 - 10 回テスト直後に適切に洗浄する場合です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリーム色のミックスを準備します。<ol>
<li>電解質クリームと飽和 3 M KCl 溶液 (ボリューム/)、1:1 の比率で小さな空気の泡の形成を回避する優しく混ぜます。 注: クリーム色のミックスは、図 1に示すよう銀/塩化銀電極、測定および参照電極橋を構築する使用は。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> 図 1: プローブの電極とブリッジで。図は前に、(a) と暖房と引っ張って (b)、(c) ダブル ルーメン カテーテル (d)、シリコーン チューブ コネクタ (e)、(f) 電極の 2 つの毛細血管部分を接合テープ後にポリエチレン管を示します。画像の鮮明さ、コネクタはクリーム色のミックスで満たされているではないです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ソリューション ラベル</td>
			<td>ソリューションの概要</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>基底緩衝塩類溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>塩素フリー バッファー塩溶液</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M アミロライド原液</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>フォルスコリン 10-3 M 原液</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 在庫、マウスの鼻の PD のテストのためのソリューションです。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>塩</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子の重量</td>
			<td>グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>マグネシウム塩化物水和物 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸水素二カリウム (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 2: 基底の組成は、食塩 (ストック溶液) をバッファリングします。
<ol start="3"><li>ソリューションを準備します。<ol>
<li>実験的プロトコル (表 1) に必要な 4 つの貯蔵液を準備します。<ol>
<li>(原液 A 基底バッファー溶液を調製します。表 2)・塩素フリー バッファー溶液 (ストック溶液 B;表 3)室温で純粋な水に塩を混ぜて。7.4 (範囲 7.0 7.6) の pH、低い pH に 1 N の HCl を上げる 1 N NaOH を使用して pH を調整します。(275 mOsm/L) 溶液の浸透圧の変化を確認します。</li>
			<li>6 ヶ月 3 ヶ月またはの冷凍ペットボトルの 4 ° C でラベル付きのガラス瓶に格納します。</li>
			<li>10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) を準備するには、10 mL の純水にアミロライド塩酸の 26.6 mg を追加します。70 ° C で 5 ~ 10 分の混合物を熱します。アミロライドは光に敏感で、ソリューション C 暗いコンテナーにしてください。コンテナーにラベルを付けるし、最大 3 カ月の 4 ° C で保存します。</li>
			<li>24.36 mL 純水にフォルスコリン 10 mg を追加して 10-3 M フォルスコリン ソリューション (原液 D) を準備します。フォルスコリン原液の 0.1 mL 因数をラベル付けし、6 ヶ月の-20 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>A1、B1、B2 の新鮮なソリューションを準備 (表 4)。<ol>
<li>新鮮なソリューション A1 を準備 (基底のバッファリングされた塩水プラス10-4 M アミロライド) 基底塩溶液 (原液 A) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーにラベルを付けるし、準備の 24 h 内で使用します。</li>
		<li>新鮮なソリューション B1 準備 (塩化バッファー ソリューションプラス10-4 M アミロライド) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M アミロライド ソリューション (原液 C) の 0.1 mL を追加します。コンテナーをラベルし、準備の 24 時間以内に使用します。</li>
		<li>新鮮なソリューション B2 準備 (塩素フリー バッファー塩水プラス10-4 M アミロライドと 10-5 M フォルスコリン) 塩素フリー バッファー塩溶液 (原液 B) 10 mL を入手して 10-2 M 0.1 mL を追加アミロライド ソリューション (原液 C)、10-3 M フォルスコリン液 (原液 D) 0.1 mL です。コンテナーをラベルし、準備の 2 時間以内に使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>塩</td>
			<td>mM</td>
			<td>分子の重量</td>
			<td>グラム/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸ナトリウム (ナトリウム塩)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>グルコン酸カルシウム (無水粉末)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸水素二カリウム (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: 塩化物自由の組成はバッファー溶液 (ストック溶液 B) です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> 図 2: 鼻粘膜の血流中のマウスの位置。図 (a) 加熱パッド、電圧計 (b)、後肢 (c) 近 (d)、遠位 (e) アウトレットの蠕動性ポンプ枕 (f)、皮下のスペースに挿入された参照電極とベッドシーツ (g)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2. 評価・ テスト時の管理
<ol><li>実験のセットアップを準備します。<ol>
<li>低体温症を防ぐためには、テストの前後に生理温測定のセットアップ (18.8 x 37.5 cm; ための 1 つを維持 2 つの加熱パッドを使用します。図 2)、およびもう片方が (15.5 × 15.5 cm) ボックスの動物が回復テストの終わりに置かれます。</li>
		<li>データ メモリ高入力インピー ダンスに接続してデータ収集用のソフトウェアを搭載するコンピューターに切り替える (> 1012Ω) と高解像度 (0.1 mV) 電圧計 (図 2b)。</li>
		<li>電極を電圧計に接続します。図 2cに示すように、鼻カテーテルと、後肢で皮下のスペースに挿入されたカテーテルに否定的な電極に肯定的な測定電極を接続します。</li>
		<li>クリーム色のミックスで一緒に電極の先端を浸しなさい。初期の電極のオフセット値を確認します。場合は、値が (±) 2 mV より大きい電極を拒否 (理想的には 0 mV)。</li>
		<li>蠕動性ポンプに切り替え、ポンプ チューブの挿入位置を図 2に示すようします。</li>
		<li>バイアル鼻潅流 (図 2d) 選択した液ポンプ チューブの近位のコンセントに接続します。鼻カテーテル (図 2e) の血流腔ポンプ チューブの遠位部のコンセントに接続します。</li>
		<li>10 μ L ピペット チップ電解質クリーム ミックスで 1 つ鼻カテーテル内腔を埋めます。シリコーン チューブ コネクタ (図 1e) カテーテルの適応、クリーム色のミックスでコネクタを埋める、コネクタ (図 1f) の肯定的な電極を挿入します。測定電極ブリッジのオフセット値を確認します。(±) 2 mV よりも大きい場合、値は、ブリッジを拒否 (理想的には 0 mV)。</li>
		<li>新鮮なソリューション A1 で 2 番目鼻カテーテル内腔を埋めます。A. 逆蠕動性ポンプの方向 10 に対応する鼻カテーテルの長さに合わせてソリューションを含むバイアルに鼻腔カテーテルの先端を浸し灌流の s。 注: これにより、10 の基底の PD 値の記録 s アミロライドを適用する前に。参照電極 (図 1) のコネクタ内のクリーム色のミックスで鼻カテーテルの先端を浸しなさい。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス イベントを処理を開始します。<ol>
<li>腹腔内 (ip) ルート17で注入する麻酔薬の正確な線量を計算するマウスの重量を記録します。</li>
		<li>麻酔導入を促進するために腹腔内麻酔前投薬 (0.45 x 10 mm) 26 G 針を使用して注入: 5 mg/mL ミダゾラムの 50 μ L の固定投与量。5 分待ちます。</li>
		<li>麻酔のミックスを準備 (フェンタニル、メデトミジン、ドロペリドール 0.05、0.40、および 20 mg/kg の濃度で最終的な体重、それぞれと 0.375 μ g の用量固定でクロニジン) できるように最適な安定した麻酔深度 (ステージ III、平面 2)17.腹腔内、麻酔ミックス量を注入し、クロニジンのボリュームを挿入します。 注: 15 分後マウスが眠っていると麻酔は少なくとも 30 分間続くことができます。</li>
		<li>ように 3 cm 幅 '枕' (図 2f) マウスの頭のためのサポートとして (図 2、) の加熱パッドの上の部分をカバーする組織を吸収するシートを折る。</li>
		<li>組織 ('ベッド シート'; を吸収するシートを加熱パッドをカバーします。図 2g). その加熱パッド背中でマウスを置きます。手足と尻尾 (図 2) をテープします。</li>
		<li>後肢肢の皮下の空間参照の静脈のカテーテル (図 1g) を挿入します。針を除去し、シリコン チューブ コネクタ (図 1e、2 c) を適応します。</li>
		<li>カテーテルを記入し、コネクタ クリームをミックスし、コネクタ (図 1f) に否定的な電極を挿入します。</li>
		<li>任意変位を防ぐために、必要に応じてテープでカテーテルと電極を固定します。参照電極とブリッジの配置後、IV カテーテルのコネクタ内部電極クリーム ミックスで鼻カテーテルの先端を浸すことによって測定電極ブリッジのオフセット値をもう一度確認します。(理想的には (±) 2 mV 以下) 安定した最終的なオフセット値を記録します。</li>
		<li>空き ('枕' (図 2f) と 'ベッド シート'; 組織を吸収の 2 つの部分の間に加熱パッドを「優しい」テープでマウスの耳を修正します。(図 2g))。目に触れることがなくヒゲ (硬い毛が鼻の穴近くの成長) を修正します。</li>
		<li>口腔内から流体を吸収するには、舌横に (図 3、) の移動し、ろ紙 (パイプ; の先のとがった芯を挿入図 3b) 口の中に約 1 cm。液不足灌流の鼻孔を吸収するには、フィルター紙 ('ハンカチ'; の 2 番目の部分を配置します。図 3c) は、鼻の先端で開催。</li>
		<li>口の内側と接触して鼻カテーテルの先端を配置することによって上皮の可能性の肯定的な制御の値を確認します。 注: 読み取りは安定と-10 間の範囲をする必要があります mV と-20 mV。</li>
		<li>鼻から mm 6 ヒント繊細な最大 4 - 1 つの鼻孔に鼻カテーテルを紹介微細鉗子と良い直接照明の下でそれを保持しています。 注: 最大の安定したベースライン PD 値17,20を与える位置に中間の鼻コンチャに鼻 PD カテーテルがあります。</li>
		<li>麻酔薬の注射後 5 分軽く傾斜加熱パッド下に動物の頭部約 30 °。最大の基底の PD 値を監視します。</li>
		<li>それが約 30 の期間にわたって安定したが s、10 μ L の一定の速度で、鼻の粘膜を灌開始/分、連続 4 バッファー ソリューション (A、A1、B1、B2)。10 のための最初のソリューション (ステップ 1.3.1.1) を灌流 s と各次のソリューション (手順 1.4) 5 分または安定した値に達するまで。フォルスコリンの過渡応答の起動時に下がってフォルスコリン (B2) を灌を停止します。</li>
		<li>記録データの 1 秒間隔を選択します。灌流を開始時にデータの記録を開始します。コンピューターの画面に時間の関数としてデータを表示します。</li>
		<li>停止データ キャプチャ ソリューション B2 による血液灌流の終わりに。スプレッドシート ファイルとしてデータを保存します。</li>
		<li>最終的なオフセット値を減算して正しいデータ。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> 図 3: 場所の鼻カテーテルとフィルター ペーパー加熱パッドの上でマウスの位置。図では、横 ()、パイプ (b) とハンカチ (c) を入れて舌を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 事後テストの評価と管理
<ol><li>加熱パッドからマウス ボタンを離します。</li>
	<li>'ベッド シート' マウスで鼻を拭く (図 2g)。</li>
	<li>ナロキソン、競争力のあるモルヒネ拮抗薬で、アチパメゾール、メデトミジン特定の解毒剤 (2 mg/kg 体重) の固定投与量 (4 μ g) から成る麻酔拮抗薬のミックスを腹腔内注入します。</li>
	<li>完全復旧、通常 1 ~ 2 時間後に観察されるまで [回復] ボックスより小さい加熱パッドにマウスを置きます。 注: UCL 研究室で約 10% 死亡率、主にソリューションのテスト中に鼻腔内灌流の bronchoaspiration に関連が観察される性別や遺伝子型に関係なく。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿の目的は、自発的に呼吸マウス イオン運送者、主に CFTR と ENaC の整合性をテストするために必要な時間の長さのためのソリューションの持続灌流の下鼻の PD を測定するための適切なプロトコルを記述するためです。プロトコルのすべての手順は、フル動物の回復と良い品質と再現性のあるデータを確保するため慎重に最適化されています。特定、重要な手順で麻酔の評価と管理、適正?...

ほぼ三十年の電気潜在的な違い (PD) 測定は、遠位気道1の代表者として、鼻の粘膜で表される膜イオン輸送体の機能の状態を評価して使用されています。細胞膜に局在する両方多動的テスト2,3、鼻 PD により嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) と上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) 活動の機能解剖と上皮細胞、気道表面の水和反応で重要な役割を発揮します。鼻の PD テストの主要な臨床応用は、CF、欧州諸国で出生数 2,500 のうち 1 の平均発生率と白人の人口で最も一般的な致命的な遺伝疾患の診断で支援するためにです。テストは長い減衰、oligo またはモノラル症候性フォーム、人生の後半は、通常診断 CF と輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の診断に有用証明しました。気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症4。最近では、基本的な「CFTR の治療の変調の clinometric 評価欠陥5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,,1516は CF の新しい治療法の臨床試験に鼻の pd を使用しました。臨床設定でテストは、新しい CF ターゲット療法18,19,20,21の生物活性の調査を許可するようにマウス17に適応されています。マウスの技術はデリケート、齧歯動物および人間の間鼻の領域のサイズの種に関連した解剖学的差異と主にげっ歯類における nasofacial 領域からの感覚入力の重要な役割に基づいてます。訓練を受け、熟練のオペレーター、専用装置および供給を必要があります。
CF は外分泌腺の多全身性疾患、慢性呼吸器疾患患者の臨床像を支配します。環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を符号化する遺伝子で突然変異によって引き起こされる-CFTR 塩化物チャネル22を規制。までに、2,000 以上 CFTR の遺伝子変異は識別された23をされています。最も一般的な変異24,25CF の対立遺伝子のほぼ 90% は、(F508del CFTR) 蛋白質のポリペプチドの鎖の位置 508 にフェニルアラニンの削除に対応しています。CFTR 蛋白質は、純粋なオーミック小さなコンダクタンス塩化物チャネルです。CFTR が他輸送のメカニズム、特に、ENaC26,27を調節するかなりの証拠があります。不良電解質輸送の削減 CFTR 依存塩化コンダクタンス増加 ENaC 依存性ナトリウム コンダクタンスは、CF 上皮細胞の特徴です。電気化学の勾配優遇塩化物フラックスとイソプロテレノール (細胞内 cAMP を増加させる β アドレナリン作動薬) やフォルスコリン (アデニルに応えて縮小または廃止再分極によって元の欠陥を反映します。シクラーゼ アゴニスト、臨床使用のために承認されない)。後者の欠陥は、鼻の粘膜 (より否定的な PD) とアミロライド、ENaC28を阻害する利尿薬に対する反応の亢進の基底過分極に反映されます。
CF マウス モデルは CF 研究で頻繁に使用されているし、CF 病理解剖で非常に貴重されています。今日では、少なくとも 15 のモデルは記述されている29、3 つのうち、最も臨床的に関連する F508del の突然変異30,31,32のホモをされています。これら 3 系統30ロッテルダムのエラスムス大学で開発されたの 1 つは約 20 年間大学カトリック大学・ デ ・ ルーヴァン (UCL の) 研究室で使用されています。Cftrtm1Eurモデル30 CF 病の中期多臓器の病態を検討し、新しい治療戦略18,19,20の有効性をテストするのには非常に有用であることを証明しています。 21。中または後早期に多数の問題が発生する (< 24 h) マウスの鼻の PD テスト。本稿では、鼻潅流ソリューションの気管支吸引を避けるために、鼻カテーテルその場で持続灌流とメジャーの維持に必要な麻酔の十分な深さを説明します。テストの終わりに動物の世話、説明などの動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる麻酔薬の解毒剤の併用投与もします。完全に、これらの手順は、自発的に呼吸マウス、テスト関連の減らされた死亡率と同じ動物でテストを繰り返しで信頼性の高い測定を許可します。鼻の PD テスト、CF と野生型マウスから得られた代表的なデータは表示され説明.
マウス鼻 PD テスト プロトコルは 3 つのセッションで報告: 評価と管理、試験中に、前後。事前テストの評価と管理は、ダブル ルーメン鼻カテーテル ・連続鼻灌流用のソリューションの準備のプロトコルは詳細で説明されます。評価および管理部分がテスト、中には実験のセットアップとマウスの処理は細かく解剖しました。最後に、動物の回復を改善するために、テストの最後に動物の管理を説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1092px;" width="1091">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:297px;">Portex polyethylene tube&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td>
			<td style="width:225px;">Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td>
			<td style="width:167px;">to prepare capillary tubes for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode cream</td>
			<td style="width:403px;">Parker, Fairfield, NJ, USA</td>
			<td style="width:225px;">Redux cream</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ag/AgCl electrodes</td>
			<td style="width:403px;">Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">JNS BNT131-1,0</td>
			<td>measuring and reference electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amiloride hydrochloride</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">A7410</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forskolin</td>
			<td style="width:403px;">Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">F6886</td>
			<td>to prepare perfusion solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knick Portamess voltmeter</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Portavo 904 pH</td>
			<td>to measure potential difference</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraly SW 112 Software&#160;</td>
			<td>Elektronisch Me&#946;ger&#228;te, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:225px;">Paraly SW112 software</td>
			<td>to capture potential difference data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">midazolam&#160;</td>
			<td style="width:403px;">Mylan, Hoeilaart, Belgium</td>
			<td style="width:225px;">Dormicum 15mg/3ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic premedication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fentanyl</td>
			<td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">medetomidine</td>
			<td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td>
			<td>Domitor 1 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">droperidol&#160;</td>
			<td>Janssen&#160; Cilag, Berchem, Belgium</td>
			<td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clonidine&#160;</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td>
			<td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td>
			<td>to serve as anaesthetic medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">refernce IV catheter</td>
			<td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td>
			<td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td>
			<td>to build electrode bridges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">forceps&#160;</td>
			<td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Dumont #5, Fine science Tools</td>
			<td>to place the nasal catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">naloxone&#160;</td>
			<td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td>
			<td>Narcan, 0.4 mg/ml</td>
			<td>to serve as anaesthetic antagonist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">atipamezole&#160;</td>
			<td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td>
			<td>Antisedan, 5 mg/ml</td>
			<td>to serve as a medetomedine specific antidote&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Heating pads&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td>
			<td>to avoid hypothermia during and after the test</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Peristaltic pump P1</td>
			<td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td>
			<td>18111091</td>
			<td>to perfuse solutions in the mouse nose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:403px;">Loctite, Henkel, D&#252;sseldorf, Germany&#160;</td>
			<td style="width:225px;">super glue 3</td>
			<td>to glue together two capillary tubes&#160; for nasal probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">NaCl</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0926S-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">M7304</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551128</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">1551139</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Na gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">S2054</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ca gluconate</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">C8231</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma, St Louis, MI, USA</td>
			<td style="width:225px;">RES0089M-A7</td>
			<td>Pharma-Grade, USP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">BD needle&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td>
			<td style="width:225px;">BD 26G (0.45x10 mm)</td>
			<td>intraperitoneal injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

鼻の潜在的な違いのテストは、ほぼ三十年の嚢胞性線維症 (CF) の診断で支援するために使用されています。それは弱毒、CF、人生の後半は、通常診断の oligo またはモノラル症候性形態、輸精管、特発性慢性膵炎、アレルギー性の先天性両側欠如など CF 関連疾患の場合に有用であると証明されています気管支肺アスペルギルス症と気管支拡張症。Cf. 適応マウスのテストの対象となる治療戦略への応答を定量化するバイオ マーカーは挑戦と関連死亡を伴なうことができる臨床および前臨床設定のテストを使用されています。本稿では、鼻カテーテルその場で持続灌流を維持するために必要な麻酔の十分な深さをについて説明します。それは鼻の灌流ソリューションの気管支吸引を避けるために措置を一覧表示します。動物の完全な回復と麻酔を急速に反転につながる、麻酔薬の解毒剤の併用投与を含むテストの終わりに動物のケアについても説明します。CF および野生型マウスから得られた代表的なデータは、CF と CF 非差別のテストを表示します。完全に、ここで説明したプロトコルにより削減しながら同じ動物の複数のテストと同様、自発的に呼吸マウス上皮細胞の塩化物およびナトリウム トランスポーターの機能的状態の信頼性の高い計測テスト関連死亡率。

CF に特徴的なイオン輸送の異常を説明するために鼻の PD 測定を行った F508del CF マウスと野生型制御のブリュッセル コロニーから FVB/129 の遺伝的背景の上で説明したプロトコルに従うCftrtm1Eurマウス30。この臨床的に関連するモデルでは、最も一般的なと最も深刻な F508del CFTR 変異23,24,<sup clas...

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Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

ここでは、マウスの鼻の潜在的な差を測定するためのプロトコルを提案する.テストは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子など上皮性ナトリウム チャネル膜イオン輸送の機能を定量化します。嚢胞性線維症の新規治療法の有効性を評価するために貴重です。

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K ビュー.  Université Catholique de Louvain. ここでは、マウスの鼻の潜在的な差を測定するためのプロトコルを提案する.テストは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子など上皮性ナトリウム チャネル膜イオン輸送の機能を定量化します。嚢胞性線維症の新規治療法の有効性を評価するために貴重です。

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

細胞間の高分子輸送アッセイプランタで微粒子銃砲撃を活用

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Using SCOPE to Identify Potential Regulatory Motifs in Coregulated Genes

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and motif position preference1. Each component algorithm is optimized to find a different kind of motif. By taking the best of these three approaches, SCOPE performs better than any single algorithm, even in the presence of noisy data1. In this article, we utilize a web version of SCOPE2 to examine genes that are involved in telomere maintenance. SCOPE has been incorporated into at least two other motif finding programs3,4 and has been used in other studies5-8. 
The three algorithms that comprise SCOPE are BEAM9, which finds non-degenerate motifs (ACCGGT), PRISM10, which finds degenerate motifs (ASCGWT), and SPACER11, which finds longer bipartite motifs (ACCnnnnnnnnGGT). These three algorithms have been optimized to find their corresponding type of motif. Together, they allow SCOPE to perform extremely well.
Once a gene set has been analyzed and candidate motifs identified, SCOPE can look for other genes that contain the motif which, when added to the original set, will improve the motif score. This can occur through over-representation or motif position preference. Working with partial gene sets that have biologically verified transcription factor binding sites, SCOPE was able to identify most of the rest of the genes also regulated by the given transcription factor.
Output from SCOPE shows candidate motifs, their significance, and other information both as a table and as a graphical motif map. FAQs and video tutorials are available at the SCOPE web site which also includes a "Sample Search" button that allows the user to perform a trial run. 
Scope has a very friendly user interface that enables novice users to access the algorithm's full power without having to become an expert in the bioinformatics of motif finding. As input, SCOPE can take a list of genes, or FASTA sequences. These can be entered in browser text fields, or read from a file. The output from SCOPE contains a list of all identified motifs with their scores, number of occurrences, fraction of genes containing the motif, and the algorithm used to identify the motif. For each motif, result details include a consensus representation of the motif, a sequence logo, a position weight matrix, and a list of instances for every motif occurrence (with exact positions and "strand" indicated). Results are returned in a browser window and also optionally by email. Previous papers describe the SCOPE algorithms in detail1,2,9-11.

A straight-forward and robust method to identify potential regulatory motifs in co-regulated genes is presented. SCOPE does not require any user parameters and returns motifs that represent excellent candidates for regulatory signals. The identification of such regulatory signals helps to understand the underlying biology.

Coregulated遺伝子の潜在的な規制モチーフを特定するためにスコープの使用

SCOPE is an ensemble motif finder that uses three component algorithms in parallel to identify potential regulatory motifs by over-representation and ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

誘導および定量化細胞老化するテクニック

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) is a straightforward way to explore secretion from the lysosomal compartment. Taking advantage of cell culture on micropatterned surfaces to normalize cell shape, a variety of statistical tools were employed to perform a spatial analysis of secretory patterns. Using Ripley&#8217;s K function and a statistical test based on the nearest neighbor distance (NND), we confirmed that secretion from lysosomes is not a random process but shows significant clustering. Of note, our analysis revealed that exocytosis events are also clustered in nonadhesion areas, indicating that adhesion molecules are not the only structures that can induce secretory hot spots at the plasma membrane. Still, we found that cell adhesion enhances clustering. In addition to precisely defined adhesive and nonadhesive areas, the circular geometry of these micropatterns allows the use of polar coordinates, simplifying analyses. We used Kernel Density Estimation (KDE) and the cumulative distribution function on polar coordinates of exocytosis events to identify enriched areas of exocytosis. In ring-shaped micropattern cells, clustering occurred at the border between the adhesive and nonadhesive areas. Our analysis illustrates how statistical tools can be employed to investigate spatial distributions of diverse biological processes.

Live imaging of lysosomal exocytosis on micropatterned cells allows a spatial quantification of this process. Morphology normalization using micropatterns is an outstanding tool to uncover general rules about the spatial distribution of cellular processes.

微小パターン化細胞における細胞興奮性の時空間的パラメータの定量

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and differentiated into a pseudo-stratified epithelium in air-liquid interface conditions to quantify cyclic AMP-mediated Chloride (Cl-) transport as an index of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) function. If critical steps such as quality of nasal brushing and cell density upon cryopreservation are performed efficiently, HNE cells can be successfully biobanked. Moreover, short-circuit current studies demonstrate that freeze-thawing does not significantly modify HNE cells&#39; electrophysiological properties and response to CFTR modulators. In the culture conditions used in this study, when less than 2 x 106 cells are frozen per cryovial, the failure rate is very high. We recommend freezing at least 3 x 106 cells per cryovial. We show that dual therapies combining a CFTR corrector with a CFTR potentiator have a comparable correction efficacy for CFTR activity in F508del-homozygous HNE cells. Triple therapy VX-445 + VX-661 + VX-770 significantly increased correction of CFTR activity compared to dual therapy VX-809 + VX-770. The measure of CFTR activity in HNE cells is a promising pre-clinical biomarker useful to guide CFTR modulator therapy.

Here we describe the isolation, amplification, and differentiation of primary human nasal epithelial (HNE) cells at the air-liquid interface and a biobanking protocol allowing to successfully freeze and then thaw amplified HNE. The protocol analyzes electrophysiological properties of differentiated HNE cells and CFTR-related chloride secretion correction upon different modulator treatments.

初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...