Bu yöntem nörobiyolojide motor nöron polaritesi, akson rehberliği, akson ticareti ve nörodejeneratif mekanizmalar gibi önemli soruları nöralize etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, nakavt proteinimizi dakika sevgiyle ifade ederken yüksek oranda zenginleştirilmiş bir motor nöron kültürü elde etmektir. Bu prosedüre başlamak için, silikon ile kodlanmış diseksiyon ortamı bir çanak bir embriyo yerleştirin.
Mikroskop altında, karın ile embriyo tutun forceps ile silikon karşı. İkinci çift forceps ile, rostrad omuriliğin merkezi kanalına uçlardan birini yerleştirin. Daha sonra, biraz dorsal doku yırtmak için forceps kapatın.
Tüm omurilik açılana kadar connell tarafına doğru bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, açık omurilik silikon karşı böylece embriyo konumlandırın. Daha sonra, vücuttan omurilik rostrad kısmını ayırmak.
Omuriliğin rostrad kısmını çimdikle ve omuriliği çıkarmak için embriyoyu kafasından çekin. Omurilikte kalan menenjleri ve DRG'leri dikkatlice çekin. Silikon üzerinde omurilik düzleştirmek ve bir neşter kullanarak, her iki tarafın ortasında boyunca keserek kordon dorsal yarısını çıkarın.
Orta kısmı on parçaya ayırın ve yeni bir tüpe aktarın. Omurilik hücre süspansiyon hazırlamak için, tüpün altındaki omurilik parçaları toplamak. HBSS'yi bir mililitre Ham F-10 orta ile değiştirin ve on mikrolitre tripsin ekleyin.
Tüpü 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Enzimatik sindirimi durdurmak için, parçaları tam L-15 orta 800 mikrolitre, 4% BSA 100 mikrolitre ve 100 mikrolitre DNA ve titrat içeren yeni bir 15 mililitre tüp, iki kez aktarın. Parçaları taze bir 15 mililitrelik tüp içinde supernatant toplamadan önce iki dakika razı olsun.
Yavaşça supernatant tüp altında% 4 BSA iki mililitre ekleyin. Centro onu 470 x yerçekiminde 5 dakika kaynaştırır. 5 dakika sonra, supernatant çıkarın ve tam L-15 orta 2 mililitre ile hücre paletyeniden askıya.
Motonöron zenginleştirme için, iki 15 mililitre tüpler halinde hücre süspansiyon bölün. Daha sonra, her tüp e iki mililitre L-15 PH orta ekleyin. Altı embriyo ile başlayarak, tüp başına üç embriyo eşdeğer kullanın, ve orta üç mililitre.
Keskin bir arayüz elde etmek için her tüpün altına 2 mililitre yoğunluk gradience çözeltisi ekleyin. Sonra, centro oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 830 x yerçekimi sigorta. Bu adımdan sonra, küçük hücreler tüpün alt kısmında, motoneuron gibi büyük hücreler ise yoğunluk gradyan çözüm/orta arabirimde olmalıdır.
Arayüzdeki hücrelerin 1 ila 2 mililitreasperae ve taze bir 15 mililitre tüp aktarın. L-15 PH orta ile on mililitre ses ayarlayın. Daha sonra, iki tüpün altına %4'lük BSA yastığının iki mililitresini ekleyin.
Ve oda sıcaklığında 5 dakika 470 x yerçekiminde centro sigorta. 5 dakika sonra, supernatant çıkarın ve palet ve tam L-15 orta 3 mililitre yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5 dakika 470 x yerçekimi nde santrifüj tekrarlayın.
Sonra, supernatant çıkarın ve hücre palet ve tam kültür orta iki mililitre askıya. Kültür motor nöronlar için, 5, 000-10, 000 hücreleri 500 mikrolitre kültür orta başına 24 kuyu plaka onları seyreltin. Daha sonra, P-1, 000 pipet ucu ile lamina çözeltisi çıkarın.
Hemen kültür ortamda seyreltilmiş motor nöronları aktarın. kurumasını önlemek için kodlama plakalarına. DNA hazırlamak için, nöronal kültür ortamının 50 mikrolitresinde 1 mikrogram DNA'yı yeniden askıya alın.
Ve 5 saniyelik girdap. B tüpünü hazırlamak için, nöronal kültür ortamının 50 mikrolitresinde 1,5 mikrolitre boncuk askıya alın. 50 mikrolitre DNA çözeltisine 50 mikrolitre boncuk çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Bu kuluçka sırasında, 100 mikrolitre kültür ortamını nakledilecek kuyudan çekin. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre DNA boncuk karışımı aktarın. Ve 24 kuyu plakasını kuluçkaya yatırın, manyetik plakada 20-30 dakika 37 santigrat derecede.
Burada gösterilen, endojen non-fosforile nörofilament ağır zincir dört gün sonra ayakta tarafından ortaya modem nöron morfolojisi. Bu görüntülerde, modem nöron morfolojisi dört gün in vitro sonra göstermek ve ikinci gün magnetofection tarafından EGFP trans geni için transfected. Motto nöronlar smi-32 veya pan-nöro marker TUJ-1 ile karşı-lekeli ve oklar nöronların soma gösterir.
Bu manyeto dışkılı motor nöronlar onların konfokal görüntüleri, yabani tip veya mutant EGFP NEFH yapıları ifade ve otofajik marker LC-3B için lekeli. Oklar mutant EGFP NEFH protein agregaları da LC-3B pozitif bu prosedürü takip eden göstermek, montoholda curcha akson ticareti görselleştirmek ve bazı rehberlik eklemek için video mikroskobu ile analiz edilebilir. Nöral biyolojideki temel soruları ele almak için ilk gelişiminden sonra, bu teknik aynı zamanda toksik şok sendromu hastalığı, samuel trofik lateral skleroz veya spinal müsküler atrofi gibi motonöron bozukluklarının spektrumunu kapsayan fizyopatolojik mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç olduğunu kanıtlamaktadır.
