この方法は、運動ニューロンの極性、軸索誘導、軸索密売、神経変性メカニズムなどの神経生物学の重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、我々は分の愛情によって私たちのノックダウンタンパク質を表現するために取っている間、高度に豊かな運動ニューロン培養を得るです。この手順を開始するには、シリコンでコード化された解剖培地の皿に1つの胚を入れます。
顕微鏡の下で、鉗子でシリコンに対して腹部を持つ胚を保持します。鉗子の第二のペアで、耳の先端の1つを、耳の脊髄の中央運河に挿入する。次いで、鉗子を閉じて、後部組織をわずかに引き裂く。
脊髄全体が開くまで、コネル側に向かってこの操作を繰り返します。次に、開いた脊髄がシリコンに対して行われたように胚を位置づける。続いて、脊髄のロストラッド部分を身体から取り外す。
脊髄のロストラッド部分をつまみ、頭で胚を引っ張って脊髄を抽出する。残りの髄やDRGを脊髄に取り付け、慎重に引き離します。シリコン上の脊髄を平らにし、メスを使用して、各側の中央に沿って切断することによって、コードの裏側半分を取り除きます。
中央部分を10個に切り、新しいチューブに移します。脊髄細胞懸濁液を調製するには、チューブの底部にある脊髄片を採取する。HBSSをハムF-10培地の1ミリリットルに置き換え、トリプシンを10マイクロリットル加えます。
37°Cで10分間チューブをインキュベートします。酵素消化を停止するには、完全なL-15培地の800マイクロリットル、4%BSAの100マイクロリットル、および100マイクロリットルのDNAと硝酸塩を含む新しい15ミリリットルチューブに断片を2回移す。新鮮な15ミリリットルのチューブに上清を収集する前に、断片を2分間落ち着かせてください。
上清チューブの底部に4%BSAの2ミリリットルをそっと加えます。セントロは470×重力で5分間融合します。5分後、上清を取り外し、完全なL-15培地の2ミリリットルでセルパレットを再中断します。
モトニューロンの濃縮のために、細胞懸濁液を2つの15ミリリットルチューブに分割します。次に、各チューブにL-15 PH培地を2ミリリットル加えます。6つの胚から始める場合は、チューブあたり3つの胚と3ミリリットルの培地に相当するものを使用してください。
各チューブの底部に2ミリリットルの密度のグラデーション溶液をゆっくりと加える。次に、セントロは室温で15分間830 x重力でそれを融合させる。このステップの後、小さな細胞はチューブの底にあるべきですが、モトニューロンのような大きな細胞は密度勾配溶液/ミディアムインターフェースでなければなりません。
界面で細胞の1〜2ミリリットルをアスペラエし、新鮮な15ミリリットルのチューブに移す。L-15 PH培地で10ミリリットルに音量を調整します。続いて、4%BSAクッションの2ミリリットルを2本のチューブの底に加えます。
そして、セントロは室温で5分間470×重力で融合します。5分後、上清を取り外し、パレットと3ミリリットルの完全なL-15培地を再び中断します。470 x 重力で遠心分離物を室温で 5 分間繰り返します。
次いで、上清を取り出し、完全な培養培地のセルパレットと2ミリリットルを再懸濁させた。運動ニューロンを培養するには、24ウェルプレートで500マイクロリットルの培養培地で5,000-10,000細胞に希釈する。次に、P-1,000ピペットチップで薄層溶液を取り除きます。
すぐに培養培地で希釈された運動ニューロンを移す。乾燥を避けるためにコーディングプレートに。DNAを調製するために、50マイクロリットルの神経細胞培養培地中のDNA1マイクログラムを再懸濁させる。
そして5秒間渦。B管を調製するために、1.5マイクロリットルのビーズを50マイクロリットルの神経培養培地に再懸濁させる。50マイクロリットルのDNA溶液に50マイクロリットルのビーズ溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。
このインキュベーションの間に、トランスフェクションされる井戸から100マイクロリットルの培養培地を引き出す。続いて、100マイクロリットルのDNAビーズミックスを各ウェルに移す。そして、摂氏37度で磁板に20〜30分、24ウェルプレートをインキュベートします。
ここに示されているのは、4日間培養した後の内因性非リン酸化ニューロフィラメント重鎖の立ち上がることによって明らかにされるモデムニューロン形態である。これらの画像では、2日目にインビトロで4日後にモデムニューロンの形態を示し、2日目にマグネフェクションによってEGFPトランス遺伝子にトランスフェクトした。モットーニューロンは、マーカーSMI-32または汎神経マーカーTUJ-1で対染色され、矢印はニューロンのソーマを示す。
これらは磁気感染運動ニューロンの共焦点画像であり、野生型または変異体EGFP NEFHを発現し、オートファジーマーカーLC-3Bに染色される。矢印は、この手順に従ってLC-3B陽性でもある変異体EGFP NEFHタンパク質凝集体を示し、モントホルダ・キュラチャは、軸索密売を視覚化し、いくつかのガイダンスを追加するためにビデオ顕微鏡で分析することができる。神経生物学の基本的な問題に対処するための最初の開発後、この技術はまた、毒性ショック症候群疾患、サミュエル栄養性側索硬化症、または脊髄性筋萎縮症などのモトニューロン障害のスペクトルに関係する生理学的メカニズムを探求するための強力なツールであることを証明する。
