שיטה זו יכולה לעזור לטפל בשאלות מפתח בנוירוביולוגיה, כגון קוטביות נוירונים מוטוריים, הדרכת אקסון, סחר באקסון ומנגנונים נוירודגנרטיביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא להשיג תרבות נוירון מוטורי מועשר מאוד בזמן שאנחנו לוקחים לבטא את החלבון שלנו על ידי חיבה דקה. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים עובר אחד בצלחת של מדיה ניתוח מקודד עם סיליקון.
מתחת למיקרוסקופ, להחזיק את העובר עם הבטן נגד הסיליקון עם מדפים. עם זוג המדפים השני, הכנס את אחד הטיפים לתעלה המרכזית של חוט השדרה rostrad. לאחר מכן, סגור את המדפים כדי לקרוע מעט את רקמת הגב.
חזור על פעולה זו לכיוון הצד של קונל עד שכל חוט השדרה ייפתח. לאחר מכן, מקם את העובר כך חוט השדרה הפתוח הוא נגד הסיליקון. לאחר מכן, לנתק את החלק rostrad של חוט השדרה מהגוף.
צבוט את החלק rostrad של חוט השדרה, ולמשוך את העובר על ידי הראש כדי לחלץ את חוט השדרה. בזהירות למשוך את כל קרום המוח הנותר DRGs עדיין מחובר לחוט השדרה. משטחים את חוט השדרה על הסיליקון ולהשתמש באזמל, מסירים את החצי הגבי של החוט על ידי חיתוך לאורך אמצע כל צד.
חותכים את החלק האמצעי לעשר חתיכות, ומעבירים אותם לצינור חדש. כדי להכין את ההשעיה התאית של חוט השדרה, לאסוף את חתיכות חוט השדרה בתחתית הצינור. החלף HBSS עם מיליליטר אחד של Ham F-10 בינוני ולהוסיף עשרה microliters של טריפסין.
דגירה הצינור במשך עשר דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את העיכול האנזימטי, העבר את השברים לצינור חדש בגודל 15 מיליליטר, המכיל 800 מיקרוליטרים של מדיום L-15 שלם, 100 מיקרוליטרים של 4%BSA ו-100 מיקרוליטרים של DNAs ו- titrate, פעמיים. תן לרסיסים להתיישב במשך שתי דקות לפני איסוף העל-טבעי בצינור טרי של 15 מיליליטר.
הוסיפו בעדינות שני מיליליטר של 4%BSA בתחתית הצינור העל-טבעי. סנטרו להתיך אותו ב 470 x כבידה במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את supernatant מחדש להשעות את משטח התא עם 2 מיליליטר של מלא L-15 בינוני.
להעשרת מוטונורון, לפצל את ההשעיה התא לשני צינורות 15 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של L-15 PH בינוני לכל צינור. אם מתחיל עם שישה עוברים, להשתמש המקבילה של שלושה עוברים לכל צינור, ושלושה מיליליטר של בינוני.
לאט להוסיף 2 מיליליטר של פתרון gradience צפיפות, לתחתית של כל צינור כדי לקבל ממשק חד. לאחר מכן, סנטרו להתיך אותו ב 830 x כבידה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, תאים קטנים צריכים להיות בתחתית הצינור, ואילו תאים גדולים - כגון motoneuron-צריך להיות בפתרון שיפוע צפיפות / ממשק בינוני.
אספרה 1 עד 2 מיליליטר של התאים בממשק ולהעביר אותם לצינור טרי 15 מיליליטר. כוונן את עוצמת הקול לעשרה מיליליטר עם מדיום L-15 PH. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של כרית 4%BSA לתחתית של שני צינורות.
ופתיל סנטרו ב 470 x כבידה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 5 דקות, להסיר את supernatant מחדש להשעות את המשטח ו 3 מיליליטר של מלא L-15 בינוני. חזור על centrifugate ב 470 x כוח הכבידה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להסיר את supernatant מחדש להשעות את משטח התא ושני מיליליטר של מדיום תרבות מלאה. כדי לתרבת נוירונים מוטוריים, לדלל אותם ל 5, 000-10, 000 תאים ב 500 microliters של תרבות בינוני לגם בצלחת 24 גם. לאחר מכן, להסיר את פתרון laminae עם ב P-1, 000 טיפ צינור.
מיד להעביר את הנוירונים המוטוריים מדוללים בינוני תרבות. לצלחות הקידוד כדי למנוע ייבוש. כדי להכין DNA, להשעות מחדש 1 מיקרוגרם של DNA ב 50 microliters של מדיום תרבות עצבית.
ומערבולת למשך 5 שניות. כדי להכין את צינור B, להשעות מחדש 1.5 microliters של חרוזים ב 50 microliters של מדיום תרבות עצבית. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תותר חרוזים ל-50 מיקרוליטרים של תות פתרון דנ"א ודגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
במהלך הדגירה הזו, משיכת 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבות מהברית שתנותב. לאחר מכן, להעביר 100 microliters של תערובת חרוזים DNA לכל באר. ודהר את צלחת 24 באר, 20-30 דקות על הלוח המגנטי ב 37 מעלות צלזיוס.
מוצג כאן, הוא מורפולוגיה נוירון מודם מתגלה על ידי עמידה של שרשרת נוירופילמנט אנדוגני שאינו זרחן כבד לאחר ארבעה ימים של תרבות. בתמונות אלה, הצג את מורפולוגיה נוירון מודם לאחר ארבעה ימים במבחנה ו transfected עבור גן טרנס EGFP על ידי magnetofection ביום השני. נוירונים מוטו היו מוכתמים נגד עם הסמן SMI-32 או סמן פאן-נוירו TUJ-1 ואת החצים מצביעים על סומה של הנוירונים.
אלה הם תמונות confocal שלהם של נוירונים מוטוריים מגנטו fected, המביעים סוג פראי או מוטציה EGFP NEFH מבנים מוכתמים עבור סמן autophagic שלהם LC-3B. חצים מראים את מוטציה EGFP NEFH אגרגטים חלבון כי הם גם LC-3B חיובי בעקבות הליך זה, montoholda curcha ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה וידאו לדמיין סחר אקסון ולהוסיף קצת הדרכה. לאחר ההתפתחות הראשונית שלה כדי לענות על שאלות בסיסיות בביולוגיה עצבית, טכניקה זו גם להוכיח להיות כלי רב עוצמה לחקור מנגנונים פיזיולוגיים המסבכים את הספקטרום של הפרעות motoneuron, כגון מחלת תסמונת הלם רעיל, טרשת נפוצה כללית סמואל טרופי, או ניוון שרירים בעמוד השדרה.
