Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в нейробиологии, такие как полярность моторных нейронов, руководство аксоном, торговля аксоном и нейродегенеративные механизмы. Основным преимуществом этой техники является получение высокообогащенного моторного нейрона культуры в то время как мы принимаем, чтобы выразить наш нокдаун белка поминутной привязанности. Чтобы начать эту процедуру, поместите один эмбрион в блюдо вскрытия сми, закодированных с кремнием.
Под микроскопом держите эмбрион с животом против кремния с помощью типсов. Со второй парой типсов вставьте один из кончиков в центральный канал ростовского спинного мозга. Затем закройте типсы, чтобы слегка разорвать спинную ткань.
Повторите эту операцию в сторону коннелла до тех пор, пока весь спинной мозг не будет открыт. Далее, положение эмбриона так, что открытый спинной мозг против кремния. Впоследствии отсоедините рострадную часть спинного мозга от тела.
Pinch рострад часть спинного мозга, и тянуть эмбрион за голову, чтобы извлечь спинной мозг. Тщательно вытащить все оставшиеся околивания и DRGs по-прежнему прилагается к спинному мозгу. Сгладить спинной мозг на кремнии и с помощью скальпеля, удалить спинную половину шнура, разрезая вдоль середины каждой стороны.
Разрежьте среднюю часть на десять частей и перенесите их в новую трубку. Для подготовки спинного мозга клеточной подвески, собирать части спинного мозга в нижней части трубки. Замените HBSS на один миллилитр среднего Хам F-10 и добавьте десять микролитров трипсина.
Инкубировать трубку в течение десяти минут при 37 градусах по Цельсию. Чтобы остановить энзиматическое пищеварение, перенесите фрагменты в новую 15-миллилитровую трубку, содержащую 800 микролитров полной среды L-15, 100 микролитров 4%BSA и 100 микролитров ДНК и титрата, дважды. Пусть фрагменты оседают в течение двух минут, прежде чем собирать супернатант в свежей 15 миллилитровой трубке.
Аккуратно добавьте два миллилитров 4%BSA в нижней части супернатантной трубки. Центр сливает его при 470 x гравитации в течение 5 минут. Через 5 минут снимите супернатант и повторно приостановив клеточный поддон с 2 миллилитров полной L-15 среды.
Для обогащения мотонейрона разделите подвеску клетки на две 15 миллилитровые трубки. Затем добавьте два миллилитров L-15 PH среды к каждой трубке. Если начать с шести эмбрионов, используйте эквивалент трех эмбрионов на трубку, и три миллилитров среднего.
Медленно добавьте 2 миллилитров раствора градиентности плотности, в нижней части каждой трубки, чтобы получить острый интерфейс. Далее, центр предохранитель его при 830 х тяжести в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого шага, небольшие клетки должны быть в нижней части трубки, в то время как большие клетки, такие как мотонейрон-должны быть на плотность градиентного решения / среднего интерфейса.
Asperae от 1 до 2 миллилитров клеток на интерфейсе и передать их в свежей 15 миллилитров трубки. Отрегулируйте громкость до десяти миллилитров со средним L-15 PH. Затем добавьте два миллилитров подушки 4%BSA к нижней части двух трубок.
И центр предохранитель при 470 х тяжести в течение 5 минут при комнатной температуре. Через 5 минут снимите супернатант и повторно приостановив поддон и 3 миллилитров полного L-15 среднего. Повторите центрифугат при температуре 470 x в течение 5 минут при комнатной температуре.
Затем снимите супернатант и повторно приостановив поддон клетки и два миллилитров полной культуры среды. Для культуры моторных нейронов, разбавить их до 5000-10000 клеток в 500 микролитров среды культуры на колодец в 24 хорошо пластины. Затем снимите раствор ламины с помощью наконечника трубы P-1, 000.
Немедленно перенесите моторные нейроны, разбавленные в культурной среде. на кодирующие пластины, чтобы избежать высыхания. Для подготовки ДНК повторно приостанавливаем 1 микрограмм ДНК в 50 микролитров нейронной культуры среды.
И вихрь в течение 5 секунд. Чтобы подготовить трубку B, повторно приостанавливать 1,5 микролитров бисера в 50 микролитров нейронной культуры среды. Добавьте 50 микролитров раствора шарика в 50 микролитров раствора ДНК и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
Во время этой инкубации вывести из колодец 100 микролитров культурной среды, которые будут трансфицированы. Впоследствии перенесите 100 микролитров смеси шарика ДНК в каждую колодец. И инкубировать 24 хорошо пластины, 20-30 минут на магнитной пластине при 37 градусов по Цельсию.
Показано здесь, является модем нейрон морфологии показали, стоя эндогенных не фосфорилированных нейрофиламент тяжелой цепи после четырех дней культуры. На этих снимках показана модемная нейронная морфология после четырех дней в пробирке и трансфицирована для EGFP транс-гена магнитофекцией на второй день. Девиз нейроны были противо запятнаны маркером SMI-32 или пан-нейро маркер TUJ-1 и стрелки указывают на сому нейронов.
Это их конфокальные изображения магнито-fected моторных нейронов, выражают дикий тип или мутант EGFP NEFH конструкций и окрашенных для их аутофагический маркер LC-3B. Стрелки показывают мутант EGFP NEFH белковые агрегаты, которые также ЯВЛЯЮТСЯ LC-3B положительным После этой процедуры, montoholda curcha могут быть проанализированы с помощью видео микроскопии, чтобы визуализировать торговлю аксоном и добавить некоторые рекомендации. После его первоначального развития для решения фундаментальных вопросов в нейронной биологии, этот метод также оказаться мощным инструментом для изучения физио патологических механизмов, связанных спектр мотонейронов расстройств, таких как токсическое заболевание шокового синдрома, Самуэль трофического бокового склероза, или спинальной мышечной атрофии.
