Bu eser ödül şef bilim adamının Office (TCS/16/37) ve bir MRC Doktora Bursu ile desteklenmiştir.

1. insan Pluripotent kök hücreler (hPSCs) içine 96 de plakaları için hepatosit farklılaşma tohumlama
Not: Bu protokol için kullanılan ekipman ve reaktifler listelenen Tablo 1' de. Bu deneme için kullanılan ortam steril ve hücre kültürü için oda sıcaklığında olmalıdır. Bu protokol bölümünde açıklanan tüm reaktif/çözüm birimleri Aksi belirtilmediği sürece 96-şey plaka tek bir şey üzerinde temel alır.
<ol><li>
Hazırlamak laminin 96 iyi plakaları kaplı.
	<ol>
<li>Rekombinant laminin 521 (100 µg/mL) bir şişe çözülme (LN-521) 4 ° C'de bir gecede 2 h için</li>
		<li>5 µg/mL solüsyon buz gibi 1 Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) (Ca2 +/Mg ile2 +) x LN-521 sulandrarak hazırlayın.</li>
		<li>Kaset dağıtımı için standart bir tüp dağıtıcısı işleme bir otomatik sıvı iyi 96 iyi plaka başına LN-521 çözümün 50 µL eklemek için kullanın. Not: Tüm cilt dispenses bir otomatik sıvı işleme dağıtıcı ile aksi belirtilmedikçe kaset dağıtımı standart bir tüp ile gerçekleştirilir. Kaset losyonlu sonuna ulaşana kadar çözüm Başbakan, o zaman dağıtmak için devam edin. Birden fazla 96 iyi tabaklar gerektiği kadar olarak yordamı yineleyerek aynı deneyde hazırlanabilir.</li>
		<li>37 °C/5% CO2 2-4 h için LN521 kaplı plakalar kuluçkaya. Not: LN521 kaplı plakalar ile 4 ° C'de iki hafta saklanabilir Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için düz bir yüzeye mühürlü plakalar tutmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süreyi ön kaplamalı plakalar için 1 h 30 dk 37 ° C'de ısıtın.</li>
	<li>8-kanal aspirasyon bağdaştırıcı kullanan kaplı yüzey kalan LN-521 çözümü Aspire edin. Not: Kaplı yüzey kaplama yıkımı önlemek için ile herhangi bir temas önlemek için önemlidir.</li>
	<li>10 µM Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y27632 takıma mTeSR1 orta kuyu başına 50 µL eklenir ve plaka da kuluçka makinesine 37 °C/5% CO2' de tohum hücre kadar devam et. Not: Kuru laminin kaplı wells izin vermez.</li>
	<li>
3 x 105 hücre/mL 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 takıma mTeSR1 ortamda bir hücre süspansiyon hazırlamak. Not: Her hücre satırı için tohum yoğunluğu optimizasyonu gerektirir.<ol>
<li>Orta Aspire bir petri hPSCs, yaklaşık %75 85 arası farklılaşmamış bir kültür ile gelen LN-521 üzerinde kültürlü confluency daha önce12açıklandığı gibi. Not: hPSCs LN-521 üzerinde mTSER1 içinde her 24 h değişti ve düzenli olarak hücreleri confluency yukarıda açıklanan12olarak % 80'i ulaştığımızda pasajlı orta ile kültürlü.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 1 5 mL hücrelerle yıkama x DPBS (olmadan Ca2 +/Mg2 +) ve Aspire edin arabellek.</li>
		<li>5 mL 1 x nazik hücre ayrılma reaktif de hücrelere ekleme ve hücre ayrılma için 6-8 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Not: tepki durdurmak için mikroskop altında matris hücre dekolmanı inceleyin. Hücreleri plaka kısmen ayrılmış olmalıdır. Eğer değilse, kuluçka ilave bir 1-2 min için genişletmek.</li>
		<li>Nazik hücre ayrılma reaktif aspirating tarafından tepki bitirmek ve taze mTeSR1 orta 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 hücreleri ile takıma 5 mL ekleyin. Matris ve karıştırmak için birkaç kez bir P1000 ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipet hücrelerden kaldırmak için hücre kazıyıcı kullanın.</li>
		<li>Trypan mavi dışlama yöntemi boyama dayalı bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak ve gerekli konsantrasyonları ile hücre süspansiyon hazırlamak.</li>
		<li>Hücreleri istediğiniz sayıyı bir steril 15 mL veya 50 mL santrifüj tüpüne pipette ve spin hücreleri aşağı onları 115 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging. Not: bir 96 için iyi levha, mTeSR1 orta 3 x 105 hücre/mL içeren 5 mL H9 hücre satırı için gereklidir.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin ve homojen bir çözüm 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 takıma mTeSR1 ortamda 37 ° C'de elde edilir kadar hücre Pelet hafifçe resuspend. Not: hücre hayatta kalma sonrası yeniden kaplama geliştikçe ROCK inhibitörü kullanılması önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 µL hücre süspansiyon mTeSR1 10 µM ROCK inhibitörü Y27632 ile 50 µL içeren 96 iyi plaka üzerine ekleyin.</li>
	<li>Tohum sonra tabakalar hücre kuluçka hücreleri eklemek izin vermek 24 h 37 °C/5% CO2 dönün.</li>
	<li>Ertesi gün hücreleri incelemek ve hücre-hücre iletişim kurulduktan sonra ROCK inhibitörü tutar. % 40 confluency farklılaşma Orta (Şekil 1B) geçin. Not: cep confluency % 40 yüksek ise, tabakları HLC farklılaşma H9 hücre satır için uygun değildir.</li>
</ol>2. hPSCs rekombinant Laminins 96 de tabak içinde hepatosit benzeri hücrelerine ayırt
<ol><li>
Farklılaşma orta ve büyüme faktörleri hazırlayın.
	<ol>
<li>İnsan aktivin A hisse senedi çözüm (100 µg/mL) steril % 0,2 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde insan aktivin A toz çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1:1, 000 istifadə edir.</li>
		<li>Fare Wnt3a hisse senedi çözüm (10 µg/mL) fare Wnt3a toz steril % 0,2 BSA içinde çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1: 200 kullanın.</li>
		<li>İnsan Hepatosit büyüme faktörü (HGF) hisse senedi çözüm (10 µg/mL) steril % 0,2 BSA içinde insan HGF toz çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1: 1000 kullanın.</li>
		<li>Oncostatin M (OSM) hisse senedi çözüm (20 µg/mL) steril % 0,2 BSA içinde toz çözülerek hazırlayın. Aliquot stok ve stok-20 ° C'de 1:1, 000 istifadə edir.</li>
		<li>Kesin endoderm: endoderm farklılaşma orta, %2 B27 ek (insülin olmadan 50 x), % 1 penisilin/streptomisin oluşan hazırlamak (son konsantrasyonları: 100 IU/mL ve 100 µg/mL, sırasıyla) eklendi Roswell'e Park Memorial Enstitüsü 1640 () için RPMI 1640) Bazal orta. 4 ° C'de depolayın ve iki hafta içinde kullanın. Orta her değişiminde, gerekli birim aktivin A ve Wnt3a ile 100 ng/mL ve 50 ng/mL, son konsantrasyonu sırasıyla ek.</li>
		<li>Hepatoblast farklılaşma: hepatoblast farklılaşma orta, % 20 nakavt serumu değiştirme (KSR), alternatif ek L-glutamine, % 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, %1 DMSO ve % %1 0.5 oluşan hazırlamak penisilin/streptomisin (100 IU/mL ve 100 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla) nakavt DMEM (KO-DMEM) eklendi. Vakum altında filtre ve 4 ° C'de depolayın İki hafta içinde kullanın.</li>
		<li>Hepatosit farklılaşma: hepatosit farklılaşma orta, % 1 alternatif ek L-glutamin için 10 µM hidrokortizon 21-hemisuccinate sodyum tuzu (HCC), % 1 penisilin/streptomisin oluşan hazırlamak (100 IU/mL, son konsantrasyonları ve 100 µg/mL, sırasıyla) HepatoZYME orta olarak eklendi. Hisse senedi 4 ° C'de depolayın ve iki hafta içinde kullanın. Her orta değiştirmek için gerekli güç HGF ve OSM ile ek (10 ng/mL ve 20 ng/mL, son konsantrasyonları sırasıyla).</li>
	</ol>
</li>
	<li>tohum, 24 saat sonrası dikkatle bir otomatik el elektronik kanallı pipet sistem kullanarak orta kaldırın ve 50 ng/mL Wnt3a ile 100 ng/mL aktivin A takıma taze endoderm-astar orta 100 µL ekleyin. Not: kesin endoderm orta eklendikten sonra Farklılaşma süreci başlar. Bir kez hücre tohum optimize edilmiştir, hücresel başkalaşım normalde 24 saat içinde başlatılır. Tüm Orta değişiklikler otomatik el elektronik kanallı pipet sistem ile orta kaldırarak ve taze orta bir otomatik sıvı işleme makinesi ile bir standart kullanarak 100 µL dağıtımı yapılmaktadır olmadıkça losyonlu kaset tüp Aksi takdirde belirtilen. Bir otomatik el elektronik kanallı pipet sistem iyi kafa, 300 µL ipuçlarını kullanarak 96 ile kullanıldı. Kısacası, 90 µL de hücreleri ile herhangi bir temas kaçınarak dan Aspire ve hücreleri hücre stresi azaltmak için orta değiştirmek sırasında kuru değil önemlidir.</li>
	<li>İnsan embriyonik kök hücreleri için (hESCs), üç gün boyunca endoderm farklılaşma orta her gün değiştirin. Farklılaşma insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gerçekleştirilirse, kesin endoderm sahne kullanarak aktivin A sadece 2 gün için genişletmek.</li>
	<li>Sonra kesin endoderm indüksiyon, KSR/DMSO orta hepatoblast belirtimi için geçiş ve Orta 2 günde 5 gün değiştirin. Not: sonraki orta değiştirmek daha önce hücreleri yıkamak için desteklenen KO-DMEM iyi ekli olmayan hücrelerin sayısı varsa, kullanın. Protokolü (5 gün) ikinci aşaması süresi nedeniyle, 3 orta değişiklikler ile hepatoblast belirtiminin son günü bir son olacak.</li>
	<li>Hepatoblast farklılaşma HepatoZYME orta olarak hepatosit olgunlaşma için geçiş. HepatoZYME KSR/DMSO orta çıkardıktan sonra ek olmadan bir kez hücrelerle yıkama ve HepatoZYME olgunlaşma orta 10 ng/mL HGF ve 20 ng/mL OSM ile 100 µL ekleyin.</li>
	<li>Orta her 48 h 7-10 gün için değiştirin. Gün farklılaşma 18, HLCs gen ekspresyonu ve CYP P450 metabolik etkinliğini analiz ederek karakterize.</li>
</ol>3. hepatosit benzeri karakterizasyonu Ayrıştırılan üzerinde rekombinant Laminins hücreleri
<ol><li>Hepatosit özgü işaretleri ve polarizasyon işaretleri immunostaining kullanarak ifade bulmak.</li>
	<li>Hepatosit metabolik fonksiyon CYP P450 deneyleri12' den önce açıklandığı gibi kullanarak sınayın.</li>
	<li>İyi plaka başına başına hücre sayısı sayım plaka varyasyon belirler.</li>
</ol>4. yüksek üretilen iş Immunocytochemistry ve resim alma
<ol><li>Gün 18 farklılaşma, wells üç kez 1 x DPBS ile yıkayın, HLCs % 4 paraformaldehyde (PFA) dağıtım 50 µL tarafından tamir ve için 15-30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Fiksasyon sonra üç kez PBST ile yıkayın (% 0,1 ara) (Ca2 +/Mg2 +) kullanarak bir otomatik kalıp çamaşır makinesi. Not: Bu bölümdeki tüm yıkama aksi belirtilmedikçe otomatik kalıp çamaşır makinesi kullanılarak gerçekleştirilir. Tüm yıkama aynı iletişim kuralını yapılır.</li>
	<li>Membran PBST dağıtım 100 µL (olmadan Ca2 +/Mg2 +) tarafından permeabilize ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Ardından, protein PBST % 10 BSA losyonlu 100 µL tarafından engelleme gerçekleştirmek ve nazik bir plaka shaker kullanarak sallayarak içinde 1 h için kuluçkaya. Engelleme protein sonra 4 ° C'de gecede nazik sallayarak bir plaka shaker kullanarak kuluçkaya, 50 µL % 1 BSA birincil antikor içeren PBST ekleyin. Not: protein blok ve antikor ek arasında yıkama yok.</li>
	<li>24 saat sonra (olmadan Ca2 +/Mg2 +) 1 x DPBS üç kez yıkayın ve PBST % 1 BSA losyonlu 50 µL tarafından ikincil antikor ekleyin. Karanlık oda sıcaklığında 1 h kuluçkaya.</li>
	<li>İkincil antikor kuluçka sonra 3 kez 1 x DPBS ile yıkayın. DPBS DAPI ile 50 µL ekleyin (10 µg/mL) ve karanlık oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Son olarak, 3 kez DPBS ile yıkama ve 1 x DPBS 100 µL kuyuda bırakın. Tabak görüntüleme için hazır. Not: Tabak karanlıkta 4 ° C'de görüntüleme kadar muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Plaka bir yüksek-içerik görüntüleme sistemi kullanılarak görüntü ve iyi iyi bir gösterimini elde etmek için iyi arasında çeşitli alanlarda elde. Ifade HLCs farklı işaretlerinin Columbus yazılım (yüksek-içerik görüntüleme analiz sistemi yazılımı) kullanarak ölçmek. Not: Columbus hücre segmentasyon analiz için hücre fenotipleme sunuyor bir yüksek içerik analizi yazılımıdır. CellProfiler, bir açık kaynak yazılım biyolojik görüntüleri22Nicel analiz kullanarak benzer sonuçlar elde edilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Hepatocyte+Injury+and+Necrosis+in+Response+to+Paracetamol+Using+Noncoding+RNAs.">Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).</li><li>Choudhury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+hepatocyte-like+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+model+pazopanib-mediated+hepatotoxicity.">Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity.</a> Sci Rep. 7, 41238 (2017).</li><li>Cameron, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+Laminins+Drive+the+Differentiation+and+Self-Organization+of+hESC-Derived+Hepatocytes.">Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+interindividual+differences+in+hepatic+functions+and+drug+sensitivity+by+using+human+iPS-derived+hepatocytes.">Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+spheroid+culture+of+hESC/hiPSC-derived+hepatocyte-like+cells+for+drug+toxicity+testing.">3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing.</a> Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Iii, R. L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+by+3D-Culture.">Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture.</a> PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).</li><li>Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+mature+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+an+efficient+three-step+protocol.">Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol.</a> Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Self-Renewal+of+Human+ES/iPS-Derived+Hepatoblast-like+Cells+on+Human+Laminin+111-Coated+Dishes.">Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes.</a> Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).</li><li>Kanninen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin-511+and+laminin-521-based+matrices+for+efficient+hepatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. , 86-100 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+prediction+of+drug-induced+liver+injury+using+stem+cell-derived+populations.">Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assay+Multiplexing+for+Toxicity+Screening+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+and+Hepatocytes.">High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes.</a> Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dataset+of+images+and+morphological+profiles+of+30,000+small-molecule+treatments+using+the+Cell+Painting+assay.">A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay.</a> GigaScience. , (2017).</li><li>Pradip, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Content+Analysis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocytes+Reveals+Drug+Induced+Steatosis+and+Phospholipidosis.">High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis.</a> Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).</li><li>Donato, M. T., G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Tolosa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+high-content+screening+technology+for+studying+drug-induced+hepatotoxicity+in+preclinical+studies.">Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies.</a> Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

Prof. David C. Hay bir eş-kurucusu ve Stemnovate sınırlı direktörüdür.
Prof. David C. Hay HigherSteaks Limited direktörüdür.

Bizim yarı otomatik verimli, güvenilir ve ekonomik, HLCs üretimi (Şekil 1) ölçekte sağlayan işlemdir. Hücre tabanlı filtreleme (Şekil 2) için uygun bir yaklaşım bu platform yapma plaka, kuyular arasında hücre sayısı açısından herhangi bir anlamlı bir fark yoktu. Ayrıca, yarı Otomasyon iş akışı kullanıcının hangi manuel süreçleri5,12kullanmadan önce mümkün değildi tabak bir kerede çok sayıda üretmek sağlar.
Önemlisi, Otomasyon işlemi HNF4α ifade hücreleri çoğunluğu ile farklılaşma verimleri üzerinde etkisi olmadı (%89.2 ±2) ve ALB (%92.8 ±6) (Şekil 3). HLCs da CYP P450 enzimleri CYP2D6 ve CYP3A4 ifade ve metabolik aktivite önceki bildirilen deneyler (Şekil 3)5' e benzer CYP1A2 ve CYP3A görüntülenir. Protokol standardizasyon rağmen hücre confluency farklılaşma önce saf HLC farklılaşma için önemlidir. Bu nedenle, bir iyi hücre dağılımı arasında iyi sağlanması önemli bir göz (Şekil 1). Bu hücre kültürünü bağımlı olduğu kanıtlanmıştır, bu nedenle hücre tohum ve yoğunluk optimizasyonu her hücre satırı rahip için ölçek-up gereklidir.
Şu anki haliyle bu platform HLCs klinik uygulamalar için büyük miktarlarda üretmek uygun değildir ve bu büyük olasılıkla hücre fabrikaları ve Biyoreaktörler aracılığıyla gerçekleştirilecektir. Ancak, geliştirilen metodolojisi hastalığı modelleme, uyuşturucu tarama ve/veya uyuşturucu çalışmalar repurposing için insan karaciğer hücrelerinin oluşturmada hızlı izin vermez. Ayrıca, tahlil multiparametric veri kümeleri nesil mekanik analiz için izin çoğullama için mükellef olduğunu. İleriye, aynı zamanda bu teknoloji daha karmaşık vitro sistemlerine 3D farklılaşma gibi veya HLC fenotip vitrogeliştirmek için bir platform olarak uygulanan olabilir inanıyoruz.
Sonuç olarak, basit ve yarı otomatik sistemimiz deneysel iş çıkarma yeteneğini artırmak ve deneysel varyasyon, azaltmak böylece biyolojik veri kümeleri ve onların ekstrapolasyon insan fizyolojisi doğru kalitesini artırma inanıyoruz.

Birincil insan tetkikine (PHHs) temsil eden karaciğer Biyomedikal araştırma ilişkin geçerli standarttır. Onların avantajlara rağmen PHHs kararsız fenotip1olgun tetkikine sınırlı kaynağı temsil eder. İnsan embriyonik kök hücreleri (ESCs) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) yenilenebilir bir kaynak karaciğer2,3,4 de dahil olmak üzere insan dokusunun umut verici Biyomedikal araştırmalar için güçlü bir kaynak olarak önerilmiştir . Geçerli hepatosit farklılaşma yordamlar hepatosit işaretleri, genler ve işlevleri PHHs3,4,5,6,7benzer hızlı hücreler üretmek, 8,9,10,11. Daha yakın zamanlarda, tanımlanmış malzeme ve matrisler rekombinant laminins gibi kullanımı gelişmiş hücre fenotip ve deneysel tekrarlanabilirlik5,12,13,14vardır.
Geleneksel hücre kültürü teknikleri el ile pipetting, hem zaman alıcı ve hata eğilimli olan güveniyorsun. Bu tahlil ve bir çalışabilirsiniz plaka biçimi throughput sınırlar. Bugüne kadar emek yoğun doğa ve bu nedenle küçük ölçekli boyutu15,16,17HLCs nesil açıklayan en çalışmaları vardır.
Geçerli sıvı işlemede ilerler ve pipetting sistemleri, otomatik mikroskobu ve laboratuvar Analizörler, insan müdahalesi gereksinimini en aza indirmek işlemleri geliştirmek mümkün yaptık. Biz bu teknolojilerden almış ve yarı otomatik farklılaşma sistemiyle hangi için temel insan karaciğer dokusu büyük miktarlarda üretmek geliştirilen ve Biyomedikal araştırma uygulanan. Bu yaklaşım insan ESC ve IPSC çizgili küçük ayarlamalar hücre kültürünü bağlı olarak gerekli ile gerçekleştirilebilir. Bu sistem yüksek içerik analizi ile birleştirerek, HLC fenotipleme daha az zaman alıcı ve ölçek18,19,20,21gerçekleştirilen olabilir göstermektedir.
Özet olarak, hücre kültürü teknikleri burada açıklanan Otomasyon iyileştirmeler için güvenilirlik, deneysel zaman yönetimi ve tahlil üretilen işi neden olmuştur.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips for VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube dispensing cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

İnsan pluripotent kök hücreler insan dokusu yenilenebilir kaynağı temsil eder. Bizim araştırma insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) insan karaciğer dokusu oluşturma üzerinde odaklanmıştır ve pluripotent kök hücreler (iPSCs) indüklenen. Geçerli farklılaşma yordamlar fetal ve yetişkin özellikleri karışımı görüntüleme insan hepatosit benzeri hücreler (HLCs) oluşturur. Hücre fenotip artırmak için biz tamamen bizim farklılaşma yordam ve hücre niş geliştirilmiş gen ekspresyonu ve işlev görüntüleyen hücre popülasyonlarının üretimi kaynaklanan tanımladınız. Bu çalışmalar ilerleme işareti olsa da, büyük miktarlarda filtreleme için çok iyi plakaların oluşturma yeteneği emek yoğun yordamlar ve toplu toplu için varyasyon tarafından sınırlı olan. Bu sorunu çözmek için yarı otomatik bir platform pluripotent kök hücreler HLCs. kök hücre tohum içine ayırt etmek için geliştirdiğimiz ve farklılaşma gerçekleştirilen sıvı işleme ve otomatik pipetting sistemleri 96-şey plaka biçiminde kullanarak. Farklılaşma hücre fenotip otomatik mikroskobu ve çok iyi luminometer kullanarak analiz edildi.

Hücre farklılaşması bir embriyonik kök hücre satırı (H9) kullanarak gerçekleştirildi. Yarı otomatik platformu ve dönüşüm (Şekil 1A) hücreleri ayırdetmek için kullanıldı. Bir otomatik sıvı işleme makinesi matris ceket ve tek hücre tohum için kullanıldı. Hücreleri % 40 confluency (gün 0) ulaştığında hücresel başkalaşım başlatıldı. Medya değişikliklerini orta ve orta ek (Şekil 1A) sıvı işleme makinesi kaldırmak için bir otomatik el Elektronik kanal pipet sistemi kullanılarak yapıldı. Hücre fiksasyon ve boyama otomatik sıvı işleme makinesi otomatik kalıp çamaşır makinesi ile birlikte kullanılarak yapıldı. Görüntüleme ve miktar yüksek içerik görüntüleme sistemi ve Columbus yazılım kullanılarak yapıldı. Sitokrom P450 etkinlik kurulan bir tahlil kullanılarak ölçüldü. Substrat kuluçka, hücre supernatants hasat edildi ve bioluminescence multimod Mikroplaka Okuyucu (Şekil 1A) kullanarak kaydedilen. Buna ek olarak, geleneksel faz kontrast mikroskobu hepatosit farklılaşma (Şekil 1B) sırasında hücre morfolojisi değişiklikleri ölçmek için kullanıldı.
Gün 18, cep numarası kuyular arasında değişkenlik (Şekil 2A) boyama DAPI incelenmiştir. Yedi alanları görmek sayısal çekirdeği (Şekil 2A) sayısı başı iyi ele geçirildi. Wells de (Şekil 2B) başına 366 hücre 41,662 ±3, ortalama ile arasında istatistiksel hiçbir farkı tespit ettik.
Gün 18, HLCs sabit ve tipik hepatosit işaretleri (Şekil 3A-G) lekeli ve CYP P450 etkinlik için test. HLCs ifade HNF4α gibi hepatosit işaretleri (%89.2 ±2 pozitif hücrelerinin), ALB (%92.8 ±6 pozitif hücrelerinin), AFP (%61,8 ±2 pozitif hücrelerinin). HLCs da CYP P450 proteinler, CYP2D6 ve CYP3A4 ifade ve E-Cadherin protein ifade tarafından gösterildiği gibi poligonal görünümün faklı bir görünümü görüntülenir. HLCs CYP P450 etkinlik günü 18 ölçüldü. HLCs 295,906 ±45, 828 RLU/mL/mg protein ve CYP3A 1,066,112 ±177, 416 RLU/mL/mg protein (Şekil 3 H), CYP1A2 faaliyet sergiledi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Şekil 1: 96 yılında hepatosit farklılaşma PSC'ler üzerinden de biçimlendirmek. (A). Diyagram araç yarı otomatikleştirmek, hücresel başkalaşım, fiksasyon, boyama, görüntüleme ve fonksiyonel etkinlik için kullandık. (B). temsilcisi HLC farklılaşma sırasında hücresel morfoloji değiştirir. Kısaca, PSC'ler kesin endoderm, Arnavut kaldırımı benzeri morfoloji gösteren hücreleri tarafından ve hepatosit olgunlaşma önce şekli poligonal edinme hücreleri ile karakterize hepatoblast belirtimi ardından doğru astarlanmalıdır. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Resim 2: HLCs iyi şey değişkenlik değerlendirilmesi. (A) 96 gösterimi de plaka DAPI ile lekeli HLCs görünümünü. Ölçek çubuğu 1 mm. (B) = miktar iyi başına hücre sayısı. Cep numarası sütunlar (üst) ve satırlar (alt), yedi alanların sayısı başı iyi quantified Columbus yazılımını kullanarak wells başına ortalama. 41,662 ± 3,366 SEM hücreleri de başına ortalama hücre sayıdır plaka arasında. Kuyular arasında istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edildi. One-way ANOVA Tukey'nın post-hoc istatistiksel testler ile istihdam edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Şekil 3: hepatosit marker ifade ve HLCs CYP P450 etkinlik ölçümü, gün 18. Hepatosit nükleer faktör 4 Alfa yüzdesi (A) (HNF4α) ifade ± SEM on alanları bakış iyi başına otuz kuyu temel alınır. (B) albümin (ALB) ifade + /-SEM, yüzde on alanları bakış iyi ücret 3 ayrı wells üzerinde dayanır. (C) 3 ayrı wells de başına on alanları bakış ile alfa fetoprotein (AFP) SEM +/-yüzdesi dayanmaktadır. (D) E-cadherin boyama. (E) CYP2D6 boyama. (F) CYP3A4 boyama. (G). immünglobulin denetim boyama G (IgG). Ölçek çubuğu 50 µm. (H) CYP P450 1A2 ve 3A metabolik aktivite HLCs gün 18 =. Altı biyolojik SEM etkinlik çoğaltır veri temsil başına 1 mg protein göreli ışık birimleri (RLUs) /mL olarak alıntı yaptı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.

Hepatosit Pluripotent kök hücreler hücreleri gibi yarı otomatik üretimi

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

semi-automated-production-hepatocyte-like-cells-from-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Bu iletişim kuralı insan pluripotent kök hücreler 96 iyi plaka kartvizitlere hepatosit benzeri hücreleri üretmek için yarı otomatik bir yaklaşımı açıklar. Bu hızlı ve uygun maliyetli, hepatosit benzeri hücreler temel ve uygulamalı insan araştırma için toplu halde üretim kalite güvence sağlayan işlemdir.

Video: Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Gelişim Biyolojisi

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

İnsan kullanarak Pluripotent kök hücre kaynaklı hepatosit benzeri hücreler indüklenen ilaç bulma için

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Pluripotent kök hücrelerinden üç boyutlu ınsan Hepatokürlerin serum ücretsiz üretimi

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Popülasyonlar Hepatosit gibi Hücreleri Sağlam Nesil

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biyoloji

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

iPSC'den Türetilmiş 3D İnsan Hepatik Organoidlerinin Üretilmesi için Bütünleştirici Protokol

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Hepatosit Benzeri Hücre İndüksiyonu İçin Etkili Bir Yöntem

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi ile Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasının İzlenmesi

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available PSC-to-functional cell differentiation systems are impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Precise control of cell differentiation in real time is therefore important. In this protocol, we describe a non-invasive and intelligent strategy that overcomes the variability in cell differentiation by using bright-field image-based machine learning. Taking PSC-to-cardiomyocyte differentiation as an example, this methodology provides detailed information for control of the initial PSC state, early assessment and intervention in differentiation conditions, and elimination of the misdifferentiated cell contamination, together realizing consistently high-quality differentiation from PSCs to functional cells. In principle, this strategy can be extended to other cell differentiation or reprogramming systems with multiple steps to support cell manufacturing, as well as to further our understanding of the mechanisms during cell fate conversion.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Canlı Hücre Parlak Alan Görüntülemeye Dayalı Makine Öğrenimi Modellerini Kullanarak PSC'den İşlevsel Hücre Farklılaşmasını Geliştirme

Available pluripotent stem cell (PSC)-to-functional cell differentiation systems are currently impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Here, using cardiac differentiation as the main example, we present a protocol to intelligently monitor and modulate the process of PSC differentiation based on image-based machine learning.

Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...