Bu metogenetik insan pluripotent kök hücrelerinin 3D hepatospheres büyük miktarda ince malzeme ve montaj hücreleri kullanarak. Bu tekniğin ana ilerlemesi, 3Boyutlu karaciğer kürelerinin boyutunun kontrol edilmesine, nekrotik merkezlerin oluşumunun ve fenotip kaybının sınırlandırılmasına olanak sağlamasıdır. Prosedürü benimle birlikte göstermek Yu Wang olacak, laboratuarımızda doktora sonrası.
100 mililitre steril distile suda iki gram düşük erime sıcaklığında agarose eriterek agarose kalıplarını sunmaya hazırlanın. Dikkatle tamamen agarose eritmek için sallayarak aralıklı mikrodalga karışımı ısıtın. 256 iyi biçimli bir kalıp için erimiş agarose 520 mikrolitre ekleyin ve katılaşmak için izin.
Daha sonra, her agarose mikro plaka12-iyi plaka tek bir kuyuiçine aktarın. Kabarcıkları gidermek için her kuyuya kalsiyum ve magnezyum ile 1,5 mililitre DPBS ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için, ortamı insan pluripotent kök hücrelerinden veya HPSC'lerden farklılaşmamış bir kültürden alarak başlayın.
Oda sıcaklığında DPBS, kalsiyum veya magnezyum ücretsiz beş mililitre ekleyerek hücreleri durulayın ve sonra tampon kaldırın. Hücrelere beş mililitre hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve 6-8 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir mikroskop altında hücre müfrezesini gözlemleyin ve gerekirse kuluçka süresini bir veya iki dakika daha uzatın.
Hücre dissosiasyon reaktifini çıkararak ve beş mililitre taze MT ekleyerek reaksiyonu durdurun 10 mikromolar kaya inhibitörü, Y27632 ile desteklenen bir ortam hizmet vermektedir. Pipet hücreleri ayrıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı. Gerekli toplam hücre sayısını hesaplamak için hemositometre ve trypan mavi boyama ile canlı hücreleri sayın.
Hücreleri pelet için beş dakika için 200 kez G steril 15 veya 50 mililitre centrifuge tüp ve santrifüj istenilen sayıda hücre aktarın. Supernatant atın ve yeniden MT hücreleri askıya mililitre başına 2,1 milyon hücre nin son konsantrasyonu için 10 mikromolar kaya inhibitörü ile bir orta hizmet vermektedir. Daha sonra, agarose mikro kuyu başına hazırlanan hücre süspansiyon 190 mikrolitre ekleyerek hücreleri kaydedin ve iki saat boyunca yüzde beş karbondioksit 37 santigrat derece agarose mikro plakaları kuluçka.
Kuluçka sonra, taze bir mililitre ekleyin, sıcak, T-her kuyuya kaya inhibitörü ile bir orta hizmet. Plakaları kuvöze geri ver ve 24 saat orada bırak. Ertesi gün, oluşum alanını inceleyin.
Poli-iki hidroksitil metakrilat veya poli-hema kaplı kuyuları 100 mililitre lik %95 etanolde iki gram poli-hemayı eriterek ve çözeltiyi bir gecede 55 derece lik bir sıcak plakaüzerinde karıştırarak hazırlayın. Ertesi gün, 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna çözeltinin 250 mikrolitresini ekleyin ve tabağı bir gecede 60 derecelik bir fırında kurulayın. MT'yi dikkatlice çıkararak hepatosit farklılaşmasını başlatın ve bir mililitre taze endoderm farklılaştırma ortamı ile değiştirin.
İnsan embriyonik kök hücreleri için, üç gün boyunca her 24 saatte bir orta yenileyin. Spontan hücre farklılaşmasını önlemek için tohumlamadan 24 saat sonra hepatosit farklılaşmasını başlatmak önemlidir. Kesin endoderm indüksiyonundan sonra, orta yı hepatoblast farklılaştırma ortamına beş gün boyunca çevirin.
Hepatoblast belirtiminin son gününde son değişikliği gerçekleştirecek şekilde, her iki günde bir ortamı değiştirin. Hepatosferleri hazırlanmış poli-hema kaplı kuyulara aktarmak için hücreleri hepatosit olgunlaşma ortamıyla yıkayın ve daha sonra mililitre HGF'de 10 nanogram ve mililitre OSM'de 20 nanogram ile desteklenen bir mililitre orta yıkın. Pipet yukarı ve aşağı agarose mikro plaka hepatosferler kaldırmak ve bir poli-hema kaplı iyi aktarmak için birkaç kez çözüm.
Agarose mikro plakayı bir mililitre tamamlayıcı hepatosit olgunlaşma ortamı ile yıkayın ve ortayı poli-hema kaplamalı kuyuya aktarın. P-100 pipet kullanarak, kuyuda yaklaşık bir mililitre orta kalana kadar hepatosferleri çıkarmadan aşırı ortamı dikkatlice aspire edin. 12 gün boyunca her 48 saatte bir ortamı yenileyin.
Embriyonik kök hücrelerle çalışıyorsanız, olgunlaşma ortamını çıkararak, hücreleri bakım ortamıyla yıkayarak ve bir mililitre eklenmiş bakım ortamı ekleyerek 20. Bundan sonra, her 48 saatte bir orta yenileyin. Bu sferik yapının ciddi stres ve bozulmasını önlemek için acil değişiklikler dikkatle yapılmalıdır.
Mezenkimal belirteçlerde hepatosit boyama, bu teknikkullanılarak oluşan hepatosferlerin mezenkimal hücrelerin çekirdeğini çevreleyen hepatosit benzeri hücrelerden oluştuğunu söyler. Genellikle hepatositlerde ifade edilen diğer proteinler de kürelerin dış tabakasında bulunur. 30 günlük hepatosfer kültürlerinde sitokrom P450 enzimlerinin veya CYP'nin fonksiyonel analizi, 3Boyutlu kürelerin insan primer hepatositlerine göre saygın CYP aktivitesi düzeyleri gösterdiğini göstermiştir.
Ayrıca hepatoferlerin Albumin ve alfa-fetoprotein gibi karaciğer proteinlerini salgıladığı da gösterilebilir. Bu protokol için hatırlanması gereken en önemli şey, 3D hepatoferiçeren çözeltiyi poli-hema kaplı tabağa aktarırken yavaşça yukarı ve aşağı pipetlemektir. Bu onlara zarar önlemeye yardımcı olur.
Bir kez hakim, Bu metodoloji decease modelleme ve ilaç tarama birden fazla uygulama ile bir yıl in-vitro üzerinde fonksiyonel kalır 3D karaciğer kürelerinin nesil sağlar. İleriye bakıldığında, bu teknoloji karmaşık mimarileri ile daha fazla entodermal ve mezenkimal dokular geliştirmek için bir platform olarak istihdam edilebilir.
