Max Planck Derneği bu araştırma yanı sıra son ayarı kadar kararlı izotop Laboratuvarı bölümü Arkeoloji, Max Planck Enstitüsü bilim insanlık tarihinin için finansman için teşekkür etmek istiyorum.

Aşağıdaki protokol kuralları ışık izotop kütle spektrometresi laboratuvar Max Planck Enstitüsü'nde insanlık tarihinin bilim izler. Ulusal ve uluslararası komiteler izinlerinden uygun etik nesli tehlike altında olan modern ya da tarihsel faunal örnekler içeren analizleri ve çağdaş paydaşların ilgi arkeolojik ve faunal malzeme kullanımı için aranan olmalıdır . Bu yazıda, arkeolojik ve fosil örnekleri kullanılan örnekleri vardı. Hiçbir yaşayan insanlar bu çalışmada kullanılan ve tam etik, kurumsal ve hükümet izinleri yıkıcı herhangi bir analiz için elde edilmiştir.
1. toplu örnekleme
Not: insanlar ve hayvanlar için toplu temel yöntemi diş mine bir tatbikat uygulama dişin bukkal kenarına örnektir.
<ol><li>Blaster vurdu bir alüminyum kullanarak diş (~0.1 mm) veya hafif aşınma matkap kurulumu kullanarak dış yüzeyi temizleyin. Bir el matkap (aşağıya bakın), matkap set-up bir chuck ile bağlı bile şeklinin biraz temiz elmas uçlu matkap ile kullanın. Nazik ve hatta aşınma bir oluk tüm büyüme eksenine paralel olarak gerçekleştirilmesini sağlamak (resim 1 ve Şekil 2).</li>
	<li>, Mümkün olan yerlerde, her insan için aynı diş bölümünde veya örneklenmiş hayvan yöntemi uygulamak girişimi. Not: ilk büyük azı dişleri etkileri23sütten kesme nedeniyle önlenmesini iken insan paleodietary araştırma, üçüncü büyük azı dişleri genellikle temsilcisi geç Genç/Yetişkin diyet olarak tercih. Tercih edilen diş her takson ve temsil, yaşam süresi için kullanılabilir örnekler ve soru altında eğitim ile değişir.</li>
	<li>İyi havalandırılmış bir odada diş minesini toz teneffüs önlemek için bir maske giyerken matkap. Gözleri korumak için gözlük takıyorum. Delinmiş örnek toz miktarı analizi, tedavi öncesi Protokolü ve diş boyutunu için kullanılan ekipman bağlı olarak değişir unutmayın. Örnek ısınma önlemek için düşük hızda matkap. Not: Yaklaşık, 4-8 mg örnek toz izotop oranı kütle spektrometresi ve diagenetic sınamak için bir online Gaz hazırlama ve giriş sistemi kullanarak birden çok analizleri için uygun bir hedef olduğunu. Seçilen matkap hız örnek kırılganlık bağlıdır ve deneme yanılma belli bir düzeyde gerektirir unutmayın. Genel olarak, bir el matkap üzerinde iki beş Bar güç yeterlidir. Diş tozu temiz alüminyum folyo bir parçası üzerinde matkap veya kağıt ağırlığında.</li>
	<li>Elde edilen emaye toz toplamak ve delme önce uygun şekilde hassas bir denge üzerinde Şeytan 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü aktar. Her tüpün örnek atama (Şekil 3) ile etiketleyin. Örnek numaraları ve emaye ağırlık Laboratuvarı dizüstü yanı sıra elektronik bir veritabanını kaydedin.</li>
	<li>Her yeni diş delme önce ilk 0.5 M HCl sağlam doku üzerinde kullanarak kullanılan Matkap burguları temiz. Sonra matkap (aseton, metanol veya etanol gibi) organik bir çözücü ile yıkayın sağlam kağıt mendil kullanarak.</li>
	<li>Otururken, sondaj takip temiz iyice kullanarak özel bir çalışma alanı elektrikli süpürge, ya da bir faraş ve fırça. Metanol ile örnekleme alanı silin. Vakum veya hafifçe örnekleri arasında toz ve örnek toz kaldırmak için sıkıştırılmış hava ile matkap sprey.</li>
</ol>2. ardışık örnekleme
Not: Ardışık örnekleme çeşitli biçimlerde yaklaştı ve takson diş yanı sıra istenen zamansal çözünürlük boyutunu örnek, üzerinde bağlıdır.
<ol><li>Çok ince kaldırarak örnek diş yüzeyine temiz dış diş minesini tabakası (~0.1 mm).</li>
	<li>Örnekler diş taç tepesine emaye kök kavşak çalışan, büyüme eksenine dik bukkal yüzey boyunca matkap. Matkap yatay bantlar büyüme eksenine dikey bir 1-2 mm geniş oluk emaye katmanı arasında çıkan her örnek ile (Şekil 1 ve Şekil 4). Örnek ve elde edilen ölçüm kontamine gibi emaye dentin içine aracılığıyla Delme önlemek için dikkat ediniz. Not: Örnekleri sayısı istenen çözünürlüğüne bağlı olarak değişecektir ama c. 10/δ13C ve δ18O değerleri bir hypsodont Evcil hayvanların boyutu için mevsimsel değişiklikler çalışmaya uygun bir hedef gösterir.</li>
	<li>Örnekleme çizginin genişliğini matkap çapı tarafından belirlenen uygun matkap her örnek için seçin.</li>
	<li>Teçhizat set-up artımlı örnekleri (Şekil 2) daha fazla sayıda gerektiren daha hassas dişler için kullanın (Örneğin., insan dişleri), yanı sıra daha istikrarlı delme gibi için. Matkap, güvenli bir şekilde, matkap aşağı doğru işaret tutan teçhizat stand ayarlayın. Not: dört örnekleri el yaklaşım24kullanarak kalıcı insan azı kolayca elde edilebilir, ancak daha rafine örnekleme bir teçhizat gerektirir veya olmayacak CO2 lazer ablasyon yaklaşımı burada14ele. Başka bir ortak yaklaşım bir yarı otomatik microsampling25kullanmaktır.</li>
	<li>Diş tutun veya bir kelepçe takın. Diş minesini karşı matkap basın ve basınç uygulayın. Örnekleri artımlı olarak bukkal yüzeyi boyunca apex (oklüzal yüzey) için emaye-kök Kavşağı (ERJ) bulunduğu konumda taç Bankası gidilen. Strateji her ardışık çizgi paralel önceki örnek satıra birden çok kez sondaj sondaj aynı örnek çoğaltma. Küçük silindirik elmas matkap gibi koyun büyük azı dişleri, çapı 1 mm (Şekil 1 c) ile hassas dişler için kullanın.</li>
	<li>Çap pergeli kullanarak ERJ her örnekleme satırından uzaklığı ölçmek ve bu mesafe ürününü karşılaştırma listesine kaydedin.</li>
	<li>Adımları 1.3-1.6 yukarıdaki izleyin. Not: hassas dişleri çözümlenmekte ve tedavi öncesi ve diagenetic kontrol yöntemleri uygulanmaz, örnekleri 1-4 mg küçük bir on-line Gaz hazırlama ve giriş set-up karbonat analizi için üzerinde güvenilir sonuçlar üretecektir. Değiştirilen otomatik-periferik sistemleri daha düşük örnek ağırlıkları kullanımını kolaylaştırabilir, ancak kaçınılmaz olarak karbonat okudu emaye (wt % 4-5)26,27' deki oranı tarafından sınırlı. Araştırmacılar laboratuarda örnekleri örnek gerekli miktarını belirlemek için ölçülebilir nereye başvurmanız gerekir.</li>
</ol>3. Fourier Transform Infrared spektrometresi/Attenuated toplam yansıma yöntemi
<ol><li>Toplam yansıma zayıflatılmış yöntemi için bir örnek odası arka plan, vakum altında veya normal atmosferik koşullar oluşturun.</li>
	<li>Diş minesini yaklaşık 1 mg bir spatula kullanarak örnek odasında elmas kristal üzerine getirin. Daha düşük ve sonrası, örnek ve elmas plaka arasında sıkı bir bağlantı kadar örnek sonrası güvenli. Örnek odası ile veya olmadan bir vakum kuruluyor, ayarı veya kullanılabilirlik bağlı olarak kapatın.</li>
	<li>64 kez wavenumber 400 ile 4000 cm-1arasında değişen için örnek FTIR spectra ölçmek. İdeal olarak farklı aliquots alınan ve sonra döndürülen örnek konut microcentrifuge tüp ile üç çoğaltır analizini sağlam sonuçları sağlayacaktır rağmen çoğaltır istediğiniz sayıda çalışma, hedeflere göre değişiklik gösterir.</li>
	<li>Spatula ile metanol her aliquot arasında her örnek arasında temiz.</li>
	<li>Mevcut yazılım kullanarak temel düzeltme gerçekleştirin. Yazılım otomatik olarak elde edilen FTIR profili örnek odası kökenli çıkarır. Daha iyi tekrarlanabilirlik emin olmak için sadece emaye spectra 0,06 ~1035 cm-1 , en yüksek fosfat grubu en az bir absorbans ile dikkate alınmalıdır.</li>
	<li>Ortak ikincil kirletici karbonat kalsit tüm örneklerde varlığı 711 cm-1zirve denetleyerek izlemek.</li>
	<li>Analiz, dikkatle örnekleri bir spatula veya emme cihazı kullanarak kendi microcentrifuge tüpler dönmek ve Önarıtma veya analiz sonraki sahneye götür.</li>
	<li>Bir .csv dosyası olarak (veya benzeri) ham dalga boyu ve yoğunluğu verileri verme ve faiz endeksi hesaplamak için kullanın (yaygın olarak kullanılan dizinler dahil A-site fosfat dizini, B-site fosfat dizini, fosfat Crystallinity indeksi, su-Amid fosfat dizin üzerinde ve CO3/PO4 17,18,19dizin) (Tablo 1).</li>
	<li>FTIR modern faunal diş minesini veri kümeleri doğa ve diagenetic değişiklik için kapsamını belirlemek için edebiyat19,20 dakikaya kullanılabilir büyüyen şimdi için fosil veya arkeolojik örneklerinden sonuçları Karşılaştır örneklenmiş emaye.</li>
</ol>4. basit asetik asit (0,1 M) Önarıtma
<ol><li>Emaye toz her örnek için bir denge uygun şekilde kullanarak bir microcentrifuge tüp tartın. Buna göre tüp etiketleyin. Emaye toz parçacıkları benzer büyüklükte ile aynı derecede toprağa olmalıdır. Not: Pek çok araştırmacı seyreltik çamaşır suyu (NaClO) gibi bir oksitleyici ajan kullanmak veya % 30 hidrojen peroksit (H2O2) bir örnek ve bu organik kaldırmak için bu noktada eklenmelidir. Ancak, sadece bu reaktifler kararlı karbon ve oksijen izotop değerleri örneği alter, ama % 100 fosforik asit karbonat içinde kullanılan spectra kemik kollajen numunelerin hazırlanması ve giriş bir on-line gaz sisteminde göstermek ölçüm organik örnekler (Şekil 5), bu adım gerekli değildir düşündüren tepki vermez.</li>
	<li>0.1 mL 0.1 M asetik asit (başına 1 mg emaye) bir pipet kullanarak her örnek ekleyin. Pipet örnekleriyle dokunmaktan kaçının. Örnek ve pipet kişiye gelirsen, çapraz bulaşma önlemek için sonraki örnek için yeni bir pipet kullanın.</li>
	<li>Kışkırtmak, sallayarak veya bir elektronik karıştırıcı (Şekil 3) ve sonra 10 dk. emaye toz uzun bir süre için asetik asit bırakılmamalıdır için oturmak örnekleri bırakın (> 4 h).</li>
	<li>Örnekleri microcentrifuge 13,700 x g de 2 min için yerleştirin. Not: Bir düşük maliyetli alternatif daha az örnekleri tutan ancak zaman büyük örnek kümeleriyle ilgili daha az zaman alıcı 3.500 x g, 4 dk için mini santrifüj kullanmaktır.</li>
	<li>Microcentrifuge programı sona erdiğinde, asetik asit 2 mL Ultrasaf Su temiz bir pipet, sonra microcentrifuge 13,700 x g de 2 min için örnekler kullanarak değiştirin.</li>
	<li>Ultrasaf Su iki kez daha önceki gibi değiştirmek ve tarafsızlık için test. Kalan sıvı bir pipet (süpernatant bozmadan) kullanarak kaldırın. Not: Tarafsızlık için almak için standart bir prosedür Ultrasaf Su ile üç yıkama toplamıdır. Tarafsızlık ulaşılana kadar örnek yıkanmalıdır.</li>
	<li>Parafilm (1 cm × 1 cm) yaprak keser ve her microcentrifuge tüp yerleştirir. Örnek uygun şekilde kurur keskin bir nesne kullanarak ortasında küçük bir delik açmak.</li>
	<li>Tüpler bir dondurucuda kalan herhangi bir sıvı kaldırmak için kuru yerleştirin. Not: bir donma kurutma makinesi kullanılabilir, yumuşak fırın ise kurutma (40 ° C) da bir olasılık ve kararlı karbon ve oksijen izotop verileri herhangi bir yan etkisi olmamalıdır.</li>
	<li>Bir kez kuru, Parafilm kaldırmak ve microcentrifuge kapaklarını kapatın. Tüp etiketleme doğru olduğundan emin olun ve yeniden yazmak gerekirse. Not: Bu ın labs sınırlı fonları ile örnekleri dağıtım öncesinde son aşamada başka bir yerde analiz için olabilecek, tartmak için depolama önce son aşamada olduğunu.</li>
</ol>5. tartma ve örnekleri ve standartları ölçme
<ol><li>Bir spatula kullanarak, yaklaşık olarak 2 mg emaye tozu 0,001 mg (Şekil 6) hassas bir denge üzerinde teneke diske dışarı tartın. Ardından dikkatle örnek fosforik asit dirençli borosilikat cam şişe aktarın. Emaye bu miktarı nedeniyle karbonat diş mine nispeten küçük oranda güvenilir sonuç vermeye gerek yoktur.</li>
	<li>Spatula metanol kullanarak örnekleri arasında temiz ve taze, temiz bir disk kullanın veya her örnek için gemi ağırlığında.</li>
	<li>IAEA NBS18, IAEA 603, IAEA CO8 veya Merck CaCO3gibi uluslararası bir standart 0.2 mg tartın. Şirket içinde bir standart büyük bir diş minesini homojenize yapılan iyi20kullanılabilir. 76 örnekler ve standartları, kullanım 61 örnekleri ve 15 standartlarına tam bir çalışma için hangi eşit olarak dağıtılacak bütün Çalıştır. Çeşitli çalışmalarda standartlar ve arkeolojik araştırmalar20,28ayrıntılarda uygun sayıda bildirdi. Not: Tekrarlanan Önarıtma ve ishal arkeolojik örneklerin bir dizi genelinde ev standart bir emaye analizini de okudu örnekleri için uygun bir tedbir doğruluğu sağlamak büyük olasılıkla20.</li>
	<li>Özel olarak tasarlanmış kapakları, septum sıkı ama değil şişeyi sucked kadar iğne için erişilebilir sıkın. Septum üzerinde baskı çok güçlü alacak ve sonuçta kırık bir iğne çözümleme sırasında neden olabilir gibi üzerinde kapağı sıkın değil. Tüpleri Isıtma bloğun 70 ° C'de listelenen sırayla yerleştirin Sırasını ve örnekler ağırlıkları güvenilir bilgisayar yazılımı girdiği için kaydedilmelidir.</li>
	<li>Üç adım takip ederek örnekleri ölçmek: 1) floş örnekleri ile saf helyum doldurun, 2) fosforik asit ekleyin, 3) ölçmek örnek.<ol>
<li>Saf helyum (grade 5.0) 100 mL/dk ortam havası floş 5 min için bir akış ile örnekleriyle floş.</li>
		<li>4-5 damla fosforik asit (% 99, Yoğunluk 1.85 g/mL) karbonat içeren örnek. Örnek ve H3PO4 arasındaki reaksiyon başlar. Reaksiyon sırasında CO2 Karbonat İyon CO32 - örnek izotopik değerini taşıyan yayınlandı.</li>
		<li>CO2 denge ulaşılana kadar örnek başına 1 saat bekleyin. 1 saat sonra örnekleri güvenilir sonuçlar elde etmek için ölçülmelidir. Sırasında satın alma, bir örnek gazı karışımı ve cihazın o geçer. Kurutma bir sahne örnek Gaz karışım su kaldırır.</li>
		<li>Örnek üç CO2 başvuru gaz bilinen izotopik bileşimi ile doruklarına başlayarak ölçmek. En yüksek yoğunluk yoğunluğu (arasında 4000-8000 mV) örnek doruklarına eşleştirmek için 4000 mV olmalıdır. Üç başvuru gaz doruklarına 20 sn uzun ve 30 sn ayrı olmalıdır. Ölçüm aralığı örnek tanımlama ile izleyin. Örnek 5 için 10 kez ölçmek s her ve 55 s ayrı. Pik yüksekliği uygun taşıma örnek/helyum karışımı (Şekil 5) gösteren zaman içinde azalır emin olun. Not: ölçüm sırasında bilinen izotopik değeri, pik yüksekliği ve başvuru gaz pik yüksekliği olan tepe ve alanları örnekleri doruklarına karşılaştırarak örnek izotopik kompozisyon yazılım hesaplar. Ham 13C /12C ve 18O /16O kompozisyon örnek hesaplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri ölçüm sonra normale. Not: başvuru gaz aynı kimyasal ve fiziksel yolu kütle spektrometre tanıttığında örnek gaz olarak geçmesi değil çünkü bu önemlidir. Bu nedenle, bu örnekleri Ayrıca bu aynı fiziksel ve kimyasal tedavi çalışması içinde örnek olarak20tabi uluslararası standartlara (adım 5.3) kalibre esastır. Bu uluslararası karbonat standartları üzerine Uluslararası delta ölçüm ölçek örnekleri iki nokta kalibrasyon ve hassasiyet ve tekrarlanabilirlik belirli bir çalışma boyunca değerlendirilmesi etkinleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Balasse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+dietary+and+environmental+history+from+enamel+isotopic+analysis:+time+resolution+of+intra-tooth+sequential+sampling.">Reconstructing dietary and environmental history from enamel isotopic analysis: time resolution of intra-tooth sequential sampling.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 12 (3), 155-165 (2002).</li><li>Balasse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+biases+in+sampling+design+and+interpretation+of+intra-tooth+isotope+analysis.">Potential biases in sampling design and interpretation of intra-tooth isotope analysis.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 3-10 (2003).</li><li>Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+isotopes+and+old+bones.">On isotopes and old bones.</a> Archaeometry. 50 (6), 925-950 (2008).</li><li>Clementz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insight+from+old+bones:+stable+isotope+analysis+of+fossil+mammals.">New insight from old bones: stable isotope analysis of fossil mammals.</a> Journal of Mammalogy. 93 (2), 368-380 (2012).</li><li>Loftus, E., Roberts, P., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isotopic+generation:+four+decades+of+stable+isotope+analysis+in+African+archaeology.">An isotopic generation: four decades of stable isotope analysis in African archaeology.</a> Azania: Archaeological Research in Africa. 51 (1), 88-114 (2016).</li><li>Ventresca Miller, A. R., Makarewicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+approaches+to+pastoralism+in+prehistory:+Diet,+mobility,+and+isotopic+reference+sets.">Isotopic approaches to pastoralism in prehistory: Diet, mobility, and isotopic reference sets.</a> Isotopic Investigations of Pastoralism in Prehistory. , 1-14 (2018).</li><li>Hollund, H. I., Ariese, F., Fernandes, R., Jans, M. M. E., Kars, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+an+alternative+high-throughput+tool+for+investigating+bone+diagenesis:+FTIR+in+attenuated+total+reflection+(ATR)+mode.">Testing an alternative high-throughput tool for investigating bone diagenesis: FTIR in attenuated total reflection (ATR) mode.</a> Archaeometry. 55 (3), 507-532 (2013).</li><li>LeGeros, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+phosphates+in+oral+biology+and+medicine.">Calcium phosphates in oral biology and medicine.</a> Monographs in oral sciences. 15, 109-111 (1991).</li><li>Lee-Thorp, J. L., Van Der Merwe, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+isotope+analysis+of+fossil+bone+apatite.">Carbon isotope analysis of fossil bone apatite.</a> South African Journal of Science. 83 (11), 712-715 (1987).</li><li>Cerling, T. E., Harris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+isotope+fractionation+between+diet+and+bioapatite+in+ungulate+mammals+and+implications+for+ecological+and+paleoecological+studies.">Carbon isotope fractionation between diet and bioapatite in ungulate mammals and implications for ecological and paleoecological studies.</a> Oecologia. 120 (3), 347-363 (1999).</li><li>Koch, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+study+of+the+biology+of+modern+and+fossil+vertebrates.">Isotopic study of the biology of modern and fossil vertebrates.</a> Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science. , 99-154 (2007).</li><li>Nelson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wheeler's Dental Anatomy, Physiology and Occlusion-E-Book. , (2014).</li><li>Tsutaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cradle+to+grave:+multi-isotopic+investigations+on+the+life+history+of+a+higher-status+female+from+Edo-period+Japan.">From cradle to grave: multi-isotopic investigations on the life history of a higher-status female from Edo-period Japan.</a> Anthropological Science. 124 (3), 185-197 (2016).</li><li>Sponheimer, M., Passey, B. H., De Ruiter, D. J., Guatelli-Steinberg, D., Cerling, T. E., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+evidence+for+dietary+variability+in+the+early+hominin+Paranthropus+robustus.">Isotopic evidence for dietary variability in the early hominin Paranthropus robustus.</a> Science. 314 (5801), 980-982 (2006).</li><li>Lee-Thorp, J., Sponheimer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+case+studies+used+to+reassess+the+reliability+of+fossil+bone+and+enamel+isotope+signals+for+paleodietary+studies.">Three case studies used to reassess the reliability of fossil bone and enamel isotope signals for paleodietary studies.</a> Journal of Anthropological Archaeology. 22 (3), 208-216 (2003).</li><li>Zazzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+and+enamel+carbonate+diagenesis:+a+radiocarbon+prospective.">Bone and enamel carbonate diagenesis: a radiocarbon prospective.</a> Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology. 416, 168-178 (2014).</li><li>Sponheimer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isotopic paleoecology of the Makapansgat Limeworks fauna (Australopithecus africanus, South Africa). , (1999).</li><li>Sponheimer, M., Lee-Thorp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+enamel+carbonate+environments+during+fossilization.">Alteration of enamel carbonate environments during fossilization.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (2), 143-150 (1999).</li><li>Roche, D., S&#233;galen, L., Balan, E., Delattre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+assessment+of+Miocene-Pliocene+tooth+enamel+from+Tugen+Hills+(Kenyan+Rift+Valley)+through+FTIR,+chemical+and+stable-isotope+analyses.">Preservation assessment of Miocene-Pliocene tooth enamel from Tugen Hills (Kenyan Rift Valley) through FTIR, chemical and stable-isotope analyses.</a> Journal of Archaeological Science. 37 (7), 1690-1699 (2010).</li><li>Roberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+all+archaeologists:+guidelines+for+terminology,+methodology,+data+handling,+and+reporting+when+undertaking+and+reviewing+stable+isotope+applications+in+archaeology.">Calling all archaeologists: guidelines for terminology, methodology, data handling, and reporting when undertaking and reviewing stable isotope applications in archaeology.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li><li>Snoeck, C., Pellegrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+bioapatite+carbonate+pre-treatments+for+isotopic+measurements:+Part+1-Impact+on+structure+and+chemical+composition.">Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 1-Impact on structure and chemical composition.</a> Chemical Geology. 417, 394-403 (2015).</li><li>Pellegrini, M., Snoeck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+bioapatite+carbonate+pre-treatments+for+isotopic+measurements:+Part+2-Impact+on+carbon+and+oxygen+isotope+compositions.">Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 2-Impact on carbon and oxygen isotope compositions.</a> Chemical Geology. 420, 88-96 (2016).</li><li>Wright, L. E., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+carbon+and+oxygen+isotopes+in+human+tooth+enamel:+identifying+breastfeeding+and+weaning+in+prehistory.">Stable carbon and oxygen isotopes in human tooth enamel: identifying breastfeeding and weaning in prehistory.</a> American Journal of physical anthropology. 106 (1), 1-18 (1998).</li><li>Roberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruits+of+the+forest:+Human+stable+isotope+ecology+and+rainforest+adaptations+in+Late+Pleistocene+and+Holocene+(&#8764;+36+to+3+ka)+Sri+Lanka.">Fruits of the forest: Human stable isotope ecology and rainforest adaptations in Late Pleistocene and Holocene (&#8764; 36 to 3 ka) Sri Lanka.</a> Journal of human evolution. 106, 102-118 (2017).</li><li>Zazzo, A., Balasse, M., Patterson, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+&#948;13C+intratooth+profiles+in+bovine+enamel:+Implications+for+mineralization+pattern+and+isotopic+attenuation.">High-resolution &#948;13C intratooth profiles in bovine enamel: Implications for mineralization pattern and isotopic attenuation.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 69 (14), 3631-3642 (2005).</li><li>Sydney-Zax, M., Mayer, I., Deutsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonate+content+in+developing+human+and+bovine+enamel.">Carbonate content in developing human and bovine enamel.</a> Journal of dental research. 70 (5), 913-916 (1991).</li><li>Rink, W. J., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tests+for+diagenesis+in+tooth+enamel:+ESR+dating+signals+and+carbonate+contents.">Tests for diagenesis in tooth enamel: ESR dating signals and carbonate contents.</a> Journal of Archaeological Science. 22 (2), 251-255 (1995).</li><li>Szpak, P., Metcalfe, J. Z., Macdonald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+calibrating+and+reporting+stable+isotope+measurements+in+archaeology.">Best practices for calibrating and reporting stable isotope measurements in archaeology.</a> Journal of Archaeological Science: Reports. 13, 609-616 (2017).</li><li>Wright, L. E., Schwarcz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correspondence+between+stable+carbon,+oxygen+and+nitrogen+isotopes+in+human+tooth+enamel+and+dentine:+infant+diets+at+Kaminaljuyu.">Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).</li><li>Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+alteration+of+mammalian+tooth+enamel.">Isotopic alteration of mammalian tooth enamel.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Başarılı (toplu ve artımlı) örnekleme sorunları diş bilgi erişimine sondaj teknikleri ile ilgili olarak ve numune hazırlama, nispeten ucuz ekipman yatırımı yanında. Bu sorunlara açık zaman örnekleme ve tedavi öncesi yaklaşımları ile ilgili yönergeler mevcuttur kolayca halledilebilir. Bu makalede, bunlar açık, özlü bir biçimde araştırmacılar bu yöntemlere yeni için Dissemine umuyoruz. Bilim adamları ilk kez bu yöntemleri uygulayarak önce analiz ve örnekleme değerli örnekleri arkeoloji...

Diş minesini karbonat stabil karbon ve oksijen izotop analiz insan diyet alımı, sütten kesme ve mobilite yanı sıra bitki örtüsü, hayvan ve hayvan foddering hareketi faunal güven geçmiş çalışma için kullanılmıştır. Bu uygulamalar edilmiş kapsamlı bir şekilde ele ve çevresel koşullar yerel kurutmak, sıcaklık, su kaynakları ve bitki örtüsü besteleri1,2, etkileri gösteren çeşitli için gözden 3,4,5,6. Arkeoloji ve paleontoloji potansiyel uygulamalar çeşitliliği yanı sıra diş minesini karbonat, iyi korunması, kararlı izotop çalışmaları3için çekici bir malzeme sağlamıştır. Örnekleme, Önarıtma ve diagenesis tarama yöntemleri bir dizi önceki yayınları1,7kısaca açıklanmıştır. Ancak, ayrıntılı sözlü ve görsel gösteriler büyük ölçüde kullanılamaz, özellikle için insanlar dışında arkeolojik fen laboratuarları ve nerede bu tekniğin kullanımı ilgi artmaktadır sınırlı fonları ile laboratuvar grupları arasında kalır 5.
Diş minesini öncelikle hidroksiapatit (bioapatite) crystallites8 / kemik yapım o öldükten sonra diagenetic iyonik oyuncu değişikliği ve kirlenme3daha dayanıklı, daha büyük oluşur. Modern çalışmalar kararlı karbon izotop (δ13C) ölçümleri faunal diş güvenilir bir şekilde kayıt hayvan beslenme ve davranış9,10emay gösterdi. Diş minesini istikrarlı oksijen izotop (δ18O) değerinin bitki ve hayvan gıdalar, içme suyu, solunum yanı sıra çeşitli çevresel etkileri su su içeren alınan su, oksijen izotopik bileşimi tarafından belirlenir daha fazla izotopik ayırma için neden olabilir (Örn., kuraklık, sıcaklık, rakım, yağış miktarı, kıta yer)11. Bu arkeolojik, paleoecological ve paleontolojik araştırmada, diyet ve çevresel yeniden inşası için popüler bir yöntem sağlamıştır.
Diş minesini oluşumu süre (yıl) nispeten kısa olduğunu ve örnek diş bağlı olarak farklılık gösterir. İnsanlar için ilk molar emaye Doğum ve 3 yaşları arasında mineralizes, premolars 1,5 ile 7 yaş arasında mineralize, ikinci büyük azı dişleri 2.5 ile 8 yaş arasında mineralize ve 7-16 yaş12 arasında ergenlik sırasında üçüncü büyük azı dişleri mineralize . O diş minesini formları artımlı olarak oluşumu, süre içinde göz önüne alındığında, bu tüm büyüme eksen boyunca toplu olarak örnek veya ardışık olarak diyet ve çevre13 oluşumu döneminde meydana gelen değişiklikleri öğrenmek için örnek . Kronolojik olarak sıralanan diyet değişikliği içinde belirli bir diş observable arası yıllık mevsimlik ve diyet varyasyon ile ilgili bilgi sağlayan diğer hayvanlar1,14ve insanlar için olduğunu.
Emaye diagenesis için genellikle dayanıklı olmakla birlikte, mezar ortamından kaynaklanan izotopik modifikasyonlar mümkündür ve15,16deneysel kontrol ve tedavi öncesi seçimler faydalı hale, gözlemledim. Yalnızca kullanılabilir yöntemi değildir, ancak Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopi (FTIR), özellikle modunda zayıflatılmış iletim, hızlı, ucuz ve diş minesini taphonomic değişiklik değerlendirmek için nispeten erişilebilir yöntemi olarak ortaya çıkmıştır, Özellikle paleontolojik bağlamlarda17,18,19,20. Ancak, ayrıntılı iletişim kuralları ve kayıt standartlar nispeten ulaşılmaz-e doğru Jeokimya veya malzeme bilim alanları dışında birçok kişi kalır.
Tepki süreleri ve araştırmacılar tarafından diş minesini Önarıtma içinde istihdam kimyasallar da önemli ölçüde bu değişkenliği kararlı karbon ve oksijen izotop değerleri örnek21 için ne olarak genellikle sınırlı dikkate alınarak literatürde değişebilir ,22. Burada, emaye toz örnekleri Önarıtma için bir yaklaşım kullanır asetik asit (0,1 M) seyreltik raporu. Ancak, izotopik ölçümleri Önarıtma kaynaklanan farklılıkları diş minesini için görece küçük olduğunu göz önüne alındığında,11kullanıcıların verilerini karşılaştırmak istedikleri veri kümeleri için protokolleri takip araştırmacılar için en iyisidir. Nerede küçük sıralı örnekleri alınır, özellikle Holosen örnekleri üzerinde Ayrıca, hiçbir ön (pilot diagenetic testleri) örnek israfını önlemek için seçilebilir.
Biz burada rapor yöntemleri suretiyle bilgimizi yeni olmakla birlikte, bu ayrıntılı yazılı ve görsel belgeleri toplu ve ardışık örnekleme, tedavi öncesi seçimler ve diagenetic onay Yöntemleri (FTIR formu) diş emay ilk. yaygın olarak kullanılan bir çeşitli Akademik dinleyiciye yapılmıştır. Umarız çabalarımızı-ecek yapmak bu yaklaşım bireylerin ve laboratuvarlar daha geniş bir dizi için daha kolay erişilebilir iken, uygulamak ve bu teknik yayımlamak isteyen araştırmacılar raporlama standartları, diagenetic dikkat edilmesi gereken noktalar, en az farkında olmalı ve sunu gereksinimleri başka bir yerde20, aynı zamanda onların çalışma bölge takson analiz, benzersiz olması ve dönem5zaman potansiyel yorumsal karmaşıklığı uyarlanan.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dremel Micro</td>
			<td>Dremel</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&#38;region=DE&#38;gclid=EAIaIQobChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula:&#160;CH3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula:&#160;CH3CO2H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel rig set-up (workstation)</td>
			<td>Dremel</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Sprout</td>
			<td></td>
			<td>http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze drier</td>
			<td>Zirbus Technology</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zirbus.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling and pretreatment of tooth enamel carbonate for stable carbon and oxygen isotope analysis

İnsan ve hayvan diş minesini karbonat stabil karbon ve oksijen izotop analizi paleodietary, paleoecological ve paleoenvironmental araştırma son tarihsel dönemlere ait geri 10 milyon yıldan fazla için uygulanmıştır. Bir diş içinde sıralı örnekleri bu dönemde beslenme ve çevre değişiklikleri izleyebilirsiniz iken toplu yaklaşımlar emaye Qafqaz, süre için temsil edici bir örnek sağlar. Bu metodolojileri edilmiş yaygın olarak uygulanan ve Arkeoloji, ekoloji ve paleontoloji bölümünde açıklandığı iken, gerekli laboratuar ekipmanları seçiminde yardımcı olmak için ve iyice ayrıntılı laboratuvar örnekleme açıklamak için hiçbir açık kurallar olmuştur ve iletişim kuralları. Bu makalede, biz onlara ve görsel olarak, işlemin tamamı örnekleme yöntemi araştırmacılar çeşitli laboratuvar ayarları kendi uygulamasında dikkate alınarak daha yaygın olarak kullanılabilir yapmak için tedavi öncesi ve diagenetic tarama yoluyla gelen belge.

Yukarıda sunulan örnekleme işlemi uygulayarak, artımlı emaye bioapatite örnekleri hazırlanmıştır. Mine bioapatite analizi, ister toplu veya artımlı örnekleme doğruluğunu bağlıdır. Bu durumda, farklı iklim bölgeleri arkeolojik örnekleri (iki koyun) sonuçlarını seçtiniz. Artımlı örnekleri koyun ikinci büyük azı dişleri analiz ve ERJ (Şekil 4) başlayan etiketli. Artımlı örnek mekanlar numaralandırılmış ve her konum uzakl?...

Watch this Scientific Journal Video about Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis at JoVE.com

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Örnekleme ve diş minesini Önarıtma kararlı karbon ve oksijen izotop analizi için karbonat

İnsan ve hayvan diş minesini karbonat stabil karbon ve oksijen izotop analizi bireysel diyet ve çevresel yeniden inşa için bir proxy olarak kullanılmıştır. Burada ayrıntılı bir açıklama sağlamak ve görsel belgeleri toplu ve sıralı diş mine örnekleme yanı sıra Önarıtma arkeolojik ve paleontolojik örnekleri.

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

sampling-pretreatment-tooth-enamel-carbonate-for-stable-carbon-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K Görüntüleme.  Max Planck Institute for the Science of Human History. İnsan ve hayvan diş minesini karbonat stabil karbon ve oksijen izotop analizi bireysel diyet ve çevresel yeniden inşa için bir proxy olarak kullanılmıştır. Burada ayrıntılı bir açıklama sağlamak ve görsel belgeleri toplu ve sıralı diş mine örnekleme yanı sıra Önarıtma arkeolojik ve paleontolojik örnekleri.

Video: Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Kararlı İzotop izlemeyi kullanma Kompleks Hücre Toplulukları Sıralama alt popülasyonlar Metabolizma Ölçme Bir Yöntem

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Biyokimya

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular choroid layer. Different regions of the retina are anatomically and molecularly distinct, facilitating unique functions and demonstrating differential susceptibility to disease. Proteomic analysis of each of these regions and layers can provide vital insights into the molecular process of many diseases, including Age-Related Macular Degeneration (AMD), diabetes mellitus, and glaucoma. However, separation of retinal regions and layers is essential before quantitative proteomic analysis can be accomplished. Here, we describe a method for dissection and collection of the foveal, macular, and peripheral retinal regions and underlying RPE-choroid complex, involving regional punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye.One-dimensional SDS-PAGE as well as downstream proteomic analysis, such as liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), can be used to identify proteins in each dissected retinal layer, revealing molecular biomarkers for retinal disease.

The human retina is composed of functionally and molecularly distinct regions, including the fovea, macula, and peripheral retina. Here, we describe a method using punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye to dissect and collect these distinct retinal regions for downstream proteomic analysis.

İnsan Retina ve RPE koroid diseksiyon proteomik analizi için

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). SM is a common sphingolipid composed of a phosphorylcholine and a ceramide as the hydrophilic and hydrophobic component, respectively. A number of SM species are present in mammalian cells due to a variety in the sphingoid long chain base (LCB) and an N-acyl moiety in the ceramide. In this report, we show a method of estimating the number of carbon and double bonds in a LCB and an N-acyl moiety based on their corresponding product ions in MS/MS/MS (MS3) experiments. In addition, we present a quantitative analysis method for SM using two stable isotopically labeled SM species, which facilitates determining the range used in SM quantitation. The present method will be useful in characterizing a variety of SM species in biological samples and industrial products such as cosmetics.

Here, we present a protocol to quantify and qualify each sphingomyelin species using multiple reaction monitoring and MS/MS/MS mode, respectively.

Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

Canlı hücreler yapay iskele olmayan istikrarlı 3D hücresel derleme oluşturmak için değiştirme

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...