Okyanus deniz lampreys sağlamak için Kanada ve ABD Jeolojik Araştırma Hammond Bay biyolojik İstasyonu onların araştırma tesislerinin kullanımı ve personel ABD balık ve vahşi yaşam servisi ve balıkçılık için teşekkür ederiz. Bu araştırma Weiming Li ve Ke Li büyük göl balıkçılık Komisyonu hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 ve 02/17-031-00) tarafından onaylanmış olması.
1. toplama ve çıkarma deniz taşemen su şartına
<ol><li>Yer cinsel olgun erkek deniz lampreys (15-30 hayvanlar) 250 L 16-18 ° C'de tutulan gazlı göl Huron su ile birlikte bir su tankında</li>
	<li>Her gece boyunca erkek şartına su Haziran ile Temmuz için toplamak. Not: deniz lampreys doğal yumurtlama sonra ölür. Bir balık onun hayatında bu noktaya yaklaşıyor olan taze ve olgun bir erkek yerine.</li>
	<li>Katı faz çıkarma tarafından şartına su ayıklayın.<ol>
<li>Reçine metanol 4 h için bir sütuna yüklemeden önce ıslatın. Reçine sütuna yük, o zaman 10 L su sütunu boyunca organik çözücü ortadan kaldırmak için pompa.</li>
		<li>Klimalı su tankı balık üzerinden pompalama sistemi için sütunun üstünde tutan geçmek. Bir yatak dört bir dizide bulunan Orta kutup polimerik iyon değiştirme reçine (e.g., Amberlite XAD-7 HP reçine), 2 kg su geçer 2.5 L kapasiteli cam sütunlar. Yükleme hızı 400 ve 600 mL/6 dk. metabolitleri 10 litre metanol ile hemen aseton 5 L tarafından takip Elute arasında korumak. Dikkat: Bu adımı metanol ve aseton kullanır. İkisi de yanıcı ve zehirli. Not: Havuza alınan kalan-80 ° daha fazla işlenen kadar C saklanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sütun (yaklaşık 10 L) su ile yıkayarak zenginleştirme 1 hafta sonra yeniden etkinleştirin.</li>
	<li>Organik çözücü (metanol ve su karışımı) kaldırmak ve düşük basınç (altında 300 mbar) 40 ° C'de altında 5 h için çevirme buharlaşma tarafından özü hasat Su kalıntı dondurma kuru kadar 48 h-20 ° C'de lyophilization kurutma makinesi tarafından konsantre ol.</li>
</ol>2. izolasyon-in kesir havuzları kromatografi ile
<ol><li>Silika jel (230-400 mesh) ilk mobil faz 30 dk. Transfer için jel bir cam sütun için çözücü (süspansiyon) ile ıslatın. Mobil faz üzerinden gitmek izin vermek için sütun vanayı aç. Silika jel çökelti ve silika jel yatak oluşturmak olanak sağlar.</li>
	<li>Özler silika jel (70-230 mesh) ile iyice karıştırın ve silika jel yatağa sıvı kromatografi sütuna yükleyin. Onları bir gradyan % 95 CHCl3 (kloroform) ile elute / MeOH (metanol) % 100 MeOH, toplam hacim içinde 2.5 L. Bireysel şişeleri (her 10 ml) eluent toplamak. Dikkat: Bu adımda kullanılan kloroform zehirli bir reaktif olduğunu.</li>
	<li>Eluents 20 kesirler göre ince tabaka Kromatografi (TLC) analiz havuzu kılavuz.<ol>
<li>TLC deney öncesi kaplı silika jel tabaklarda örnek başlangıç çizgisine uygulanması ve gelişmekte olan çözücüler (polarizasyonu CHCl3 oranında metanol için % 100-0 Seç) kapalı bir cam plaka başlangıç çizgisine çeker yerine getirilir Tank.</li>
		<li>Çözücü 0,3 arasında değişen her TLC noktalar saklama faktörü (Rf) yapmak için geliştirme oranı seçin - 0.8.</li>
		<li>Satır sonu gelişmekte olan çözücü ulaştıktan sonra plaka havuzdan al ve solvent buharlaşır için 10 dk bekle.</li>
		<li>Belgili tanımlık yer ilk UV 254 nm ve sonra leke ışığı altında görselleştirmek onları % 5 anisaldehyde (20 μL) bir kromatografi püskürtme tarafından bir asidik metanol çözümü ile püskürtme ve onları 3 dk 85 ° C'de Isıtma onları. Not: TLC plaka üzerinde renkli noktalar kesir ana bileşeni belirtir.</li>
		<li>Eluent 20 kesirler spot renk ve ana bileşeni Rf benzerlik göre için birleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yaklaşık 30 dakika için 40 ° C'de düşük basınç (çözücüler mülkiyeti göre 300 mbar) altında çevirme buharlaşma tarafından kesir bir kalıntı için konsantre.</li>
</ol>3. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları kokulu kesirler/bileşenleri tanımlamak için
<ol><li>Borosilikat cam kılcal çekin (dış çap: 1.5 mm; iç çap: 0,86 mm; uzunluğu: 100 mm) bir micropipette ile çektirme ısıtıcı düzeyi ayarlamak için 65.</li>
	<li>Puan edinildi ve cut bir cam elmas uçlu kesici ile kılcal ucundaki açma ve erimiş %0,4 agar % 0,9 serum fizyolojik ile doldurun. Kılcal ucu açılışında çapı yaklaşık 10 µm olmalıdır.</li>
	<li>Adımları 3.1-3.2 ve katı hal elektrotlar sahipleri çekti kapiller elektrotlar ön fabrikasyon 3 M KCl bir micropipette kullanarak ile Ag/AgCl granül (bkz: Malzemeler tablo) ile dolgu. Not: herhangi bir hava kabarcıkları kılcal veya Elektrot tutucu çıkarmak.</li>
	<li>Çekti elektrot elektrot sahipleri yerleştirin.</li>
	<li>10-5 M 100 mL hazırlamak L-arginin kömür filtre su 10-2 M L-arginin hisse senedi çözeltilerine volumetric flask deiyonize su (4 ° C'de depolanan) üzerinden. 10-5 M 20 mL transfer L-arginin bir cam şişe için.</li>
	<li>Konsantrasyon-yanıt eğrisi için kesir havuzlarının adım 2.3 cam şişe içinde 10 kat dilutions 10 mL hazırlayın. Her gün önce deneyler taze dilutions hazırlamak ve onları bir gün içinde kullanın. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve kesir havuzu dilutions cam şişe koymak</li>
	<li>3-aminobenzoic asit etil ester (MS222; 100 mg/L) ile taşemen anestezi ve gallamine triethiodide (3 mg/kg vücut ağırlığı, % 0,9 serum) bir kas içi enjeksiyon ile steril bir şırınga hareketsiz. Not: Anestezi yeterli derinliğe no gill hareket, dik bir duruş korumak için bir yetersizlik ve hiçbir emme sözlü onun yuvarlak yüzey istimal belgili tanımlık tank kenarlarına gözlemci tarafından belirlenir. Herhangi bir mikrobiyal kirlenme öncesi ve ameliyat sırasında en aza indirmek için steril eldiven giymek ve % 70 etanol (v: v) diseksiyon araçlarında en az 10 dk kullanmadan önce deiyonize su ıslatın.</li>
	<li>V şeklindeki standı imzalat taşemen yönlendirmek ve kurutulma önlemek için ıslak kağıt havluyla sarın. Not: solungaç açıklıklar engel değil.</li>
	<li>Gazlı su 50 mg/L MS222 bukkal kavite içine içeren recirculating bir tüp takın, akış hızı ayarlamak ve gill açıklıklar sürekli solungaçları sulamak için su yolu ile çıkarken sağlamak.</li>
	<li>Steril neşter ve forseps kullanın [1,25 X büyütme, stereoskopik mikroskop altında ( Tablo malzemelerigörmek)] koku epitel ortaya çıkarmak için koku kapsül yüzeyi cilt 5 mm2 bölümünü kaldırmak için.</li>
	<li>Propil teslim boru filtrelenmiş su ile yıkayın ve bir micromanipulator üzerinde sıva üstü Vana bağlayın. Propil teslim kılcal tüp filtrelenmiş su kuruma odorants yönetirken değil önlemek için koku epitel sunmak için micromanipulator kullanarak koku epitel kavite içine koyun.</li>
	<li>Kayıt ve başvuru elektrotlar micromanipulators üzerinde bağlayın. Referans elektrot naris yakınındaki dış deri üzerine indir. Stereoskopik mikroskop (1,25 X), daha düşük koku epitel yüzeyi çok az dokunmak kayıt elektrot kullanarak.</li>
	<li>Propil teslim tüp alımını filtre arka plan su 10-5 M L-arginin çözüm için transfer.</li>
	<li>Bilgisayar, amplifikatör (DC modunda), filtre ve çizim tablası açınız. Vana sürücü yazılımını kullanarak program propil 4 bir s tek darbe T 4 olarak ayarlamak T1, kutusunu işaretleyerek yönetmek için bu yordamı s ve T2 kutunun işaretlenmesi.</li>
	<li>Veri toplama yazılımı (bakınız Tablo malzemeler), ayarla toplama modu için yüksek hızlı bir osiloskop, oyun simgesini tıklatın ve propil darbe tetiklemek için Vana sürücü Başlat ' ı tıklatın. Not: Veri toplama yazılımı otomatik olarak fark EOG yanıt genlik 20 kaydeder s (3 önce 4 s s propil darbe ve 13 sırasında daha sonra s). Kayıt elektrot, referans elektrot veya L-arginin standart en fazla yanıt ve bir çok az yanıt-e doğru boş denetim (sinyal-gürültü oranı artırmak için propil teslim tüp konumlarını manevra için micromanipulator kullanın filtrelenmiş su). Zemin elektrotlar hareket ederken AC-DC amplifikatör anahtar GND için değiştirme'yi amplifikatör.</li>
	<li>Boş kontrolü, L-arginin ve sonra adım 3.6'düşük 2 dk floş süzülmüş su ile yüksek konsantrasyonları uygulamalar arasında hazırlanan odorants kaydetmeye başlamak.</li>
	<li>Yanıt test edilecek tüm odorants için kayıt sonra amplifikatör zemin ve dikkatle elektrotlar ve propil teslim kılcal tüp geri çek. Onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) yöntemleri, EOG deney sona ermesi, takip ötenazi ile MS222 aşırı dozda imzalat taşemen (1 g/L). Not: başarılı ötenazi gill hareketi ve kalp atışı en az 5 min beyin pithing tarafından takip için eksikliği işaret ederek doğrulayın.</li>
	<li>Analiz ve analiz yazılımı kullanarak verileri çizmek. Yanıt-e doğru boş su kontrolü büyük temin kokulu kesirler tanımlamak için odorants22 algılama eşiği belirlemek. Boş su kontrolü farklı konsantrasyon bağımlı koku yanıt temin kesir havuzları sonra bir davranış tahlil (adım 4) test edilir.</li>
</ol>4. iki seçim labirent davranışsal aktif kesirler/bileşikler tanımlamak için davranış Bioassay
<ol><li>Cinsel Olgun kadın deniz taşemen labirent yayın kafeste alışmana ( ek Şekil 1bakınız) için 5 dk. labirent içinde nehir su akış hızı korumak Not: Labirent vernikli deniz sınıf ahşap ve önlemler 6.5 m uzunluğunda ve 1, 2 m genişliğinde bir bölücü 2.7 m uzunluğunda ters yönde sonunda iki kanal içine labirent ayırmak için ölçme ile inşa edilmiştir. Su içine labirent geçici olarak yönlendirilir. Su derinliği 0,19 m., saklanması gereken ve hız 0,07 m/s ± 0,01 muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Deniz taşemen yayın ve taşemen deneysel geçirdiği zaman ve denetim kanalı içeren her nehir su 10 dakikadır kümülatif miktarı kaydetmek. Not: deniz taşemen deneysel girin ve en az 10 için kanal denetlemek başarısız olursa bu 10 dk dönemde s son deneme bu hareketsizlik ya da güçlü yan önyargı bir göstergesi olarak.</li>
	<li>Test uyarıcı uygulamak (yani, 10-12 M, sözde bir feromon % 50 metanol/deiyonize su içinde çözünmüş) rasgele atanan deneysel kanal ve kanal denetimi kullanarak araç (% 50 metanol/deiyonize su) peristaltik 5 min için pompalar 200 mL/dk sabit bir fiyatla. Not: Electro-olfactogram kayıtları ile belirlenen test uyaran algılama eşik konsantrasyonu davranış testi için başlangıç konsantrasyonu kullanılmalıdır.</li>
	<li>Test uyarıcı ve aracın ek bir 10 min için geçerlidir ve taşemen geçirdiği zaman toplam miktarını Deneysel kayıt ve denetim kanalı.</li>
	<li>Labirent sonraki duruşma başlamadan önce 10 min için su ile yıkayın. Yeterli test uyarıcı kullanılabilir 4.1-4.4 en az 7 lampreys ile yineleyin.</li>
	<li>Bir dizin tercih22 her deneme için hesaplamak ve Wilcoxon imzaladı-rank testi kullanma önemini değerlendirmek. Not: Dizin sonuçlarda olumlu veya olumsuz olabilir tek bir numara. Oysa cazibe, değeri tercih Dizin gösterir tercih göstergeler itme dizinin negatif bir değer. Tercih dizin sıfırdan önemli ölçüde farklıysa, kesir etkin olarak kabul edilir. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58059/58059eq1v2.jpg"> Burada, Bc = propil uygulamadan denetim kanalı test taşemen tarafından harcanan zaman Be = propil uygulamadan deneysel kanaldaki harcanan zaman C = propil uygulamadan sonra denetim kanalı harcanan zaman ve E = propil uygulamadan sonra deneysel kanalda harcanan zaman.</li>
</ol>5. kromatografik yalıtım etkin kesirler gelen saf bileşiklerin
<ol><li>Tekrarlamak merdiven 2.1-2.4 koku yanıt (adım 3) neden kesir havuzlu ve davranışsal yanıt (adım 4) temin.</li>
	<li>Daha fazla etkin kesirler Sephadex LH-20 sütun kullanarak boyut-dışlama kromatografi ile bileşikler arındırmak.<ol>
<li>0.5 mL örnek ilk mobil aşamasında hazırlamak [CHCl3- MeOH (1:1) veya MeOH % 100], bir CHCl3- MeOH (1:1) sütun ve sonra bir MeOH (% 100) sütun karşılık gelen sütuna yüklemek ve onları bileşikleri vermeye elute.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. yapı aydınlatma kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ile saf bir bileşik
<ol><li>Dağıtılması ve saf bileşik ilk mobil aşamasında yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yaklaşık 1 μg/ml 10 μL çözüm oluşturmak için (genellikle, metanol su, 1:1, v: v) oranında seyreltin.<ol>
<li>Örnek çözüm HPLC şişeleri için aktarmak ve HPLC Otomatik Örnekleyici koymak onları. Örnek (10 μL) electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESIMS) enjekte ve yüksek çözünürlüklü electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (HRESIMS) spectra kromatografi kütle spektrometre23kullanarak kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Moleküler formülü kütle spektrometre yazılım veritabanında göre tahmin (bakınız Tablo reçetesi)24.<ol>
<li>Eklenen örnek kromatografik açın ve kromatografik tepe seçerek onun kitle spektrum elde etme.</li>
		<li>Aracı modülü Elemental bileşiminde iyon (m/z) değeri (4 ondalık) ölçülen ayine girdi. PPM tolerance parametre ayarla < 5.</li>
		<li>Öğe oluşumu ölçülen molekülünün sığdırmak için sembol parametrelerini ayarlamak. Yazılım moleküler formülü tek kitle analizi dayalı bir tahmin oluşturur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deuterated çözücüler (600 μL, CH3OH -d4 veya DMSO -d6) örnekleri çözülmeye Protokolü25 göre seçin.<ol>
<li>Yaklaşık 0,1 10 mg/mL aralığında değişen bir konsantrasyon ile bir çözüm oluşturmak için seçili deuterated çözücüler örnek tamamen erimesi. Örnek çözüm 1 D (1H, 13C) kaydetmek için bir NMR tüp içine aktarmak ve 2D NMR [1H -1H korelasyon spektroskopisi (rahat), heteronuclear tek kuantum tutarlılık (HSQC), heteronuclear çoklu bağ korelasyon (HMBC)] Spectra 900 MHz NMR spektrometresi26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMR tüp spinner türbin içinde örnek ile yerleştirin. Derinlik mastarı örnek yükseklik ölçme penceresinin ortasında olduğundan emin olmak için kullanın. NMR yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve mıknatıs örnek değiştirmek için Kaldır düğmesini tıklatın. Not: magnet mıknatıs tepesinden gelen gaz hissetmek tepesinden bir elini tut. Aynı zamanda, bir ıslık sesi duyulabilir olmalıdır.</li>
	<li>Yavaşça örnek hava yastığı mıknatıs üstüne yerleştirin ve NMR mıknatısına örnek tekrar inmeye Kaldır düğmesine basın. Not: örnek doğru pozisyonda olduğunu belirtmek bir "tıklama" gürültü dinler.</li>
	<li>Yeni bir veri kümesi oluşturun ve NMR enstrüman tarafından önerilen varsayılan parametreler yük ( Tablo malzemelerigörmek).<ol>
<li>Otomatik kilitleme yordamı çağırmak ve solvent istemi sayfasindan seçmek için "kilit" yazın.</li>
		<li>İnce ayar için Unlock modelindeki düğmesini Değiştir masası' nda, ayarlamak, imleci işlemek panelindeki ayarlama ve mıknatıs kilit daha.</li>
		<li>İstemi Atma sayfa üzerinde bir kaç dakika sürebilir ayarlama yordamı işlemek paneline parametresinde ayarlayın. Devam etmek için ayarlama tamamlanana kadar bekleyin.</li>
		<li>Otomatik shimming rutin-e sevketmek içinde "topshim" yazarak başlatın. Titremeden devam tamamlanana kadar bekleyin.</li>
		<li>Türü "rga otomatik ayarlamak için" kazanç ayarlar, daha sonra "türü d1 Bakliyat, sonra"türü zg satın başlatmak ve satın alma bitene kadar bekleyin"arasındaki gecikme ayarlamak için" alınıyor.</li>
		<li>"Ef" veya "verileri işlemek ve sonra yazın"apk otomatik phasing için"e.f.P'yi" yazın. NMR işleme yazılımı verilerin işlenmesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kimyasal yapısı NMR veri analizi bir yorumu tarafından aydınlatmak.</li>
	<li>13C NMR spektrumu karbon sinyalleri saymak. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HR-MS) öngörülen sonucu eşleşen moleküler formülü seçin.</li>
	<li>1H NMR spektrumu proton sinyalleri entegre ve belgili tanımlık connectivity, karbon ve proton-tabanlı HSQC spektrumda sinyalleri üzerinde atayın.</li>
	<li>Korelasyon 1H -1H rahat ve HMBC spektrum dayalı karbon iskeleti bağlantı atayın.</li>
	<li>Kesin olmayan biçimde kimyasal yapısı yapısı mantığı27tarihinde temel atayın. Geçici yapısı kimyasal yapısı veritabanlarında arama. Geçici yapısı başvurular analogları ile karşılaştırın.</li>
	<li>Nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) spektrum göreli yapılandırmayla atayın. Not: spektrometresi ve spektroskopik yöntemler üzerinde görüntülenen enantiomers kimlik özelliklerini aynı olduğundan, bazı bileşiklerin, özellikle de 2'-alkol ve 2'-NH2, mutlak yapılandırma ile belirlenecek sahip bir derivatization reaksiyon. Derivatization reaksiyon sonra spectra üzerinde belirtilen farklılıklar çoğu bileşikler28mutlak konfigürasyonlar kesin atama kolaylaştırmak.</li>
</ol>7. EOG ve Bioassay saf bileşikler onaylamak için kokulu ve davranışsal aktif
<ol><li>3.1-3.5 adımları yineleyin.</li>
	<li>10-6 M - 10-13 M 10-3 M feromon hisse senedi çözüm % 50 metanol/su içinde belirlenen moleküler ağırlık temel-20 ° C'de depolanan gelen saf bileşiklerin 10 kat dilutions 10 mL konsantrasyonu-yanıt eğrisi için hazırlamak Adım 6.2. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve saf bileşikler ile cam şişe koymak</li>
	<li>3.7-3.18 adımları yineleyin.</li>
	<li>4.1-4.2 adımları yineleyin.</li>
	<li>EOG algılama eşik konsantrasyon saf kampta rasgele atanan deneysel kanal ve 5 min için 200 mL/dk Sabit fiyatla peristaltik pompa kullanarak Denetim kanalında ve aracın (% 50 metanol/deiyonize su) uygulanır.</li>
	<li>4.4-4,6 adımları yineleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+chemical+ecology:+Olfactory+proteins+from+the+giant+panda+and+their+interactions+with+putative+pheromones+and+bamboo+volatiles.">Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).</li><li>Leal, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+chemical+ecology+at+the+service+of+conservation+biology.">Reverse chemical ecology at the service of conservation biology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).</li><li>Carde, R. T., Minks, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+moth+pests+by+mating+disruption:+successes+and+constraints.">Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints.</a> Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).</li><li>Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+pheromones+and+their+impact+on+pest+management.">Sex pheromones and their impact on pest management.</a> Journal of chemical ecology. 36, (2010).</li><li>Cheng, Y. -. n., Wen, P., Dong, S. -. h., Tan, K., Nieh, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poison+and+alarm:+the+Asian+hornet+Vespa+velutina+uses+sting+venom+volatiles+as+an+alarm+pheromone.">Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).</li><li>Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , (2013).</li><li>Pizzolon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+fathers+make+the+difference:+efficacy+of+male+sexually+selected+antimicrobial+glands+in+enhancing+fish+hatching+success.">When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success.</a> Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).</li><li>Stacey, N., Sorensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , (2011).</li><li>Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+and+pheromonal+control+of+spawning+behavior+in+the+goldfish.">Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish.</a> Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).</li><li>Stacey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonally-derived+pheromones+in+teleost+fishes.">Hormonally-derived pheromones in teleost fishes.</a> Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).</li><li>Kuhlisch, C., Pohnert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+in+chemical+ecology.">Metabolomics in chemical ecology.</a> Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).</li><li>Prince, E. K., Pohnert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+signals+in+the+noise:+metabolomics+in+chemical+ecology.">Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).</li><li>Teeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+communication+in+sea+lampreys+(Petromyzon+marinus):+implications+for+population+management.">Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).</li><li>Moore, H., Schleen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+spawning+runs+of+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+selected+streams+of+Lake+Superior+after+chemical+control.">Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).</li><li>Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory-mediated+stream-finding+behavior+of+migratory+adult+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus).">Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus).</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).</li><li>Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+field+test+verifies+that+pheromones+can+be+useful+for+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+control+in+the+Great+Lakes.">A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).</li><li>Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conspecific+cueing+in+the+sea+lamprey:+do+reproductive+migrations+consistently+follow+the+most+intense+larval+odour?.">Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour?.</a> Animal Behaviour. 78, (2009).</li><li>Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+3-keto+petromyzonol+sulphate+specifically+attracts+ovulating+female+sea+lamprey+Petromyzon+marinus.">Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus.</a> Animal Behaviour. 70, (2005).</li><li>Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+lamprey+control:+past,+present,+and+future.">Sea lamprey control: past, present, and future.</a> Great Lakes Fisheries Policy and Management. , 651-704 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Novel+Bile+Alcohols+of+Mature+Male+Sea+Lamprey+(Petromyzon+marinus)+Act+as+Chemical+Cues+for+Conspecifics.">Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics.</a> Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).</li><li>Hird, S. J., Lau, B. P. -. Y., Schuhmacher, R., Krska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography-mass+spectrometry+for+the+determination+of+chemical+contaminants+in+food.">Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food.</a> TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).</li><li>Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+&amp;#34;known+unknowns&amp;#34;+utilizing+accurate+mass+data+and+ChemSpider.">Identification of &amp;#34;known unknowns&amp;#34; utilizing accurate mass data and ChemSpider.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).</li><li>Beckonert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+profiling,+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine,+plasma,+serum+and+tissue+extracts.">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).</li><li>Kaiser, B., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , (2008).</li><li>Breitmaier, E., Sinnema, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , (1993).</li><li>Seco, J. M., Quino&#225;, E., Riguera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assignment+of+absolute+configuration+by+NMR.">The assignment of absolute configuration by NMR.</a> Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Salt-like+Dienones+Having+a+Novel+Skeleton+or+a+Rare+Substitution+Pattern+Function+as+Chemical+Cues+in+Adult+Sea+Lamprey.">Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey.</a> Organic Letters. , (2017).</li><li>Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+natural+products+that+act+as+pheromones+in+fish.">Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish.</a> Natural Product Reports. , (2018).</li><li>Yambe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Kynurenine,+an+amino+acid+identified+as+a+sex+pheromone+in+the+urine+of+ovulated+female+masu+salmon.">L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).</li><li>Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+identification,+concentration+and+bioactivity+of+(Z)-7-dodecen-1-yl+acetate:+sex+pheromone+of+the+female+Asian+elephant,+Elephas+maximus.">Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus.</a> Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).</li><li>Sorensen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+of+new+sulfated+steroids+functions+as+a+migratory+pheromone+in+the+sea+lamprey.">Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey.</a> Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).</li><li>Hoye, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+the+structure+determination+of+the+sulfated+steroids+PSDS+and+PADS:+New+components+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+migratory+pheromone.">Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone.</a> The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).</li><li>Fine, J. M., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+activity+of+the+multi-component+sea+lamprey+migratory+pheromone.">Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone.</a> Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).</li><li>De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+receiver+bias+underlying+female+preference+for+a+male+mating+pheromone+in+sea+lamprey.">Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).</li><li>De Bruyne, M., Baker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+detection+in+insects:+volatile+codes.">Odor detection in insects: volatile codes.</a> Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).</li><li>Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+orientation+and+releaser+components+in+a+sex+pheromone.">Separate orientation and releaser components in a sex pheromone.</a> Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).</li><li>Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+components+and+active+spaces:+what+do+moths+smell+and+where+do+they+smell+it.">Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it.</a> Science. 237 (4815), 650-652 (1987).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Balık bileşiklerin henüz tespit için tam bir kimyasal dünyada yaşıyoruz. Bioassay-güdümlü ayırma belirlemek ve bu masu somon31, Asya filler32ve deniz lampreys33gözlenen gibi birçok kimyasal etkileşimlerin arabuluculuk biyoaktif molekülleri karakterize temel kanıtlamıştır, 34,35. Bioassay-güdümlü ayırma doğru bir şekilde izleme ve belirlemekte başlangıç ...

Feromonlar gıda kaynakları bulma, yırtıcı algılama ve conspecifics1sosyal etkileşimlerin arabuluculuk yardım bireyler tarafından yayımlanan belirli kimyasal sinyaller. Feromon iletişim böceklerde de okudu2olmuştur; Ancak, kimyasal kimlik ve suda yaşayan omurgalı Feromonlar biyolojik fonksiyonu olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir değil. Kimlik bilgisine ve serbest Feromonlar fonksiyonu tehdit türlerin3,4 veya kontrol haşere türü5,6kurtarma kolaylaştırmak için uygulanır. Bu tekniklerin uygulama yalıtım ve karakterizasyonu biyoaktif feromon bileşenleri gerektirir.
Feromon kimlik doğal ürün Kimya bir dalıdır. Feromon araştırma sürüyor kısmen feromon moleküller kendilerini yapısı nedeniyle sınırlı olmuştur. Feromonlar çoğu kez kararsız ve küçük miktarlarda yılında yayımlanan ve uçucu7,8 , suda çözünen bileşikler9dakika miktarda algılamak için sadece birkaç örnekleme teknikleri adlı biri yok. Feromonlar tanımlamak için bir yaklaşım bilinen bileşikler, 2) metabolomics ve 3) bioassay-güdümlü ayırma hedeflenen 1) bir tarama içerir. A hedeflenen perde bilinen bileşikler ticari olarak mevcut metabolik yan ürünleri Feromonlar çalışması için olan fizyolojik süreçlerin sınar. Araştırmacılar sadece bilinir ve kullanılabilir bileşenler test edebilirsiniz çünkü bu yaklaşım sınırlayıcı olduğunu. Ancak, Japon balığı cinsiyet hormonları başarılı tanımlaması bu işlevi Feromonlar10,11,12olarak sonuçlandı. Metabolomics biyolojik sistem13içinde potansiyel küçük molekül metabolik ürünler ayıran ikinci bir feromon kimlik bir yaklaşımdır. İki grubun (yani, bir etkin ve etkin olmayan bir özü) metabolik profilleri karşılaştırılması potansiyel bir metabolik profili kimliği sağlar hangi metaboliti saf üzerinden, yapısı aydınlatılmamıştır ve bioactivity teyit edilen14yaşında. Özel karışımlar karmaşık formülasyonları katkı maddesi ya da sinerjik etkileri metabolitleri birlikte yerine kesirler13bir dizi olarak kabul edilir çünkü metabolomics ile tespit edilebilir olasılığı daha yüksektir. Ancak, elde edilen verileri yeni yapıların aydınlatma kolaylaştırmak değil çünkü metabolomics uygulanması sentetik başvurular kullanılabilirliğine dayanır.
Bioassay-güdümlü ayırma yaklaşımdır iki alanı kapsayan bir entegre, yinelemeli: kimya ve biyoloji. Bu yaklaşım kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır. Ham bir özü bir kimyasal özelliği (yani, moleküler boyutu, polarite, vb) tarafından şeker ve elektro-olfactogram (EOG) kayýtlarý içeren ve/veya bir bioassay test edilmiştir. Biyoaktif bileşenler ayırma ve EOGs ve/veya biyoanalizler aşağıdaki adımları tekrar ederek dışarı ekranlı. Saf aktif bileşikler yapılarının moleküler ağırlık ve bahçedeki sentezlenmiş için bir şablon oluşturmak için yapısal bilgi sağlayan spektrometrik ve spektroskopik yöntemler tarafından aydınlatılmamıştır. Bioassay-güdümlü ayırma farklı metabolitleri ve potansiyel olarak Roman Feromonlar biyosentetik yolları öngörülen vermemektedirler benzersiz kimyasal iskeletler ile yol açabilir.
Burada, biz yalıtmak ve erkek deniz taşemen seks feromon bileşiklerin bioactivity karakterize için kullanılan bioassay güdümlü ayırma iletişim kuralı tanımlamak. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) Bu balıklar ağır üç ayrı aşamadan oluşan anadromous onların yaşam öyküsü arabuluculuk kimyasal cues koku algılamayı dayandığından feromon iletişim eğitim için ideal bir omurgalı modelidir: Larvalar, çocuk ve yetişkin. Deniz taşemen larvaları tatlı su akışları tortu yuva, köklü bir metamorfoz geçmesi ve bir göl veya nerede büyük konak balık parasitize okyanus geçirmek gençlere dönüştürün. Ana bilgisayar balıktan ayırma sonra yetişkin yumurtlama akarsu geri akışı yerleşik larva15,16,17,18tarafından,19 serbest göçmen Feromonlar rehberliğinde göç . Olgun erkek yumurtlamabölgelerine dönmek çıkmak, arkadaşları çekmek, yaklaşık bir hafta için zaman zaman spawn ve sonra15,20ölmek çok bileşenli seks feromon serbest. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması önemli çünkü bir modülasyon feromon iletişim sisteminin Laurentian büyük göller21invaziv deniz lampreys kontrol etmek için kabul seçenekler arasında yer alıyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Premium standard wall borosilicate capillaries with filament&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:160px;">G150F-4</td>
			<td style="width:436px;">recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller instrument&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Narishige</td>
			<td style="width:160px;">PC-10</td>
			<td>pulls electrodes for EOGs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond-tipped glass cutter</td>
			<td style="width:199px;">Generic</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>cut tip of electrodes for EOG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:160px;">1B150-4</td>
			<td>odorant delivery tube for EOG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:160px;">ESP-M15N</td>
			<td>recording electrode holder</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Reference electrode holder E Series with handle with&#160; Ag/AgCl pellet&#160; for glass capillary OD 1.5 mm</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:160px;">E45P-F15NH</td>
			<td>reference electrode holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">1 mm pin</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:160px;">WC1-10</td>
			<td>to bridge reference and recording electrode holders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">2 mm pin</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:160px;">WC2-5</td>
			<td>to bridge reference and recording electrode holders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A1296</td>
			<td>molten agar to fill electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">P9333</td>
			<td>3M KCl to fill electrodes and electrode holders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Micropipette microfil</td>
			<td style="width:199px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:160px;">MF28G-5</td>
			<td>to fill electrodes and electrode holders&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">L-Arginine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A5006</td>
			<td>positive control odorant for EOG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Methanol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Water bath</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>holds odorants for EOG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)</td>
			<td style="width:199px;">Syndel USA</td>
			<td>Tricaine1G</td>
			<td>EOG anesthetic&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gallamine triethiodide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">G8134-5G</td>
			<td>EOG paralytic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td>301025</td>
			<td>to administer paralytic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Subcutaneous needle 26G 5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:160px;">305115</td>
			<td>to administer paralytic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Roller clamp</td>
			<td style="width:199px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:160px;">14043-20</td>
			<td>adjust flow rate of anesthic into lamprey&#39;s mouth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:199px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:160px;">3624-05</td>
			<td>for preparation of 0.9% saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">V-shaped plastic stand as specimen stage</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>holds lamprey during EOG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Plastic trough</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>holds V-shaped plastic stand during EOG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Scalpel Blades - #11</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:160px;">10011-00</td>
			<td>for EOG dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Scalpel Handle - #3</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:160px;">10003-12</td>
			<td>for EOG dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Straight ultra fine forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:160px;">11252-00</td>
			<td>for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Curved ultra fine forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11370-42</td>
			<td>for EOG dissection, Moria MC40B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Straight pring Scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>for EOG dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">Discovery V8</td>
			<td>for EOG dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Illuminator light</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">CL 1500 ECO</td>
			<td>for EOG dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Plastic tubing</td>
			<td>Generic</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>to connect re-circulating EOG setup and water baths</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Odorant delivery tubing&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">In line filter and gasket set</td>
			<td style="width:199px;">Lee Company</td>
			<td style="width:160px;">TCFA1201035A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Micromanipulators</td>
			<td style="width:199px;">Narishige</td>
			<td style="width:160px;">MM-3</td>
			<td>to position electrodes and odorant delivery capillary tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic holding devices</td>
			<td style="width:199px;">Kanetec</td>
			<td style="width:160px;">MB-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Valve driver</td>
			<td style="width:199px;">Arduino</td>
			<td style="width:160px;">custom made</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electromagnetic valve</td>
			<td style="width:199px;">Lee Company</td>
			<td style="width:160px;">LFAA1201618H</td>
			<td>valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NeuroLog AC/DC amplifier</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td style="width:160px;">NL106</td>
			<td>to increase the amplitude of the elictrical signal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NeuroLog DC pre-amplifier with headstage</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>NL102G</td>
			<td>to increase the amplitude of the elictrical signal</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Low-pass 60 Hz filter</td>
			<td>Digitimer Ltd.</td>
			<td>NL125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices LLC</td>
			<td style="width:160px;">Axon Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software</td>
			<td style="width:199px;">Molecular Devices LLC</td>
			<td>AxoScope version 10.4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Faraday cage</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>Electromagnetic noise shielding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Two-choice maze</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trash pump</td>
			<td style="width:199px;">Honda</td>
			<td>WT30XK4A</td>
			<td>fills maze with water from nearby river</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Peristaltic pump with tubing</td>
			<td style="width:199px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:160px;">Masterflex 07557-00</td>
			<td>to adminster odorants in maze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Inverter Generator&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Honda</td>
			<td style="width:160px;">EU1000i</td>
			<td>powers perstaltic pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Release cage</td>
			<td style="width:199px;">Custom made</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>used to acclimate lamprey in the maze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Mesh</td>
			<td>Generic</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Buckets (5 gallon)</td>
			<td>Generic</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td>to mix odorants</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Flow meter</td>
			<td style="width:199px;">Marsh-McBirney</td>
			<td>Flo-Mate 2000</td>
			<td>to measure discharge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XAD 7 HP resin</td>
			<td style="width:199px;">Dow chemical</td>
			<td style="width:160px;">37380-43-1</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Methanol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">34860</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:199px;">Yamato</td>
			<td style="width:160px;">BM 200</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Freeze dryer</td>
			<td style="width:199px;">Labconco</td>
			<td style="width:160px;">CentriVap&#160; Concentrator</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">chloroform</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">CX1050</td>
			<td>for isolation of fraction pools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Silica gel 70-230 mesh</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">112926-00-8</td>
			<td>for isolation of fraction pools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Silica gel 230-400 mesh</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">112926-00-8</td>
			<td>for isolation of fraction pools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pre-coated silica gel TLC plates</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">99571</td>
			<td>for isolation of fraction pools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anisaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A88107</td>
			<td>for isolation of fraction pools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex LH-20</td>
			<td style="width:199px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:160px;">17-0090-01</td>
			<td>for isolation of fraction pools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amberlite XAD 7 HP resin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">XAD7HP</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4, 2.5L capacity glass columns</td>
			<td>Ace Glass Inc.</td>
			<td>5820</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">650501</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)</td>
			<td style="width:199px;">Waters Co.</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>for structure elucidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary HPLC pump</td>
			<td style="width:199px;">Waters Co.</td>
			<td style="width:160px;">1525</td>
			<td>for isolation of fraction pools/compounds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:160px;">N/A</td>
			<td>for structure elucidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rotovap drying system</td>
			<td style="width:199px;">Buchi</td>
			<td style="width:160px;">RII</td>
			<td>for extraction of conditioned water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV lamp (254 nm)</td>
			<td style="width:199px;">Spectronics Co.</td>
			<td style="width:160px;">ENF-240C</td>
			<td>for thin layer chromatography&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the identification of sea lamprey pheromones using bioassay-guided fractionation

Bioassay-güdümlü ayırma Kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır yinelemeli bir yaklaşımdır. Bu yöntem başarılı alan nitelik özellikleri kimyasal sinyallerin Feromonlar hayvan türlerinin geniş bir alanda olarak bu işlev sonuçlandı. Deniz lampreys davranış ya da fizyolojik yanıt aracılık Feromonlar tespit etmek için koku alma üzerinde güveniyor. Biz bu bilgi balık biyoloji sözde Feromonlar işlevlerini yerine koymak ve Kılavuzu yalıtım ve etkin feromon bileşenleri tanımlaması için kullanın. Kromatografi ayıklamak, konsantre ve bileşikleri şartına sudan ayırmak için kullanılır. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları hangi kesirler koku yanıt-e doğru çıkarmak belirlemek için yapılmaktadır. İki seçenekli labirent davranış deneyleri daha sonra herhangi bir kokulu kesirler de davranışsal etkindir ve neden bir tercih belirlemek için kullanılır. Spektrometrik ve spektroskopik Yöntemler moleküler ağırlık ve yapısı aydınlatma ile yardımcı olacak yapısal bilgiler sağlar. Bioactivity saf bileşiklerin EOG ve davranışsal deneyleri ile doğrulanır. Labirent içinde gözlenen davranış yanıt sonuçta kendi işlevleriyle bir doğal akışı ayarı onaylamak için bir alan ortamda doğrulanması. Bu biyoanalizler 1) ayırma işlemi yol ve 2) onaylamak için ikili bir rol oynar ve daha fazla ayrılmış bileşenleri bioactivity tanımlamak. Burada, bioassay güdümlü ayırma yaklaşım yarar reaksiyonların bir deniz taşemen feromon kimlik temsilcisi sonuçları raporu. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması invaziv deniz taşemen Laurentian göller denetlemek için kabul seçenekler arasında bir modülasyon feromon iletişim sistemi olduğu için özellikle önemlidir. Bu yöntemi özellikleri geniş bir dizi iletişim kimyasal karakterize ve su bazlı kimyasal ekoloji ışık için kolayca adapte edilebilir.

Bioassay-güdümlü Ayırma Protokolü içinde açıklanan adımları özetleyen bir diyagram Şekil 1' de gösterilen. Protokol yalıtmak ve yapısı, koku kudret ve davranış etkinliği 5 sözde deniz taşemen Feromonlar (Şekil 2) ile karakterize için adımları içerir. Kütle spektrometrik ve NMR veri (Şekil 3 ve Şekil 4) kullanarak, petromyzene A-B ve petromyzo...

Watch this Scientific Journal Video about The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation at JoVE.com

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Burada, ayırmak ve yapısını, koku kudret ve deniz lampreys, sözde feromon bileşiklerin davranışsal yanıt karakterize bir iletişim kuralı mevcut.

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

the-identification-sea-lamprey-pheromones-using-bioassay-guided

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.9K Görüntüleme.  Michigan State University. Burada, ayırmak ve yapısını, koku kudret ve deniz lampreys, sözde feromon bileşiklerin davranışsal yanıt karakterize bir iletişim kuralı mevcut.

Video: The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the double bond. Changes in FA composition play a crucial role in the adaptation of bacteria to their environment. These modifications entail a change in the ratio of iso versus anteiso branched FAs, and in the proportion of unsaturated FAs relative to saturated FAs, with double bonds created at specific positions. Precise identification of the FA profile is necessary to understand the adaptation mechanisms of Bacillus species.
Many of the FAs from Bacillus are not commercially available. The strategy proposed herein identifies FAs by combining information on the retention time (by calculation of the equivalent chain length (ECL)) with the mass spectra of three types of FA derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). This method can identify the FAs without the need to purify the unknown FAs.
Comparing chromatographic profiles of FAME prepared from Bacillus cereus with a commercial mixture of standards allows for the identification of straight-chain saturated FAs, the calculation of the ECL, and hypotheses on the identity of the other FAs. FAMEs of branched saturated FAs, iso or anteiso, display a constant negative shift in the ECL, compared to linear saturated FAs with the same number of carbons. FAMEs of unsaturated FAs can be detected by the mass of their molecular ions, and result in a positive shift in the ECL compared to the corresponding saturated FAs.
The branching position of FAs and the double bond position of unsaturated FAs can be identified by the electron ionization mass spectra of picolinyl and DMOX derivatives, respectively. This approach identifies all the unknown saturated branched FAs, unsaturated straight-chain FAs and unsaturated branched FAs from the B. cereus extract.

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

Yağ Asitlerinin Tanımlanması içinde<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Biyokimya

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. This method utilizes hypotonic buffers, digitonin, mechanical lysis and differential centrifugation to isolate the cytoplasm, mitochondria and plasma membrane. The process can be scaled to accommodate the needs of researchers, is inexpensive and straightforward. This method will allow researchers to determine protein localization in cells without specialized centrifuges and without the use of commercial kits, both of which can be prohibitively expensive. We have successfully used this method to separate cytosolic, plasma membrane and mitochondrial proteins in the human monocyte cell line U937.

Here, we present a protocol to isolate the plasma membrane, cytoplasm and mitochondria of U937 cells without the use of high-speed centrifugation. This technique can be used to purify subcellular fractions for subsequent examination of protein localization via immunoblotting.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled antibodies. It is a multistep process in which the optimization of each step is crucial to obtain the optimum specific signal. Through IHC, the distribution and localization of specific biomarkers can be detected, revealing information on evolutionary conservation. Moreover, IHC allows for the understanding of expression and distribution changes of biomarkers in pathological conditions, such as obesity. IHC, mainly the immunofluorescence technique, can be used in adult zebrafish to detect the organization and distribution of phylogenetically conserved molecules, but a standard IHC protocol is not estasblished. Orexin and endocannabinoid are two highly conserved systems involved in the control of food intake and obesity pathology. Reported here are protocols used to obtain information about orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), and cannabinoid receptor (CB1R) localization and distribution in the gut and brain of normal and diet-induced obese (DIO) adult zebrafish models. Also described are methods for immunoperoxidase and double immunofluorescence, as well as preparation of reagents, fixation, paraffin-embedding, and cryoprotection of zebrafish tissue and preparation for an endogenous activity-blocking step and background counterstaining. The complete set of parameters is obtained from previous IHC experiments, through which we have shown how immunofluorescence can help with the understanding of OXs, OX-2R, and CB1R distribution, localization, and conservation of expression in adult zebrafish tissues. The resulting images with highly specific signal intensity led to the confirmation that zebrafish are suitable animal models for immunohistochemical studies of distribution, localization, and evolutionary conservation of specific biomarkers in physiological and pathological conditions. The protocols presented here are recommended for IHC experiments in adult zebrafish.

Presented here are protocols for immunohistochemical characterization and localization of orexin peptide, orexin receptors, and endocannabinoid receptors in the gut and brains of normal and diet-induced obesity (DIO) adult zebrafish models using immunoperixidase and double immunofluorescence methods.

Immunoperoksidan ve Immünofluoresesan yöntemlerini kullanarak yetişkin Zebrafisinde Orexin ve Endocannabinoid reseptörlerinin tanımlanması

Immunohistochemistry (IHC) is a highly sensitive and specific technique involved in the detection of target antigens in tissue sections with labeled ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and isopycnic density gradient centrifugation. The major advantage of this procedure is that it does not rely on the sole use of solubilizing detergents to obtain subcellular fractions. This makes it possible to separate the plasma membrane from other membrane-bound organelles of the cell. This procedure will facilitate the determination of protein localization in cells with a reproducible, scalable, and selective method. This method has been successfully used to isolate cytosolic, nuclear, mitochondrial, and plasma membrane proteins from the human monocyte cell line, U937. Although optimized for this cell line, this procedure may serve as a suitable starting point for the subcellular fractionation of other cell lines. Potential pitfalls of the procedure and how to avoid them are discussed as are alterations that may need to be considered for other cell lines.

This fractionation protocol will allow researchers to isolate cytoplasmic, nuclear, mitochondrial, and membrane proteins from mammalian cells. The latter two subcellular fractions are further purified via isopycnic density gradient.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...