Deniz anemon toksini etkileşimi, toksinlerin çeşitliliğini ve bolluğunu elde etmek ve belirli bir toksinin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için en az sayıda organizma ve etkili protokoller kullanmalıdır. Ham ekstraktı yüksek miktarda protein ile hazırlamak ve deniz anemon zehirindeki hemoliz ve fosfolik bazları tanımlamak için tekrarlanabilir, spesifik, hızlı ve ucuz testleri tanımlamak için iki etkili tekniği birleştirdik. Yöntem, bir veya her iki sitolisin tipini tanımlamaya karar verilen hemen hemen her örnekte kullanılabilir.
Yöntemin verimliliği, ham ekstraktı hazırlarken her adımda zamanlara dikkat edilerek elde edilir. Hemolizin anahtarı, mekanik lizisten kaçınmak için eritrositin dikkatli bir şekilde kullanılması ve fosfoliz tahlilinde, plakanın hazırlanmasında sıcaklığa dikkat edilmesidir. Prosedürü gösterecek olan Dr. Santos Ramirez-Carreto, biyolog Sandra Salazar Garcia ve laboratuvarımdan biyolog Giovanni Macias Martinez olacak.
Vücuda yapışan büyük substrat parçacıklarını çıkarmak için toplanan deniz anemonunu A.doi'yi elle damıtılmış suyla temizleyerek başlayın. Organizmaları hemen eksi 80 santigrat derecede bir ultradondurucuda 72 saat boyunca dondurun. Daha sonra, organizmaları 48 saat boyunca liyofilizasyon koşullarıyla dondurarak kurutmak için özel bardaklara yerleştirin.
Doku hidrasyonu için, liyofilize organizmaların 20 gram kuru ağırlığını, 60 mililitre 50 milimolar sodyum fosfat tamponu ve bir inhibitör kokteyl tableti ile yeniden oluşturun. Manyetik bir karıştırıcıda, numuneyi 12 saat boyunca yaklaşık 800 RPM ve dört santigrat derecede sürekli karıştırın. Hücre lizisini ve nematokist deşarjını indüklemek için numuneyi eksi 20 santigrat derecede 12 saat dondurduktan sonra,% 90'a kadar çözülene kadar kabı oda sıcaklığında suya koyunBu prosedürü üç kez tekrarlayın.
Ekstraktı açıklığa kavuşturmak için, numuneyi dört santigrat derecede 40 dakika boyunca 25.400 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı kurtarın ve tekrar santrifüj yapın. Adımı üç ila dört kez tekrarlayın ve sonunda süpernatantı kurtarın.
Geri kazanılan süpernatant veya ham ekstrakt, zehir bileşenlerini ve lipitler, karbonhidratlar ve nükleik asitler gibi diğer hücre moleküllerini içerir. Ticari bir Bradford kolorimetrik tahlil kiti kullanarak ham ekstraktın protein konsantrasyonunu belirleyin. Numuneleri titremeden oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.
Ardından, absorbansı 595 nanometrede ölçün. Örnek BSA absorbanslarının ortalamalarını çizin ve y'nin absorbans, m'nin çizginin eğimi, x'in protein konsantrasyonu ve b'nin orijinin ordinatı olduğu grafiğin denklemini belirleyin. Ham ekstraktı analiz etmek için, proteinleri denatüre etmek için protein yükleme tamponunun beş mikrolitresine 30 mikrogram ham ekstrakt ekleyin.
Son hacim 50 mikrolitreden az olmalıdır. Elektroforezi bir saat 30 dakika boyunca sabit 25 miliamperde çalıştırın. Jel proteinlerinin difüzyonunu önlemek için, fiksasyon çözeltisini proteinlere ekleyin ve 80 RPM'de çalkalayarak 40 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
Daha sonra, çözeltiyi boşaltın ve protein çapraz bağlama çözeltisini ekleyin. 80 RPM'de sallayarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi çıkarın ve jeli beş dakika boyunca 100 mililitre damıtılmış suyla yıkayın.
Bundan sonra, suyu çıkarın ve bu prosedürü dört kez tekrarlayın. Oda sıcaklığında bir laboratuvar döner osilatöründe 15 dakika boyunca 60 RPM'de karıştırılarak 50 mililitre Coomassie Brilliant Blue R-250 filtrelenmiş çözelti ile protein boyama işlemi gerçekleştirin. Bir koyunun juguler damarından bir mililitre kan çıkarın ve iğneyi şırıngadan çıkarın.
Kanı derhal 50 mililitre Alsever çözeltisi içeren bir tüpe boşaltın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 804 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve tüpün iç duvarları boyunca kaydırarak 30 mililitre Alsever çözeltisi ekleyin. Bir Pasteur plastik pipet kullanarak peleti yavaşça yeniden askıya alın ve çözeltiyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 804 kez G'de tekrar santrifüj yapın.
Süpernatant netleşene kadar bu prosedürü tekrarlayın. Yaklaşık mililitre başına 2 milyon hücre konsantrasyonu elde etmek için Alsever çözeltisinin son hacmini koruyun. Ardından, hücreleri saymak için bir Neubauer odası veya hemositometre kullanın.
Çözelti karışımlarını sallamadan 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin ve ardından plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 804 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı düz tabanlı başka bir 96 delikli plakada kurtarın. Ham ekstrakt sitolisinler içeriyorsa, eritrositler hemoglobini lize eder ve serbest bırakır.
415 nanometredeki absorbansı okuyun ve eritrositlerin% 50'sinde hemoliz üreten ekstrakt miktarını hesaplayın. Deniz anemonunun ham ekstraktı miktarını artırın ve uygun yazılımı kullanarak grafiği sigmoidal ayarlamalarla tasarlayın. Bir tavuk yumurtasını% 1 SDS ile damıtılmış suda yıkayın ve yumurta sarısını steril koşullar altında yumurta akından ayırın.
A, B, C ve D çözeltilerini hazırlayın.B çözeltisine 500 mikrolitre A ve C çözeltisi ve 100 mikrolitre çözelti D.Karıştırın ve her Petri kabına 25 mililitre dökün. Çözeltinin steril koşullar altında katılaşmasını bekleyin ve ince bir tüp ile yaklaşık iki ila üç milimetre çapında kuyucuklar açın. Bir kuyucukta negatif kontrol olarak toplam 20 mikrolitre fosfat tamponu ve başka bir kuyuda pozitif kontrol olarak 20 mikrolitre belirlenmiş fosfolipaz ekleyin.
Ham ekstrakt proteini 5, 15, 25, 35 ve 45 mikrogramlarının farklı miktarlarını, her biri 20 mikrolitrelik son bir hacimde kalan kuyucuklara yerleştirin. 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Deniz anemonunun ham ekstraktını elde etmek için kullanılan protokolün temsili sonuçları, iki tekniğin, ajitasyon ve donma ve çözülme döngülerinin birleştirilmesinin nematosistlerin verimli bir şekilde boşaltılmasını sağladığını göstermiştir.
Uyaranlardan önce ve sonra nematositler burada gösterilmiştir. Nematocyst tübül bu görüntüde maruz kalır ve toksin salınımını gösterir. Deniz anemonunun ham ekstraktının elektroforetik profili burada gösterilmiştir.
Deniz anemon ham ekstresi SDS-PAGE% 15 poliakrilamid jel ile analiz edildi ve 10 kilodaltondan 250 kilodalton moleküler ağırlığa kadar protein gösterdi. Burada, şerit 1 protein merdiveni ve şerit 2 deniz anemon zehiridir. Sitolisinler 15 kilodalton ve 20 kilodalton moleküler ağırlık bölgesinde tespit edildi.
Burada koyunlardan elde edilen eritrositlerde hemoliz testi gösterilmektedir. Donma ve çözülme döngülerinden önce ve sırasında ekstraktın hemolitik aktivitesi, son iki döngüde toplam ham ekstrakt proteininin 50 mikrogramı ile% 100 hemolize ulaşılana kadar artmıştır. % 50 koyun eritrositlerini lize etmek için gereken miktar, mililitre başına 11.1 0.3 mikrogramdır.
Fosfolipaz aktivitesi, ham ekstrakt örneğinin uygulandığı agar plakası alanlarında berrak halelerin oluşumu ile tespit edildi. Sonuçlar, 15 mikrogram toplam proteinden fosfolipaz aktivitesinin varlığını göstermektedir. Halenin çapı doza bağımlı bir şekilde artmıştır; yani, ham ekstrakt miktarı artarsa, halenin çapı artmıştır.
Prosedürü denerken, nematokist deşarjını indüklediğinizden, toplam proteini nicelleştirdiğinizden, SDS-PAGE elektroforezi ile ham ekstraktı analiz ettiğinizden, hemolizin% 50'sini üretmek için ham ekstrakt proteininin miktarını hesapladığınızdan ve fosfolipaz testinde farklı miktarlarda protein kullandığınızdan emin olun. Biyoteknoloji ve biyotıpta büyük ilgisi olan polipeptitleri tanımlamak, hatta benzersiz bir molekülün profilini çıkarmak ve karakterize etmek ve daha sonra bir uygulama için laboratuvarda üretmek için ham ekstraktı proteomik teknikle analiz edebiliriz. İnsan obdürat akciğer karsinomu epitel hücrelerinde antitümör aktiviteye sahip performans gösteren bir proteinin dizisinin bir kısmını elde ettik.
Aynı şekilde, biyoteknolojik açıdan ilgi çekici fosfolipazların sırasını da tanımlıyoruz.
