우리는 미국 지질 조사 하 몬 드 베이 생물학 역 그들의 연구 시설 사용 및 미국 어류 및 야생 동물 서비스 및 수 산업의 직원 및 바다 캐나다 바다 lampreys 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구는 웨이 밍 리와 애 리 대 호 어업 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학교 (안녕히 # 03/14-054-00, 02/17-031-00)에 의해 승인 되었습니다.
1. 수집 및 바다 심고의 추출 물 조절
<ol><li>성적으로 화난된 휴런 호수 물 16-18 ° c.에 유지의 250 L와 함께 제공 된 탱크에서 남성 바다 lampreys (15-30 동물)을 성숙 하는 장소</li>
	<li>6 월에서 7 월 각 밤 내내 남성 단련 물을 수집 합니다. 참고: 바다 lampreys 산란 후 자연스럽 게 죽는다. 물고기의 인생에서이 시점에 근접, 신선한 성숙한 남성으로 교체.</li>
	<li>단단한 단계 적 출에 의해 조건된 물을 추출 합니다.<ol>
<li>열에 로드 하기 전에 4 h에 대 한 메탄올에 수 지를 담근 다. 수 지는 열에 로드 한 다음 유기 용 매를 제거 하는 열을 통해 물 10 L 펌프.</li>
		<li>열의 위쪽에 펌핑 시스템을 통해 물고기 잡고 탱크에서 조절된 물을 전달 합니다. 온건 하 게 극 지 고분자 이온 교환 수 지 (예:., Amberlite: XAD 7 HP 수 지), 4의 시리즈에 포함 된 2 kg의 침대를 통과 하는 물 2.5 L 용량 유리 열. 400와 600 mL/6 분 5 l 아세톤의 바로 뒤에 메탄올의 10 l metabolites Elute 사이의 부하 속도 유지 합니다. 주의:이 단계에서는 메탄올과 아세톤 사용합니다. 둘 다는 가연성 및 독성입니다. 참고: 풀링된 잔여-80 ° c 더 처리 될 때까지 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물 (약 10l)로 세척 하 여 농축의 1 주 후 열을 다시 활성화.</li>
	<li>유기 용 매 (물과 메탄올의 혼합물)을 제거 하 고 압력 감소 (아래 300 mbar) 40 ° c.에 5 h와 증발에 의해 추출 물 수확 건조까지-20 ° C에서 48 h에 대 한 동결 건조 기 동결은 여 물 찌 꺼 기를 집중.</li>
</ol>2입니다. 크로마토그래피와 분수 풀의 격리
<ol><li>유리의 열 용 매 (중지)와 젤 30 분 전송에 대 한 모바일 초기 단계에서 실리 카 젤 (230-400 메쉬)을 담가. 모바일 단계를 통해 갈 수 있도록 열의 밸브를 엽니다. 침전 실리 카 젤 침대를 형성을 실리 카 젤 허용.</li>
	<li>철저 하 게 실리 카 젤 (70-230 메쉬) 추출 물을 혼합 하 고 실리 카 젤 침대 위에 액체 착 색 인쇄기 열에 그들을 로드. 95% CHCl3 (클로 프롬)에서 그라데이션으로 elute / MeOH (메탄올) 100 %MeOH, 전체 볼륨에서 2.5 L. Eluent 개별 튜브 (각 10 ml)에 수집 합니다. 주의:이 단계에서 사용 하는 클로 프롬은 유독한 시 약.</li>
	<li>합동은 eluents의 20 조각으로 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석에 의해 안내.<ol>
<li>출발선에 샘플을 적용 하 고 봉인 된 유리에서 개발 용 (선택 극성 CHCl3 의 비율에 의해 메탄올 100-0%에서)에 접시의 출발선을 immersing 하 여 미리 코팅된 실리 카 젤 접시에 TLC 실험을 수행 탱크입니다.</li>
		<li>확인 모든 TLC 명소 보존 인자 (Rf) 0.3에서 배열 하는 용 매 개발의 비율 선택-0.8.</li>
		<li>개발 용 매에는 줄 끝에 도달 하면, 탱크, 접시를 꺼내 고 증발 하는 용 매에 대 일 분을 기다립니다.</li>
		<li>254 nm와 다음 얼룩에 자외선 아래 관광 명소를 먼저 시각화 크로마토그래피 분무기에 의해 5 %anisaldehyde (20 μ)의 산 성 메탄올 솔루션으로 그들을 살포 하 고 3 분 85 ° C에서 난방에 의해 그들. 참고: TLC 판에 다채로운 관광 명소는 분수에서 주요 구성 요소를 나타냅니다.</li>
		<li>별색 및 주요 부품의 Rf 유사성에 따라 20 분수 eluent 결합.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약 30 분 동안 40 ° C에서 감압 (300 mbar의 속성에 따르면)에서 회전 증발 하 여 잔류물에 분수를 집중.</li>
</ol>3. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 향기가 있는 분수/화합물을 식별 하
<ol><li>붕 규 산 유리 모 세관을 당겨 (외경: 1.5 m m, 내경: 0.86 m m, 길이: 100 m m)는 micropipette 히터 수준으로 끌어당기는 65로 설정.</li>
	<li>다이아몬드로 만들어진 유리 커터와 모 세관의 끝에 개통 점수 잘라내어 0.9% 식 염 수에 녹은 0.4 %agar 그것을 채우십시오. 모 세관의 끝에 여는 직경에서 약 10 µ m 이어야 한다.</li>
	<li>채우기 단계 3.1-3.2 및 고체 전극 홀더에서 가져온된 모 세관 전극 중 3 m KCl는 micropipette를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) Ag/AgCl 펠 릿으로 조작. 참고: 모든 공기 방울이 모 세관 또는 전극 홀더를 분리 하십시오.</li>
	<li>가져온된 전극 전극 홀더에 삽입 합니다.</li>
	<li>준비 하는 10-5 M의 100 mL 부피 플라스 크에 이온된 수 (4 ° C에 저장)에서 10-2 M L-아르기닌 재고 솔루션에서 숯 필터링 물에서 L-아르기닌. 10-5 M의 20 mL 전송 유리 유리병에 L-아르기닌.</li>
	<li>농도-응답 곡선에 대 한 유리 튜브에 2.3 단계에서 분수 수영장의 10 희석의 10 mL를 준비 합니다. 매일 실험 전에 신선한 희석을 준비 하 고 하루에 내에서 그들을 사용 하 여. 온도 8 ° c.에 equilibrate를 수 있도록 반복 물 욕조에 L-아르기닌과 분수 풀 희석 작업 솔루션의 유리 튜브를 넣어</li>
	<li>Anesthetize 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (MS222; 100 mg/L)을 심고 하 고 멸 균 주사기와 gallamine triethiodide (0.9% 식 염 수에 몸 무게의 3 mg/kg)의 근육 주사로 무력화. 참고: 마 취의 충분 한 깊이 아니 길 모션, 직 립 자세를 유지 하는 무 능력 및 그것의 구두 디스크를 사용 하 여 탱크의 측면에 없는 흡입을 관찰 하 여 결정 됩니다. 전에, 수술 중 어떤 미생물 오염을 최소화 하기 위해 멸 균 장갑을 착용 하 고 사용 하기 전에 적어도 10 분 동안 이온된 수에 70% 에탄올 (v:)에서 해 부 도구를 만끽해 보세요.</li>
	<li>V 자형 스탠드에 마 취 심고 동양을 건조를 방지 하기 위해 젖은 종이 수건으로 그것을 포장. 참고: 아가미 구멍을 방해 하지 않습니다.</li>
	<li>볼 강에 MS222의 50 mg/L를 포함 하는 화난된 물 재순환의 튜브를 삽입 하 고 흐름 속도 조정할 물을 통해 지속적으로 관개 아가미 아가미 구멍 종료 됩니다 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 메스와 집게를 사용 하 여 [1.25 X 확대 입체 현미경 ( 재료의 표참조)]의 후 각 상피 폭로 후 각 캡슐의 표면에 피부 5mm2 섹션을 제거.</li>
	<li>필터링 된 물 odorant 배달 튜브를 플러시 고는 micromanipulator에 탑재 하는 밸브에 연결 합니다. 하지 odorants를 관리 하는 경우 건조를 방지 하기 위해 후 각 상피에 필터링 된 물을 제공 하는 micromanipulator를 사용 하 여 후 각 상피 캐비티에 odorant 배달 모 세관 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>녹음 및 참조 전극은 micromanipulators에 탑재 합니다. 낮은 외부 피부는 스킨 근처에 참조 전극. 사용 하 여 입체 현미경 (1.25 X), 낮은 기록 전극 간신히 터치 후 각 상피의 표면에.</li>
	<li>필터링 배경 물에서 10-5 M L-아르기닌 솔루션 odorant 배달 튜브의 통풍 관을 전송.</li>
	<li>컴퓨터, 증폭기 (DC 모드로 설정), 필터, 그리고 디지타이저를 켭니다. 4 s 단일 펄스 odorant의 T1, T 4 설정 상자를 선택 하 여 관리 하는 절차를 프로그램 밸브 드라이버 소프트웨어를 사용 하 여 s 및 t 2의 상자에 확인.</li>
	<li>데이터 수집 소프트웨어에서 (참조 테이블의 자료), 고속 오실로스코프 획득 모드 설정, 플레이 아이콘을 클릭 한 다음 트리거 odorant 펄스 밸브 드라이버에서 시작 을 클릭 합니다. 참고: 데이터 수집 소프트웨어 자동으로 20 차동 EOG 응답 진폭을 기록 s (3 4 전에 s odorant 펄스와 13 동안 s s 이후). micromanipulator 기동 기록 전극, 기준 전극, 또는 L-아르기닌 표준에 대 한 최대 응답와 빈 제어 (최소한의 응답 신호 대 잡음 비율을 증가 odorant 배달 튜브의 위치를 사용 하 여 필터링 된 물)입니다. 접지 전극 이동 하면서 GND로 AC-DC 앰프 스위치를 전환 하 여 증폭기.</li>
	<li>빈 컨트롤, L-아르기닌, 그리고 단계에서 3.6 낮은에서 높은 농도의 필터링 된 물 2 분 플 러쉬를 응용 프로그램 간에 준비 odorants 녹음 시작 합니다.</li>
	<li>테스트할 모든 odorants에 대 한 응답을 녹음 후 앰프 접지 하 고 신중 하 게 전극 및 odorant 배달 모 세관 튜브를 철회. MS222의 과다와 함께 마 취 심고 안락사는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 방법, EOG 실험의 종료에 따라 (1 g/L). 참고: 길 운동 및 적어도 5 분 뒤에 두뇌 pithing 하트 비트의 부족을 지적 함으로써 성공적인 안락사를 확인 합니다.</li>
	<li>분석 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 빈 물 제어 보다 큰 응답을 이끌어내는 향기가 있는 분수를 식별 하기 위해 odorants22 의 탐지의 임계값을 결정 합니다. 빈 물 제어 보다 다른 농도 의존 후 각 응답을 이끌어내는 분수 풀 다음 행동 분석 결과 (4 단계)에서 테스트 합니다.</li>
</ol>4. 2-선택 미로 행동 생물 행동 활성 분수/화합물을 식별 하
<ol><li>성적으로 성숙한 여성 바다 심고 미로에서 릴리스 장에 적응 ( 보충 그림 1참조) 5 분에 대 한 미로에서 강 수의 유량 유지 참고: 미로 미로 업스트림 끝에 두 개의 채널로 분리 하는 길이 2.7 m를 측정 하는 분배기와 위험 스런된 바다 급료 나무와 측정 길이 6.5 m, 폭에서 1.2 m에서 건설 된다. 물 미로에 일시적으로 우회입니다. 0.19 m 물 깊이 유지 한다 고 0.07 m/s ± 0.01에서 속도 유지 해야 합니다.</li>
	<li>바다 심고 놓고는 심고 실험에 지출 시간 및 각 포함 강 10 분 물 제어 채널의 누적 금액을 기록. 참고: 바다 심고 실험에 들어가고 적어도 10에 대 한 채널을 제어 하지 못할 경우이 분 동안 s 끝 재판, 비활성 또는 강한 편견의 표시입니다.</li>
	<li>적용 시험 자극 (즉, 10-12 M에 상 상속 페로몬에 50% 메탄올/이온된 수에 녹아 있는) 무작위로 할당 된 실험적인 채널을 차량 (50% 메탄올/이온된 수) 사용 하 여 제어 채널에 연동 5 분 동안 200 mL/min의 일정 한 속도로 펌프. 참고: 전기 olfactogram 녹음 결정 테스트 자극의 감지 임계값 집중 해야 사용 초기 농도 행동 테스트에 대 한.</li>
	<li>테스트 자극 및 추가 10 분에 대 한 차량 적용 하 고 실험에 심고 지출 시간의 누적 금액을 기록 및 제어 채널.</li>
	<li>다음 재판의 시작 하기 전에 10 분 동안 물으로 미로 플러시. 충분 한 테스트 자극 사용할 수 있는 경우 최소 7 lampreys와 4.1-4.4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>각 시험에 대 한 기본 설정22 의 인덱스를 계산 하 고 Wilcoxon 서명 순위 테스트를 사용 하 여 의미를 평가. 참고: 인덱스 중 양수 또는 음수가 될 수 있는 단일 번호를 발생 합니다. 기본 설정의 인덱스의 양수 값 나타냅니다 매력, 반면 기본 설정 표시 반발의 지의 음수 값. 기본 설정의 인덱스는 0에서 크게 다른, 분수 활성으로 간주 됩니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58059/58059eq1v2.jpg"> 여기, Bc = 테스트 심고 odorant 응용 프로그램 전에 제어 채널에 의해 소비 하는 시간 Be = odorant 응용 프로그램 전에 실험 채널에서 보낸 시간 C = odorant 신청 후 제어 채널에 소요 된 시간 및 E = odorant 응용 프로그램 후 실험 채널에서 보낸 시간.</li>
</ol>5. 컬럼에 절연 활성 분수에서 순수한 화합물의
<ol><li>유도 후 각 응답 (3 단계) 분수 풀 2.1-2.4 단계를 반복 하 고 행동 응답 (4 단계)를 유도.</li>
	<li>더 크기 배제 크로마토그래피는 Sephadex LH-20 열을 사용 하 여 함께 화합물에 활성 분수를 정화.<ol>
<li>초기 모바일 단계에 0.5 mL에 샘플 준비 [CHCl3-MeOH (1:1) 또는 MeOH 100%], CHCl3-MeOH (1:1) 열과 후 MeOH (100%)의 열, 해당 열에 로드 및 화합물을 얻을 수 그들을 elute.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 구조 해명 질량 분석 (MS)와 핵 자기 공명 (NMR) 순수한 화합물의
<ol><li>녹이 고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 약 1 μ g/mL의 10 μ 솔루션의 초기 모바일 단계 (보통, 메탄올 물, 1:1, v: v)에서 순화 된 화합물을 희석.<ol>
<li>HPLC 튜브 샘플 솔루션 전송 고 HPLC의 autosampler에 그들을 설정 합니다. 분무 이온화 질량 분석 (ESIMS)에 샘플 (10 μ)을 주사 하십시오와 착 색 인쇄기 질량 분 서 계23을 사용 하 여 고해상도 분무 이온화 질량 분석 (HRESIMS) 스펙트럼 기록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분자 공식 질량 분석기 소프트웨어에서 데이터베이스에 따르면 예측 (참조 테이블의 재료)24.<ol>
<li>삽입 된 샘플의 크로마 열고 컬럼에 피크를 선택 하 여 그것의 질량 스펙트럼을 얻을.</li>
		<li>이온 (m/z) 값 (4 소수)에 원소 구성 도구 모듈에서 측정 된 질량을 입력 합니다. 허용 오차 매개 변수 PPM를 설정 < 5.</li>
		<li>측정된 분자의 요소 구성에 맞게 기호 매개 변수를 조정 합니다. 소프트웨어는 단일 질량 분석 기반 분자 공식의 예측을 생성 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 해산 하기 위해 프로토콜25 에 따르면 deuterated 용 (600 μ, CH3오-d4 또는 DMSO-d6)를 선택 합니다.<ol>
<li>완전히 샘플 0.1에서 약 10 mg/mL 까지의 농도 가진 해결책을 형성을 선택한 deuterated 용 매에 용 해. 1 D (1H, 13C)를 기록 하는 NMR 튜브에 샘플 솔루션을 전송 및 2D NMR [1H-1H 상호 관계 분광학 (아늑한) heteronuclear 단일 양자 일관성 (HSQC) heteronuclear 여러 본드 상관 관계 (HMBC)] 900 MHz NMR 분 광 계26에 스펙트럼.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMR 튜브 회전자 터빈 내부 샘플을 놓습니다. 깊이 게이지를 사용 하 여 되도록 샘플 높이 측정 윈도우 중앙. NMR 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 자석에 샘플을 변경 하려면 해제 단추를 클릭 하십시오. 참고: 가스는 자석의 상단에서 오는 느낌을 자석 위에 손을 잡으십시오. 같은 시간에 휘파람 소리 청취 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 샘플 자석 위에 공기 쿠션에 놓고 NMR 자석으로 강하 하는 샘플을 다시 해제 버튼을 눌러. 참고: 샘플 올바른 위치에 표시를 "클릭" 소리를 들어봅니다.</li>
	<li>새 데이터 집합을 만들고 NMR 악기에서 권장 하는 기본 매개 변수를 로드 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>자동 잠금 프로시저를 호출 하 고 음성 안내 페이지에서 용 매 선택에 "잠금"을 입력 합니다.</li>
		<li>튜닝에 대 한 조작 패널조정 잠금 해제 모델에 버튼, 조작 패널에 커서를 조정 하 고 다시 자석 자물쇠.</li>
		<li>프롬프트 Atma 페이지에 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 튜닝 절차를 조작 패널에서 매개 변수를 조정 합니다. 진행 하는 튜닝 완료 되 면 때까지 기다립니다.</li>
		<li>프롬프트에서 "topshim"를 입력 하 여 자동 메우는 루틴을 시작 합니다. 메우는 진행 완료 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>유형 "rga" 설정 자동 이득 조정, 다음 유형 "d1" 펄스, 다음 유형 "zg" 시작 하는 인수, 고 인수 완료 될 때까지 기다립니다의 간격을 설정 하려면 받고.</li>
		<li>"Ef" 또는 "efp" 데이터를 처리 하 고 자동 단계적으로 조정 "apk" 입력을 입력 합니다. NMR 프로세싱 소프트웨어에 데이터를 처리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>화학 구조를 명료 하 게 NMR 데이터 분석의 해석에 의해.</li>
	<li>13C NMR 스펙트럼에서 탄소 신호를 계산 합니다. 고해상도 질량 분석 (HR-MS)에서 예측된 결과에서 일치 분자 수식을 선택 합니다.</li>
	<li>1H NMR 스펙트럼에서 양성자 신호를 통합 하 고의 탄소와 양성자-기반 HSQC 스펙트럼에서 신호에 연결을 할당 합니다.</li>
	<li>1H-1H 아늑한 상관 관계 및 HMBC 스펙트럼에 따라 탄소 골격의 연결을 지정 합니다.</li>
	<li>가칭 구조 근거27에 따라 화학 구조를 할당 합니다. 화학 구조 데이터베이스에서 임시 구조를 검색 합니다. 참조에서 아날로그와 임시 구조를 비교 합니다.</li>
	<li>핵 Overhauser 효과 분광학 (NOESY) 스펙트럼과 상대 구성을 할당 합니다. 참고: 분석 및 분 광 방법에 표시 하는 상체의 id 속성은 동일, 2'-알코올 및 2'-NH2, 특히 그 어떤 화합물의 절대 구성은 해야로 결정 한 derivatization 반응입니다. Derivatization 반응 후 스펙트럼에 표시 된 차이 대부분 화합물28의 절대 구성의 명확한 임무를 촉진 한다.</li>
</ol>7. EOG 검정 순수 화합물을 확인 하는 향기가 있는 행동 활성화
<ol><li>3.1-3.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>농도-응답 곡선에 대 한 준비에서 10-6 M-10-13 M 50% 메탄올/물-20 ° c에 결정 하는 분자량에 따라 저장에서 10-3 M 페로몬 재고 솔루션의 순수한 화합물의 10 희석의 10 mL 6.2 단계입니다. 온도 8 ° c.에 equilibrate를 수 있도록 반복 물 욕조에 L-아르기닌과 순수한 화합물의 작업 솔루션 유리 튜브를 넣어</li>
	<li>3.7-3.18 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>4.1-4.2 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>임의로 할당 된 실험적인 채널을 5 분 동안 200 mL/min의 일정 비율로 연동 펌프를 사용 하 여 제어 채널에 차량 (50% 메탄올/이온된 수) EOG 감지 임계값 농도에서 순수한 화합물을 적용 합니다.</li>
	<li>4.4-4.6 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

물고기는 화합물의 아직 식별 전체 화학 세계에 살고 있습니다. 생물 검정 기반 분류 특징 masu 연어31,32, 아시아 코끼리 바다 lampreys33, 관찰 등 많은 화학적 상호 작용을 중재 하는 생리 활성 분자를 식별 하는 필수 입증 34,35. 검정 안내 분별 정확 하 게 추적 및 pinpoint 시작에서 생리 활성 화합물 정화 활성 화합물을 추출 하는 효과적인 접근 이다. 이 방법을 사용 하 여, 확인 된 생리 활성 화합물 소설 알려진된 생 합성 경로에서 예상 될 것입니다 독특한 화학 뼈대를 화합물을 밝힐 수 있다.
EOG 녹음은 분수 또는 화합물 후 각 응답을 이끌어내는 결정 실시 합니다. 몇 가지 기술적 고려 사항은 EOG 녹음 상 상속 페로몬에 후 각 응답을 정확 하 게 측정 하는 것이 필수적입니다. 첫째, 기관 동물 관리 및 사용 위원회 승인 절차, 물고기 깊이 3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (MS222)와 취이 고 gallamine triethiodide의 근육 내 주입으로 움직일 수 있습니다. 기록 전극 전기 잡음의 원천이 될 수 있는 아가미와 부족 한 동원 정지 때문에 심장 박동의 모든 움직임을 감지 합니다. 둘째, 후 각 상피 노출 되어야 합니다 즉시 숯 필터링 물에 건조를 방지 하기 위해 절 개 후. 빈 컨트롤 (응답을 최소화 하면서 긍정적인 제어 odorant에 대 한 응답을 최대한 활용할 수 있습니다 odorant 배달 튜브, 전기 접지와는 micromanipulators 기록 및 기준 전극의 위치 조정 필터링 된 물)입니다. 셋째, 후 후 각 상피에 민감한 녹화 위치를 확인, 그것은 중요 한 기록 편차를 최소화 하기 위해 lamellae에 비슷한 위치에서. 비슷한 위치에서 일관 되 게 기록, 탱크와 같은 위치에 물고기, 현미경, odorant 배달 튜브와는 micromanipulators를 들고 V 모양의 플라스틱 스탠드 유지 합니다. 마 취 튜브는 물고기의 볼 구멍에 마 취 유지 되도록 실험 기간 동안 유지 되어야 합니다. 그러나, 볼 구멍 및 마 취의 유량 배치 기록 전극 전기 신호의 이상한 기준의 결과로 물의 움직임을 감지 하는 경우 수정할 수 있습니다.
행동 분석 결과의 디자인 한다 실험 대상의 행동 생태와 관심의 연구 질문에 맞게. 2-선택 미로 행동 분석 향기가 있는 분수의 행동 활성화 또한 인지 확인 하는 데 사용 됩니다. 순화 화합물 총계에서 사용할 수 종종 있기 때문에 미로 때문에 낮은 출력 스트림에 비해 유익한 행동 생물 이다. 우리 가까이에 성숙한 여성 동료를 유치 하 고 산란을 위해 둥지에서 그들을 유지 것으로 예상 하는 성숙한 남성에 의해 발표 하는 상 상속의 섹스 페로몬의 소스 근처 선호 평가에 관심이 있었다. 행동 분석 결과 ovulated 여성 사이 선택은 성숙한 남성의 odorants의 자연 상태를 복제 하도록 설계 되었습니다. 따라서, 그것은 우리의 행동 실험에서 실험 대상으로 ovulated 여성 테스트 관련. 그러나, 테스트 odorant 따라 다른 시험 과목 (즉, 다른 생활 단계 또는 남성) 더 적절 한 수 있습니다. 2-선택 미로의 크기에 유사 테스트 주제와 페로몬 (즉, 소스 대 긴 거리 근처)의 예측된 활성 공간 크기에 따라 필요할 수 있습니다36. 마찬가지로, 행동 응답 농도 의존 많습니다. 상 상속 페로몬 검출 임계값 농도 EOG 결정에 적용 될 때 행동 반응 관찰 되지 않는, 하는 경우는 페로몬의 농도 조정 한다. 그러나, 그 화합물은 강력한 odorant, 경우에 그것은 유도 하지 않을 수도 반드시 중요 한 행동 선호를 주목 한다. 궁극적으로, 미로에서 관찰 된 행동 응답 상 상속 페로몬의 기능 확인을 합성 화합물과 필드 설정에서 확인 되어야 합니다.
생물 검정 기반 분류의 한 가지 주요 한계 개별 분수 또는 검정 (EOG 또는 행동)에서 화합물의 순차적 테스트입니다. 이전 작품 섹스 페로몬 일반적으로 혼합물의 특정 비율37 에 여러 구성 요소 기능을 구성 요소38 로 독립적으로 또는 synergistically로39 에 적절 한 응답을 유도 하는 것을 혼합 곤충을 보이고 있다 conspecifics입니다. 조합 테스트 확인 하는 bioactivity를 필요로 하기 때문에 따라서, 특정 혼합물에 존재 하는 경우 활성 화합물만 검정 기반 분류와 간과 수 있습니다. 다른 검정 안내 분별의 포함: 1) 시작 물자의 대량 구조 분석, EOG, 및 행동 분석; 대 한 충분 한 금액을가지고 해야 하는 2) 과정은 때문에 반복적인 정화 과정; 소요 그리고 3) 소문자 또는 불안정 한 화합물 검출 될 가능성이 있습니다. 미래에 검정 기반 분류의 기술적 한계 들을 극복 하는 것은 검정 기반 분류 및 대사체학의 교배 접근이 필요할 수 있습니다. 교배 시킨된 방식을 사용 하 여, 첨가제 또는 시너지 페로몬 효과 분별13 될 가능성이 있으며 불안정 한 화합물 감지가 더 높습니다.
설명된 검정 기반 분류 프로세스는 바다 심고 페로몬의 식별을 위해 특별히 설계 되었습니다. 그러나, 화학 커뮤니케이션은 동물의 왕국1 에서 유비 쿼터 스 및이 프로세스를 쉽게 taxa의 광범위 한 배열에 페로몬의 특성을 적응 시킬 수 있다. 페로몬 식별 및 특성화 페로몬 행동 응답 침략 적인 종의 통제 또는 imperiled 원시 종 복원 결과 변조에 적용 될 수 있기 때문에 중요 하다.

페로몬은 특정 화학 신호 음식 소스를 찾는, 포식 자 감지 conspecifics1의 사회적 상호 작용을 중재에 그들을 원조 하는 개인에 의해 발표. 곤충에 페로몬 통신이 되었습니다 잘 공부2; 그러나, 화학 물질 식별 및 수생 척추 동물 페로몬의 생물 학적 기능 하지 되었습니다 공부 했다으로 광범위 하 게. 정체성의 지식과 발표 페로몬의 기능 위협된 종3,4 또는 제어 해충 종5,6의 복구를 촉진 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 이러한 기술의 응용 프로그램 격리 및 생리 활성 페로몬 구성 요소 특성화를 필요로합니다.
페로몬 식별 천연 제품 화학의 지점 이다. 페로몬 연구에 진행 부분적으로 페로몬 분자 자체의 특성으로 인해 제한 되었습니다. 페로몬은 종종 불안정 하 고 소량, 출시 그리고 몇 가지 샘플링 기술을 분 양의 휘발성7,8 또는 수용 성 화합물9를 감지 하 존재. 페로몬을 식별 하는 방법 1) 알려진된 화합물, 2) 대사체학, 및 3) 검정 안내 분별의 대상된 심사를 포함 합니다. 알려진된 화합물의 대상된 심사 페로몬 기능을 가상 하는 생리 적 프로세스의 상용 대사 부산물을 테스트 합니다. 연구원은 알려진 및 사용 가능한 화합물 테스트할 수 있기 때문에이 접근은 제한 하 고 있다. 그러나, 그것은 결과가 금붕어에 성 호르몬의 성공적인 식별 기능을 페로몬10,,1112. 대사체학은 생물 학적 시스템13내에서 잠재적인 작은 분자 대사 제품을 구별 하는 두 번째 페로몬 식별 접근 이다. 두 그룹 (즉,는 활성 및 비활성 추출 물)의 신진 대사 프로필의 비교 수는 잠재적인 신진 대사 프로필의 식별 하는 대사 산물은 정화에서 구조는 해명, 그리고 bioactivity는 확인 된14. 특정 혼합물의 복잡 한 공식의 첨가제 또는 시너지 효과 대사체학 metabolites 분수13의 시리즈로이 아닌 함께 간주 됩니다 때문에 발견 될 더 높습니다. 그러나, 대사체학의 구현 결과 데이터 소설 구조의 설명을 촉진 하지 않습니다 때문에 합성 참조의 가용성에 의존 합니다.
검정 안내 분별은 두 분야에 걸쳐 통합, 반복 접근: 화학 및 생물학. 이 방법은 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하 여 격리 및 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드. 원유 추출 화학 속성 (즉, 분자 크기, 극성, 등)에 의해 분류 한 이며 전기-olfactogram (EOG) 녹음 및는 생물 검정에 테스트. 생리 활성 구성 요소 분류 및 EOGs 생물 검정의이 단계를 반복 하 여 밖으로 상영 됩니다. 순수한 활성 화합물의 구조는 분자량 및 합성 화합물의 템플릿을 생산 구조 정보 제공 spectrometric 및 분 광 방법으로 해명. 생물 검정 기반 분류 다양 한 대사와 생 합성 경로에서 예측 될 것 하지 않은 독특한 화학 뼈대와 잠재적으로 소설 페로몬을 얻을 수 있습니다.
여기, 우리는 분리 남성 바다 심고 섹스 페로몬 화합물의 bioactivity 특성을 사용 하는 검정 기반 분류 프로토콜을 설명 합니다. 바다 심고 (Petromyzon 리누스)이이 물고기는 그들의 anadromous 생활사는 3 단계로 구성 된 중재 화학 신호의 후 각 탐지에 크게 의존 하기 때문에 페로몬 커뮤니케이션을 공부 하는 이상적인 척추 모델은: 애벌레, 청소년, 그리고 성인입니다. 바다 심고 애벌레 민물 스트림 앙금으로 뚫으, 과감 한 변 태를 받아야 하 고 호수 또는 바다 어디 그들은 큰 호스트 물고기 parasitize 이주 청소년으로 변환. 호스트 물고기에서 분리 후 성인 마이그레이션할 다시 산란 스트림, 스트림 상주 애벌레15,,1617,18,19 발표 철새 페로몬에 의해 유도 . 성숙한 남성 산란 지상에 승천, 동료를 유치, 약 일주일 동안 간헐적으로 산란 다음 죽을15,20을 다 성분 섹스 페로몬을 릴리스 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 Laurentian 오대호21에서 침략 적 바다 lampreys 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 중요 하다.

<table><tbody><tr><td>Premium standard wall borosilicate capillaries with filament&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)</td></tr><tr><td>Pipette puller instrument</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>pulls electrodes for EOGs</td></tr><tr><td>Diamond-tipped glass cutter</td><td>Generic</td><td></td><td>cut tip of electrodes for EOG</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>odorant delivery tube for EOG</td></tr><tr><td>Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>recording electrode holder</td></tr><tr><td>Reference electrode holder E Series with handle with&amp;nbsp; Ag/AgCl pellet&amp;nbsp; for glass capillary OD 1.5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>reference electrode holder</td></tr><tr><td>1 mm pin</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>to bridge reference and recording electrode holders</td></tr><tr><td>2 mm pin</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>to bridge reference and recording electrode holders</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>molten agar to fill electrodes</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl to fill electrodes and electrode holders</td></tr><tr><td>Micropipette microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>to fill electrodes and electrode holders</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>positive control odorant for EOG</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>holds odorants for EOG</td></tr><tr><td>3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaine1G</td><td>EOG anesthetic</td></tr><tr><td>Gallamine triethiodide</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG paralytic</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>to administer paralytic</td></tr><tr><td>Subcutaneous needle 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>to administer paralytic</td></tr><tr><td>Roller clamp</td><td>World Precision Instruments</td><td>14043-20</td><td>adjust flow rate of anesthic into lamprey&#039;s mouth</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>for preparation of 0.9% saline</td></tr><tr><td>V-shaped plastic stand as specimen stage</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>holds lamprey during EOG</td></tr><tr><td>Plastic trough</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>holds V-shaped plastic stand during EOG</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>for EOG dissection</td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>for EOG dissection</td></tr><tr><td>Straight ultra fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps</td></tr><tr><td>Curved ultra fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-42</td><td>for EOG dissection, Moria MC40B</td></tr><tr><td>Straight pring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>for EOG dissection</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>for EOG dissection</td></tr><tr><td>Illuminator light</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>for EOG dissection</td></tr><tr><td>Plastic tubing</td><td>Generic</td><td></td><td>to connect re-circulating EOG setup and water baths</td></tr><tr><td>Odorant delivery tubing</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>In line filter and gasket set</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>to position electrodes and odorant delivery capillary tube</td></tr><tr><td>Magnetic holding devices</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Valve driver</td><td>Arduino</td><td>custom made</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Electromagnetic valve</td><td>Lee Company</td><td>LFAA1201618H</td><td>valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>NeuroLog AC/DC amplifier</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>to increase the amplitude of the elictrical signal</td></tr><tr><td>NeuroLog DC pre-amplifier with headstage</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>to increase the amplitude of the elictrical signal</td></tr><tr><td>Low-pass 60 Hz filter</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope version 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>Electromagnetic noise shielding</td></tr><tr><td>Two-choice maze</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner</td></tr><tr><td>Trash pump</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>fills maze with water from nearby river</td></tr><tr><td>Peristaltic pump with tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>to adminster odorants in maze</td></tr><tr><td>Inverter Generator</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>powers perstaltic pump</td></tr><tr><td>Release cage</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>used to acclimate lamprey in the maze</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Generic</td><td></td><td>used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers</td></tr><tr><td>Buckets (5 gallon)</td><td>Generic</td><td></td><td>to mix odorants</td></tr><tr><td>Flow meter</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>to measure discharge</td></tr><tr><td>XAD 7 HP resin</td><td>Dow chemical</td><td>37380-43-1</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Freeze dryer</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Concentrator</td><td>for extraction of conditioned water</td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma</td><td>CX1050</td><td>for isolation of fraction pools</td></tr><tr><td>Silica gel 70-230 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>for isolation of fraction pools</td></tr><tr><td>Silica gel 230-400 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>for isolation of fraction pools</td></tr><tr><td>Pre-coated silica gel TLC plates</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>for isolation of fraction pools</td></tr><tr><td>anisaldehyde</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>for isolation of fraction pools</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>for isolation of fraction pools</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP resin</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4, 2.5L capacity glass columns</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>for structure elucidation</td></tr><tr><td>Binary HPLC pump</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>for isolation of fraction pools/compounds</td></tr><tr><td>Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>for structure elucidation</td></tr><tr><td>Rotovap drying system</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>for extraction of conditioned water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UV lamp (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>for thin layer chromatography&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

the identification of sea lamprey pheromones using bioassay-guided fractionation

검정 안내 분별 분리와 활성 페로몬 화합물의 식별 가이드 생리 및 행동 생물 검정의 결과 사용 하는 반복적인 접근 방식을입니다. 이 방법은 다양 한 동물 종에에서 페로몬으로 그 기능 화학 신호의 성공적인 특성에 결과 있다. 바다 lampreys 행동 또는 생리 적인 응답을 중재 하는 페로몬을 감지 하는 후각이에 의존 합니다. 우리 상 상속 페로몬의 기능을 멋 부리 다 하 고 절연 및 활성 페로몬 구성 요소 식별 가이드 물고기 생물학의이 지식을 사용 합니다. 크로마토그래피는 추출, 집중, 바른된 물에서 화합물을 분리 하는 데 사용 됩니다. 전기-olfactogram (EOG) 녹음 어떤 분수 유도 후 각 응답을 결정 하기 위해 수행 됩니다. 2 선택 미로 행동 분석 다음 경우 향기가 있는 분수의 또한 행동 활성화 되며 특혜를 유도 결정 하는 데 사용 됩니다. Spectrometric 및 광 메서드는 분자량 및 구조 설명 지원 구조 정보를 제공 합니다. 순수한 화합물의 bioactivity EOG 및 행동 분석 실험으로 확인 된다. 미로에서 관찰 된 행동 응답 궁극적으로 자연 스트림 환경에서 그들의 기능을 확인 하는 필드에에서 확인 되어야 합니다. 이러한 생물 검정 1) 분류 과정을 안내 하 고 2) 확인을 이중 역할 추가 격리 된 구성 요소 bioactivity를 정의 하 고. 여기, 우리는 검정 기반 분류 방식의 유틸리티를 예증 해 심고 페로몬 식별의 대표적인 결과 보고 합니다. 식별 해 심고 페로몬의 페로몬 통신 시스템의 변조 침략 바다 심고 Laurentian 오대호에서 제어 하는 것으로 간주 하는 옵션 중 하나입니다 있기 때문에 특히 중요 하다. 이 메서드는 taxa의 광범위 한 배열에서 화학 커뮤니케이션 특성 및 waterborne 화학 생태학에 쉽게 적응 될 수 있다.

검정 안내 분별의 프로토콜에서 설명 하는 단계를 요약 하는 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜 분리 구조, 후 각 힘 및 5 putative 바다 심고 페로몬 (그림 2)의 행동 활동을 특성화 하는 단계를 포함 한다. 대량 spectrometric 및 NMR 데이터 (그림 3 및 그림 4)를 사용 하 여 petromyzene A-B 및 petromyzone A-C의 구조는 성숙한 남성 바다 lampreys22,29로 조절 하는 물에서 해명 했다.
EOG 녹음 (그림 5)에서 우리의 대표적인 데이터 petromyzene A-B와 A C petromyzone 했다 성인 바다 심고 후 각 상피를 자극 하 고 탐지 (그림 6)의 낮은 임계값을 했다 모든 강력한 odorants 설명 . 특히 EOG 녹음 안정적인 odorant 위한 좋은 신호 대 잡음 비율 귀착되 기 위하여 자극 전달 튜브를 기준으로 후 각 상피의 표면에 기록 전극의 적절 한 배치 필요 응답 녹음 ( 그림 5B). 다음에이 중요 한 단계 높은 소음 사이 odorant에 의해 유도 된 신호를 식별 하는 것은 어려울 것 이다. EOG 추적의 하향 편향 odorant 노출 후 부정적인 가능성은. 좋은 EOG 신호는 기준선에 복구 다음 빠르고 날카로운 반응의 결과로 odorant 관리를 표시 해야 합니다. 상 상속 페로몬에 후 각 응답 했다 또한 표준화 10-5 의 응답에 M L-아르기닌, 바다 심고, 기록의 무결성을 보장 하기 위해 실험을 통해 테스트에서 긍정적인 제어 odorant 유지 되었다.
두 선택 미로 행동 분석 (그림 7A), 여성 바다 lampreys ovulated petromyzone A, petromyzene A 및 B, petromyzene에 매력을 느끼게 되었다 그리고 petromyzone C. Ovulated 여성 petromyzone B;에서 있었지만 등장에서 있었지만 그러나, 행동 반응은 하지 중요 한 (그림 7B). 큰 샘플 크기 petromyzone b.의 한정 된 수량으로 인해 불가능 했다 제대로 odorant에 행동 반응 평가, 제어 및 각 심고의 실험적인 채널에 대 한 전처리 바이어스를 기록 하는 데 중요 하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig1.jpg"> 그림 1: 페로몬의 생물 검정 안내 분별의 순서도. 이 그림은 그림 2 리, 부친에 리에서에서 적응30. 상자는 타원형에 표시 된 기술에서 결과 화학 제품을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig2.jpg"> 그림 2: petromyzene A-B 및 petromyzone A.의 화학 구조 이 수치는 리 외 에 그림 1에서 수정 22 , 29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig3.jpg"> 그림 3: 1D NMR 스펙트럼. Petromyzene a: (A) 1H NMR (900mhz) 스펙트럼 및 (B) 13C NMR (225 MHz) 스펙트럼의 1d NMR 스펙트럼. 이 수치는 리 외 에 지원 정보에서 29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig4.jpg"> 그림 4: 2D NMR 스펙트럼. Petromyzene a: (A) HSQC 스펙트럼의 2 차원 NMR 스펙트럼, (B) 1H-1H COSY 스펙트럼, (C)는 HMBC 스펙트럼, 및 (D)는 NOESY 스펙트럼. 이 수치는 리 외 에 지원 정보에서 29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig5.jpg"> 그림 5: 전기-olfactogram (EOG) 준비 및 대표 추적 녹음 기록. (A) 이것이 기록 전극, 기준 전극, odorant 배달 튜브와 마 취과 산소 물 노출된 바다 심고 후 각 상피를 보여주는 EOG 준비. (B)이이 패널 (위) 좋은 또는 나쁜 (아래) 신호 대 잡음 비율을 보여주는 대표적인 추적 녹음 표시 됩니다. 좋은 신호 대 잡음 비율 안정적인 odorant 응답 녹음을 위해 필요 하다. EOG 추적의 하향 편향 odorant 노출 후 부정적인 가능성은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig6.jpg"> 그림 6: 전기-olfactogram (EOG) 농도 응답 곡선의 세미 로그 줄거리. Petromyzone A-C와 A와 B petromyzene 성인 바다 심고 후 각 상피에 물질로 되었고 낮은 검출 임계값을 했다. 데이터 비 정규화 EOG 진폭 ± S.E.M.로 표시 됩니다. 샘플 크기는 다음과 같이 했다: petromyzone A, petromyzene A, 및 petromyzene B (n = 7), petromyzone B와 petromyzone C (n = 5). 삽입 EOG 응답 보여주는 응답 임계값 농도의 확장 된 보기입니다. 이 그림 리 외 에 그림 3에서 수정 되었습니다. 22 및 그림 4 리 외. 29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58059/58059fig7.jpg"> 그림 7: 회로도 및 odorants에 여성 바다 lampreys ovulated의 행동 답변을 평가 하는 데 사용 하는 2-선택 미로의 결과. (A) 화살표 (0.07 m s-1 ± 0.01) 물 흐름의 방향을 나타냅니다. 동그라미는 odorant 관리 지점을 나타냅니다. 작은 파선 미로의 굴레에 바다 심고의 움직임을 제한 하는 데 사용 하는 좋은 메쉬를 나타냅니다. 큰 파선 보드 물 난 기류를 감소 하는 데 사용 하는 흐름을 나타냅니다. 회색 사각형 릴리스 케이지를 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 m. 이 그림은 그림 s 1에서 리 외. 29. (B) 여성 petromyzone A, petromyzene A 및 B. petromyzene에 매력을 느끼게 되었다 시간에 심고 각 채널 전에 미로의 odorant 노출 (10-12 M)는 odorant 응답 그것의 행동을 평가 하기 위해 기본 설정의 인덱스를 계산 하는 데 사용 되었다 후에 보냈다. 기본 설정의 인덱스의 양수 값 매력을 나타냅니다. 샘플 크기를 n, 괄호, 밖에 서 보고 되 고 괄호에 번호 컨트롤에 비해 실험 채널에 더 많은 시간을 소비 하는 실험에서 암컷의 수를 나타냅니다. ± S.E.M.를 의미 하는 대로 데이터 표시 됩니다 (* p < 0.05; Wilcoxon 서명 순위 테스트) odorant 노출 전후 행동 선호를 비교 합니다. 이 그림은 리 외. 그림 4에서 수정 된 22 과 그림 5 리 외. 29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/58059fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1: 미로의 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58059/Supplemental_file_maze.tif">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

the-identification-sea-lamprey-pheromones-using-bioassay-guided

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.9K 조회수.  Michigan State University. 여기, 선물이 분리 하 고 특성 구조, 후 각 힘, 및 바다 lampreys의 상 상속 페로몬 화합물의 행동 응답 프로토콜.

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A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

This bioassay employs a model predatory fish to assess the presence of feeding-deterrent metabolites from organic extracts of the tissues of marine organisms at natural concentrations using a nutritionally comparable food matrix.

물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

연구

환경과학

An Ultra-clean Multilayer Apparatus for Collecting Size Fractionated Marine Plankton and Suspended Particles

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those of suspended/sinking particles. Here, we present an all plastic (Polypropylene and Polycarbonate), multi-layer filtration system for collection of suspended particulate matter (SPM) at sea. This ultra-clean sampling device has been designed and developed specifically for trace element studies. Meticulous selection of all non-metallic materials and utilization of an in-line flow-through procedure minimizes any possible metal contamination during sampling. This system has been successfully tested and tweaked for determining trace metals (e.g., Fe, Al, Mn, Cd, Cu, Ni) on particles of varying size in coastal and open ocean waters. Results from the South China Sea at the South East Asia Time-Series (SEATS) station indicate that diurnal variations and spatial distribution of plankton in the euphotic zone can be easily resolved and recognized. Chemical analysis of size-fractionated particles in surface waters of the Taiwan Strait suggests that the larger particles (&#62;153 &#181;m) were mostly biologically derived, while the smaller particles (10 - 63 &#181;m) were mostly composed of inorganic matter. Apart from Cd, the concentrations of metals (Fe, Al, Mn, Cu, Ni) decreased with increasing size.

Plankton and suspended particles play a major role in the biogeochemical cycles in the ocean. Here, we provide an ultra-clean, low stress method for the collection of various sizes of particles and plankton at sea with the capability of handling large volumes of seawater.

크기 분류 한 해양 플랑크톤과 중단된 한 입자를 수집 하기 위해 매우 깨끗 한 다층 기구

The distributions of many trace elements in the ocean are strongly associated with the growth, death, and re-mineralization of marine plankton and those ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

화학

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

생화학

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

아르테미아 살리나 L을 사용한 치사율 생물학적 분석법

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

<meta charset="utf8"></head><body>예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬 반응의 추출 및 정량화

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 수컷 예쁜꼬마선 충 행동에 대한 휘발성 성 페로몬 영향 조사

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

요약

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물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

크기 분류 한 해양 플랑크톤과 중단된 한 입자를 수집 하기 위해 매우 깨끗 한 다층 기구

화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

아르테미아 살리나 L을 사용한 치사율 생물학적 분석법

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)